相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年7月25日提交的美國申請(qǐng)no.14/341，024，biomarkersforassessmentofpreeclampsia的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。

本文中的一些實(shí)施方案涉及胎兒/母體健康篩選工具的領(lǐng)域，并且更具體地涉及用于評(píng)估先兆子癇的生物標(biāo)志物。

背景技術(shù)：

先兆子癇是妊娠特有的可能危及生命的并發(fā)癥，且其在所有妊娠中的高達(dá)7％中發(fā)生。包括先兆子癇在內(nèi)的高血壓疾病是全世界產(chǎn)婦死亡率的第二大原因，并且造成所有母體死亡的10％至25％。不幸的是，先兆子癇的臨床表現(xiàn)可能在疾病的晚期出現(xiàn)，并且可與不利的母體和新生兒結(jié)局相關(guān)。用于篩選、診斷和監(jiān)測(特別是關(guān)于重度先兆子癇)的穩(wěn)健生物標(biāo)志物是適當(dāng)控制先兆子癇和減輕不良結(jié)局所必需的。在發(fā)展中國家中尤其如此，發(fā)展中國家的疾病負(fù)擔(dān)最大，而且由于晚期出現(xiàn)，醫(yī)療干預(yù)往往無效。此外，先兆子癇的發(fā)病率自1990年以來一直在提高，這可能與肥胖的增多直接相關(guān)。迫切需要早期的且穩(wěn)健的診斷測試以便為專業(yè)醫(yī)療設(shè)施和先兆子癇的控制提供適當(dāng)?shù)暮Y選分類(triage)。

附圖說明

通過以下結(jié)合附圖的詳細(xì)描述將容易理解一些實(shí)施方案。在附圖的圖中通過示例而不是限制的方式舉例說明了一些實(shí)施方案。

圖ia-id是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出以下的表格：依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期(trimester)的縱向隊(duì)列中g(shù)lyfn血清生物標(biāo)志物濃度(圖1a)、依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期的縱向隊(duì)列中總纖連蛋白血清生物標(biāo)志物濃度(圖1b)、所有隊(duì)列中依據(jù)周和先兆子癇狀態(tài)的glyfn濃度的平均每周變化(圖1c)、以及在所有隊(duì)列中依據(jù)周和妊娠三期的總血清纖連蛋白濃度的平均每周變化(圖1d)；

圖2是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和隊(duì)列的母體特征的表格；

圖3是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案例示在妊娠早期(1sttrimester)、妊娠中期(2ndtrimester)和妊娠晚期(3rdtrimester)患有先兆子癇的患者中g(shù)lyfn水平顯著更高的圖，其中在妊娠早期、妊娠中期和妊娠晚期在來自45位血壓正常對(duì)照對(duì)象(圓形和實(shí)線)和62位先兆子癇對(duì)象(加號(hào)和虛線)的血清中測量glyfn水平；

圖4a和4b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出了依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期的縱向隊(duì)列中血清生物標(biāo)志物濃度的表格(圖4a)、以及在所有隊(duì)列中在整個(gè)妊娠期的glyfn濃度的圖(圖4b)；

圖5a和5b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出在血壓正常隊(duì)列和臨床先兆子癇隊(duì)列中的血清生物標(biāo)志物濃度的表格(圖5a)、以及在血壓正常對(duì)照和臨床先兆子癇患者中妊娠中期和妊娠晚期glyfn濃度的圖(圖5b)；

圖6a和6b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出依據(jù)周和先兆子癇狀態(tài)的glyfn濃度的平均每周變化的表格(圖6a)、以及示出所有隊(duì)列中生物標(biāo)志物的妊娠晚期先兆子癇分類性能的接受者操作特征曲線(圖6b)；

圖7是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出在所有隊(duì)列內(nèi)生物標(biāo)志物的妊娠晚期先兆子癇分類性能的表格；

圖8是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出用于在不同患病率估計(jì)下預(yù)測先兆子癇的glyfnpoc值的表格；

圖9是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出血壓正常和臨床先兆子癇中妊娠晚期glyfn水平與臨床特征和結(jié)局的關(guān)系的表格；以及

圖10a和10b例示可根據(jù)本文中公開的多個(gè)實(shí)施方案使用的側(cè)向流免疫測定(圖10a)和側(cè)向流測試裝置(圖10b)的一個(gè)實(shí)例的示意圖。

具體實(shí)施方式

在以下的詳細(xì)描述中，將參考構(gòu)成本文一部分的附圖，并且在其中通過舉例說明的方式示出了可以實(shí)施的一些實(shí)施方案。應(yīng)理解，可利用另一些實(shí)施方案，并且可在不脫離范圍的情況下做出結(jié)構(gòu)或邏輯改變。因此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)被視為具有限制意義，并且一些實(shí)施方案的范圍由所附權(quán)利要求及其等價(jià)形式限定。

可以以有助于理解一些實(shí)施方案的方式將多個(gè)操作依次描述為多個(gè)的離散的操作；但是，描述的順序不應(yīng)被解釋為意指這些操作是依賴順序的。

描述可使用基于透視的描述，例如上/下、后/前和頂/底。這樣的描述僅僅用于方便討論并且不意在限制所公開的實(shí)施方案的應(yīng)用。

可使用術(shù)語“偶聯(lián)”和“連接”以及其派生詞。應(yīng)理解，這些術(shù)語并不旨在作為彼此的同義詞。相反，在一些特別的實(shí)施方案中，“連接”可用于指示兩個(gè)或更多個(gè)要素彼此直接物理或電接觸?！芭悸?lián)”可指兩個(gè)或更多個(gè)要素直接物理或電接觸。然而，“偶聯(lián)”也可意指兩個(gè)或更多個(gè)要素彼此不直接接觸，但是仍然彼此協(xié)作或相互作用。

出于描述的目的，“a/b”形式或“a和/或b”形式的短語意指(a)、(b)或(a和b)。出于描述的目的，“a、b和c中的至少一個(gè)”形式的短語意指(a)、(b)、(c)、(a和b)、(a和c)、(b和c)或(a、b和c)。出于描述的目的，“(a)b”形式的短語意指(b)或(ab)，即，a是任選的要素。

描述可使用術(shù)語“實(shí)施方案”或“一些實(shí)施方案”，其各自可指相同或不同的實(shí)施方案中的一個(gè)或更多個(gè)。此外，關(guān)于實(shí)施方案使用的術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”等是同義的。

本文中在多個(gè)實(shí)施方案中公開了用于在對(duì)象中評(píng)估先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測、診斷和監(jiān)測先兆子癇的方法。本文中公開的方法也可用于區(qū)分輕度先兆子癇和重度先兆子癇。還公開了預(yù)測或診斷低出生體重和/或hellp綜合征，涉及溶血、肝酶升高和低血小板計(jì)數(shù)的先兆子癇之危及生命的并發(fā)癥的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可包括測量來自對(duì)象的生物樣品(例如血清樣品)中的糖基化纖連蛋白(glyfn)的水平。盡管本文中描述了血清樣品，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，所公開的方法可適于與其他生物樣品(例如全血、血漿、尿、唾液或其他體液)一起使用。

纖連蛋白(fibronectin，fn)是具有廣譜功能的豐富蛋白質(zhì)。人纖連蛋白的示例性登錄號(hào)是genbank登錄no.p02751。作為選擇性剪接和蛋白水解的結(jié)果，fn基因編碼序列和長度不同的一些同種型。血清或血漿中存在的大多數(shù)fn稱為血漿fn(pfn)，其由肝細(xì)胞以可溶性形式產(chǎn)生和分泌，而所謂的細(xì)胞fn(cfn)由許多細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。pfn和cfn之間的主要區(qū)別是存在選擇性剪接的額外結(jié)構(gòu)域a和b(eca/b)，其在pfn中不存在但在cfn中可變地存在。越來越清楚的是，在循環(huán)中，尤其是在多種病理?xiàng)l件下(包括糖尿病和炎癥)中也發(fā)現(xiàn)cfn。pfn和cfn二者均表現(xiàn)出復(fù)雜的糖基化模式，并且母體血清中fn(fn-sna)的特異性糖基化形式的水平升高已示出預(yù)示妊娠糖尿病。然而，在本公開內(nèi)容之前，并不知道升高的glyfn與先兆子癇相關(guān)。

如本文中所示，盡管glyfn可用于評(píng)估先兆子癇及相關(guān)病癥，但是總纖連蛋白水平與先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)。圖1a-1d是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出以下的表格：依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期的縱向隊(duì)列中g(shù)lyfn血清生物標(biāo)志物濃度(圖1a)、依據(jù)先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期的縱向隊(duì)列中的總纖連蛋白血清生物標(biāo)志物濃度(圖1b)、在所有隊(duì)列中依據(jù)周和先兆子癇狀態(tài)的glyfn濃度的平均每周變化(圖1c)，以及在所有隊(duì)列中依據(jù)周和先兆子癇狀態(tài)的總血清纖連蛋白濃度的平均每周變化(圖1d)。因此，總纖連蛋白水平(圖1b)和總纖維蛋白水平的變化率(圖1d)無法預(yù)測先兆子癇狀態(tài)。相比之下，如下文中更詳細(xì)討論的，glyfn水平(圖1a)和妊娠glyfn水平的每周的變化速率(圖1c)二者都可用于評(píng)估、預(yù)測和/或診斷先兆子癇及相關(guān)病癥。

在多個(gè)實(shí)施方案中，所公開的方法包括從妊娠對(duì)象獲得生物樣品，例如血清樣品、全血樣品、血漿樣品或唾液樣品。然后使用幾種可能的方法中的任一種來確定樣品中糖基化纖連蛋白(glyfn)的水平，并將樣品中的glyfn水平與對(duì)照值(例如代表正常見于不會(huì)繼續(xù)發(fā)生先兆子癇的對(duì)象中g(shù)lyfn水平的參考值)進(jìn)行比較。在多個(gè)實(shí)施方案中，如果確定樣品中g(shù)lyfn的水平與對(duì)照值相似(例如，當(dāng)樣品glyfn值和參考值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異時(shí)，或當(dāng)確定樣品glyfn值在定義為“正?！钡姆秶鷥?nèi)時(shí))，則所述對(duì)象可被歸類為未患有先兆子癇或處于發(fā)生先兆子癇的低風(fēng)險(xiǎn)。然而，當(dāng)確定樣品glyfn值相對(duì)于對(duì)照值升高時(shí)(例如，相對(duì)于對(duì)照值升高到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度或在預(yù)定的“正?！敝捣秶?，則可以確定對(duì)象患有先兆子癇或處于發(fā)生先兆子癇的高風(fēng)險(xiǎn)中。

更具體地，在一些實(shí)施方案中，公開了用于在妊娠早期確定對(duì)象中先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法。在這些實(shí)施方案中，對(duì)照值可以是代表來自不會(huì)繼續(xù)發(fā)生先兆子癇的妊娠早期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn水平的參考值(或“正?！敝档姆秶?。在一些實(shí)施方案中，樣品中g(shù)lyfn的水平相對(duì)于妊娠早期對(duì)照值的“升高”可以是至少15％升高，例如20％升高、30％升高、40％升高、50％升高、60％升高、70％升高、80％升高、90％升高、100％升高或甚至更高，例如125％升高或150％升高。例如，來自妊娠早期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn的正常(非先兆子癇)范圍可以是10至150μg/ml，glyfn的異常(例如先兆子癇)水平可以大于150μg/ml，例如約175μg/ml或更高。

在另一些實(shí)施方案中，所述方法可以是在妊娠中期確定對(duì)象中先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法。在這些實(shí)施方案中，對(duì)照值可以是代表來自不會(huì)繼續(xù)發(fā)生先兆子癇的妊娠中期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn水平的參考值(或“正常”參考值的范圍)。在一些實(shí)施方案中，樣品中g(shù)lyfn水平相對(duì)于妊娠中期對(duì)照值的“升高”可以是至少15％升高，例如20％升高、30％升高、40％升高、50％升高、60％升高、70％升高、80％升高、90％升高、100％升高或甚至更高，例如125％升高或150％升高。例如，來自妊娠中期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn的正常(非先兆子癇)范圍可以是10至150μg/ml，并且glyfn的異常(例如先兆子癇)水平可以大于150μg/ml，例如約175μg/ml或更高。

在另一些其他實(shí)施方案中，所述方法可以是在妊娠晚期確定對(duì)象中先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法。在這些實(shí)施方案中，對(duì)照值可以是代表來自不會(huì)繼續(xù)發(fā)生先兆子癇的妊娠晚期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn水平的參考值(或“正?！眳⒖贾档姆秶?。在一些實(shí)施方案中，樣品glyfn水平相對(duì)于妊娠晚期對(duì)照值的“升高”可以是至少30％升高，例如40％升高、50％升高、60％升高、70％升高、80％升高、90％升高、100％升高、125％升高、150％升高或甚至更高，例如200％升高或300％升高。例如，來自妊娠早期對(duì)象的樣品中g(shù)lyfn的正常(非先兆子癇)范圍可以是10至150μg/ml，并且glyfn的異常(例如先兆子癇)水平可以大于150μg/ml，例如約200μg/ml或更高。

另一些實(shí)施方案可以是評(píng)估低出生體重風(fēng)險(xiǎn)的方法、評(píng)估hellp綜合征風(fēng)險(xiǎn)的方法或在對(duì)象中診斷先兆子癇的方法。例如，在一些實(shí)施方案中，對(duì)象可處于妊娠的妊娠晚期，并且來自對(duì)象血清樣品中的glyfn水平等于或大于約100μg/ml，例如約110μg/ml、約120μg/ml、約130μg/ml、約140μg/ml、約150μg/ml，約160μg/ml、約170μg/ml、約180μg/ml、約200μg/ml或甚至更多，可表明對(duì)象患有先兆子癇。在多個(gè)實(shí)施方案中，來自對(duì)象血清樣品中的glyfn水平等于或大于約250μg/ml，例如約275μg/ml、約300μg/ml、約325μg/ml、約350μg/ml、約375μg/ml、約400μg/ml、約425μg/ml、約450μg/ml、約475μg/ml、約500μg/ml或甚至更多，可表明對(duì)象處于低出生體重(小于孕齡或sga)嬰兒或發(fā)生hellp綜合征的風(fēng)險(xiǎn)中。在一些特別的實(shí)施方案中，來自對(duì)象的血清樣品中g(shù)lyfn水平等于或大于約500μg/ml或甚至更高可表明對(duì)象具有低出生體重(sga)嬰兒或發(fā)生hellp綜合征的高風(fēng)險(xiǎn)。

另一些其他實(shí)施方案是區(qū)分輕度先兆子癇和重度先兆子癇的方法。在這些實(shí)施方案中，所述方法還可包括在獲得第一血清樣品至少一周后，從對(duì)象獲得至少一個(gè)另外的血清樣品，例如在妊娠第33至38周之間的一系列的每周樣品。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可包括確定第二血清樣品中糖基化纖連蛋白(glyfn)的水平，并將第二血清樣品中的glyfn水平與先前確定的第一血清樣品中的glyfn水平進(jìn)行比較。在多個(gè)實(shí)施方案中，與第一(或先前)血清樣品中的glyfn水平相比，第二(或隨后)血清樣品中g(shù)lyfn水平的每周提高可表明診斷先兆子癇是有保證的。更具體地，每周提高約15μg/ml至125μg/ml，例如約25μg/ml、約35μg/ml、約45μg/ml、約55μg/ml、約65μg/ml、約75μg/ml、約85μg/ml、約95μg/ml、約105μg/ml、約115μg/ml或約125μg/ml，可表明對(duì)象患有輕度先兆子癇。同樣，在多個(gè)實(shí)施方案中，每周提高超過約150μg/ml，例如約175μg/ml、約200μg/ml、約225μg/ml、約300μg/ml、約325μg/ml、約350μg/ml、約375μg/ml、約400μg/ml或約425μg/ml或更多，可表明對(duì)象患有重度先兆子癇。

用于確定目的蛋白的豐度相對(duì)于參考樣品是否提高或降低的統(tǒng)計(jì)方法是本領(lǐng)域中公知的，并在下文中描述。在多個(gè)實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行生物流體(例如全血、血漿、血清、唾液或尿)中g(shù)lyfn水平的確定。在多個(gè)實(shí)施方案中，在直接比較分析中，可以以完全相同的方式處理參考樣品和受試樣品以便正確地代表glyfn的相對(duì)豐度并獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，可根據(jù)存在于生物樣品中的蛋白質(zhì)的電荷和分子量，通過2d-凝膠電泳進(jìn)行分離。例如，可以首先使用等電聚焦(一維凝膠電泳)，例如使用市售的固定化ph梯度(ipg)條，通過蛋白質(zhì)的電荷進(jìn)行分離。在多個(gè)實(shí)施方案中，第二維度可以是sds-page分析，其中聚焦的ipg條帶可用作樣品。在二維凝膠電泳分離后，然后可以用常規(guī)染料(例如考馬斯藍(lán)或銀染色)使蛋白質(zhì)可視化，并使用已知的技術(shù)和設(shè)備(例如bio-radgs800光密度計(jì)和pdquest^tm軟件)成像。

在一些實(shí)施方案中，然后可從凝膠上切下單個(gè)斑點(diǎn)，脫色并進(jìn)行胰蛋白酶消化，使肽混合物通過質(zhì)譜(ms)分析?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，可通過例如毛細(xì)管高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography，hplc)來分離肽，并且可以單獨(dú)地或在合并物(pools)中通過ms分析。如果希望的話，在一些實(shí)施方案中，可以確定肽片段的氨基酸序列和從其來源的蛋白質(zhì)。盡管可對(duì)蛋白質(zhì)組譜中存在的所有或一些蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和測序，但是這通常對(duì)于本文中公開的方法的診斷用途不是必需的。

如上文總所討論的，在多個(gè)實(shí)施方案中，可基于參考樣品與受試樣品之間的特征相似性或差異診斷先兆子癇或其風(fēng)險(xiǎn)。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，如果蛋白質(zhì)組譜以質(zhì)譜的形式呈現(xiàn)，則表達(dá)特征可以是代表與相應(yīng)正常樣品的質(zhì)譜定性地或定量地不同的glyfn的峰。因此，現(xiàn)有峰的振幅或形狀的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的變化可以反映glyfn水平相對(duì)于對(duì)照的變化。

另一些實(shí)施方案可利用蛋白質(zhì)陣列來監(jiān)測glyfn水平，從而實(shí)現(xiàn)高通量分析。蛋白質(zhì)陣列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且通常通過使用任何本領(lǐng)域中公知的多種共價(jià)和非共價(jià)連接化學(xué)在固體表面(例如玻璃、硅、硝化纖維或pvdf)上固定蛋白質(zhì)(例如對(duì)目的蛋白質(zhì)(如glyfn)具有特異性的抗體)形成。陣列可以用來自兩種不同來源(例如正常和受試樣品)的熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行探測，并且熒光強(qiáng)度可反映靶蛋白(例如glyfn)的表達(dá)水平。

多個(gè)實(shí)施方案還可使用用于定量蛋白質(zhì)表達(dá)水平的多種免疫測定形式中的任一種。通常來說，免疫測定可以是均相的或非均相的。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，可使用酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)來定量蛋白質(zhì)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)例中，在“夾心”測定中，可用固相抗體包被固體表面，并且可使受試樣品與結(jié)合的抗體進(jìn)行反應(yīng)。然后可洗掉任何未結(jié)合的抗原，然后可使已知量的酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)。然后可將標(biāo)記定量為樣品中存在的目的蛋白質(zhì)的量的直接測量。

在一些實(shí)施方案中，elisa也可用作競爭性測定。例如，在競爭性測定中，可將含有目的蛋白質(zhì)的受試樣品與精確量的酶標(biāo)記的目的蛋白質(zhì)混合，并且二者均可與連接至固體表面的抗體競爭結(jié)合。在多個(gè)實(shí)施方案中，可在添加酶的底物之前洗掉過量的游離的酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并且可使用由酶-底物相互作用產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度作為受試樣品中目的蛋白質(zhì)的量的量度。

多個(gè)另一些實(shí)施方案可使用酶放大免疫測定技術(shù)(enzymemultipliedimmunoassaytechnique，emit)定量目的蛋白質(zhì)，其可包括受試樣品、目的蛋白質(zhì)的酶標(biāo)記分子、對(duì)目的蛋白質(zhì)特異性的抗體和特異性酶顯色底物。在多個(gè)實(shí)施方案中，可向受試樣品中添加過量的特異性抗體，然后目的蛋白質(zhì)可以與抗體結(jié)合。在多個(gè)實(shí)施方案中，然后可向混合物中添加測量量的相應(yīng)的酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并且未被來自受試樣品的目的蛋白質(zhì)占據(jù)的抗體結(jié)合位點(diǎn)可被酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)的分子占據(jù)。因此，在多個(gè)實(shí)施方案中，可降低酶活性，原因是只有游離的酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)可作用于底物，并且經(jīng)轉(zhuǎn)化底物的量可反映留在混合物中的游離酶的量。在多個(gè)實(shí)施方案中，樣品中高濃度的目的蛋白質(zhì)可導(dǎo)致更高的吸光度讀數(shù)。

多個(gè)另一些實(shí)施方案包括用于定量受試樣品中目的蛋白質(zhì)的免疫測定試劑盒。在多個(gè)實(shí)施方案中，這些試劑盒可在單獨(dú)的容器中包含對(duì)glyfn和任選地抗-抗體免疫球蛋白(特別是標(biāo)記的抗-抗體免疫球蛋白)具有結(jié)合特異性的一種或更多種單克隆或多克隆抗體。

本文中還公開了用于所公開的方法中的捕獲裝置和樣品收集試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法可使用樣品捕獲裝置(例如可以允許定量glyfn的側(cè)向流裝置(例如側(cè)向流測試條))執(zhí)行。側(cè)向流裝置可以以多種不同的構(gòu)造獲得，但是在一個(gè)實(shí)例中，測試條可包含從上游樣品施加區(qū)到測試位點(diǎn)的流動(dòng)路徑，例如從樣品施加區(qū)通過流動(dòng)區(qū)到捕獲區(qū)。在多個(gè)實(shí)施方案中，流動(dòng)區(qū)可含有可與目的蛋白質(zhì)相互作用的可流動(dòng)標(biāo)志物，并且捕獲區(qū)可含有與目的蛋白結(jié)合以用于檢測和/或定量的試劑。在另一些實(shí)施方案中，示例性樣品收集試劑盒可包含吸收介質(zhì)(例如濾紙)，其可包含用于將受試樣品置于介質(zhì)上的標(biāo)記。這樣的試劑盒還可包含用于從對(duì)象獲得血液樣品的穿刺裝置，以及任選地用于將受試樣品發(fā)送給醫(yī)生或?qū)嶒?yàn)室以進(jìn)行分析的郵件盒(mailer)。這樣的樣品收集試劑盒可在例如標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前檢查(例如八周、十二周、十六周、二十周、二十四周、二十八周、三十周)或隨后一周隨訪期間使用，和/或可以在獲得用于其他標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前測試的血液時(shí)進(jìn)行樣品收集。

提供以下實(shí)施例是出于舉例說明的目的，并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1：對(duì)象選擇

從兩個(gè)患者群體招募研究參與者?？v向隊(duì)列由60位婦女組成，其在整個(gè)妊娠期間連續(xù)取樣，在妊娠6至14周之間采集第一樣品，以及在妊娠三期中的每一期獲得另外的樣品。在多個(gè)孕齡期，45位婦女保持血壓正常，15位發(fā)生先兆子癇。對(duì)在多個(gè)孕齡期診斷患有先兆子癇的47位患者的臨床先兆子癇隊(duì)列進(jìn)行分析以測量在其先兆子癇期間glyfn水平的變化率。先兆子癇狀態(tài)定義為收縮壓≥140mmhg或舒張壓≥90mmhg，蛋白尿≥300mg/天。使用平板測定分析207份血清樣品，并且還使用glyfn護(hù)理點(diǎn)(point-of-care，poc)裝置分析了86份血清樣品。包括在分析中的26個(gè)參與者具有一次測量，62個(gè)具有兩次測量，19個(gè)具有三次測量。

2004年至2006年從芬蘭奧盧的奧盧大學(xué)醫(yī)院婦產(chǎn)科以及國家健康和福利研究所的芬蘭孕產(chǎn)婦隊(duì)列血清庫(finnishmaternitycohortserumbank)中招募研究參與者。研究方案獲得奧盧大學(xué)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，為所有參與者提供了知情同意書。

實(shí)施例2：分析物測定

將母體血液旋轉(zhuǎn)，等分，并在-80℃下儲(chǔ)存直到進(jìn)行下述測定。

glyfn平在測定：用在碳酸鹽緩沖液ph9.6中的fc片段特異性山羊抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa；目錄號(hào)#115-005-071)包被reacti-bind平板(thermoscientific，rockford，il)，并在4℃孵育過夜，然后用pbs-0.05％吐溫20洗滌。將平板用在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)ph7.2中的3％牛血清白蛋白封閉，在室內(nèi)溫度下保持1小時(shí)。然后用pbs-0.05％吐溫20緩沖液洗滌平板，并添加抗glyfn單克隆抗體，并在室溫下孵育45分鐘。盡管在該實(shí)施例中使用特定的抗體，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可使用對(duì)糖基化(而不是非糖基化)纖連蛋白具有特異性的任何抗體。另外，特異性結(jié)合糖基化(而不是非糖基化)纖連蛋白的其他特異性結(jié)合劑(例如凝集素)可用于類似的測定以檢測和測量glyfn。一般來說，用于本公開內(nèi)容的方法和裝置中的抗體可以是單克隆或多克隆的。僅舉例來說，可根據(jù)kohler和milstein(nature256：495-497，1975)的經(jīng)典方法或其衍生方法由鼠雜交瘤制備單克隆抗體。單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)程序在harlow和lane(antibodies，alaboratorymanual，cshl，newyork，1988)中描述。

將樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白(從血清分離的人fn，r&dsystems目錄號(hào)#1918-fn-02m)孵育45分鐘，洗滌，并添加生物素化的抗人fn多克隆抗體。使用高靈敏度鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(hrp)(thermoscientific；目錄號(hào)21130)進(jìn)行標(biāo)記。孵育45分鐘后，然后用pbs-0.05％吐溫20緩沖液洗滌平板，用100μl的k-bluetmb底物(neogen，glasgow；目錄號(hào)#304177)顯色，并通過添加2nh2so4淬滅。

glyfnpoc測定：開發(fā)了包括自動(dòng)盒式讀出器(lremedicalcpocreader，lremedical，oceanside，ca)和可拋型單次使用的塑料測定盒的熒光免疫測定，其使用標(biāo)準(zhǔn)免疫測定技術(shù)以特異性和定量地檢測血清標(biāo)本中的glyfn。在上述平板測定中使用的多克隆抗fn抗體與tidefluor^tm5ws琥珀酰亞胺酯熒光標(biāo)簽(aatbioquest，sunnyvale，ca；目錄號(hào)#2281)綴合并用作檢測抗體。在上述平板測定中使用的單克隆抗glyfn抗體用作捕獲抗體，并固定在固相(測試區(qū))上。將山羊多克隆抗兔igg，fc抗體(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.；目錄號(hào)111-045-046)固定在單獨(dú)的捕獲區(qū)中以用作測試區(qū)的參照，并為該裝置適當(dāng)?shù)貓?zhí)行提供保證。

將血清在測定緩沖液中稀釋并施加于測試條。血清通過毛細(xì)管作用沿診斷通道流下，使熒光檢測抗體進(jìn)入混懸液。標(biāo)本中的glyfn與熒光抗體結(jié)合以形成由固定在測試區(qū)中的抗體捕獲的多價(jià)復(fù)合物。將盒插入盒式讀出器中，并且在10分鐘后在儀表屏幕上示出和/或打印輸出在10g/ml至2000g/ml范圍內(nèi)glyfn濃度的定量測量。

通過elisa測定sflt1水平。由于該測定需要大量血清，13個(gè)參與者不能測定該分析物。使用商業(yè)試劑盒(r&dsystemshumanplgfquantikineelisa試劑盒；目錄號(hào)#dpg00)測定plgf水平。由于血清樣品不足，57位對(duì)象進(jìn)行了該分析。使用epoch平板讀數(shù)器(biotek，winooski，vt)在450nm讀取平板，并使用gen5軟件版本1.10.8處理數(shù)據(jù)，并且如下所述進(jìn)行分析。

實(shí)施例3：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別對(duì)血壓正常、縱向先兆子癇和臨床先兆子癇樣品進(jìn)行分析，并僅在指明的地方進(jìn)行組合或比較。針對(duì)連續(xù)變量使用kruskal-wallis非參數(shù)anova和針對(duì)類別變量使用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)(fisher’sexacttest)，對(duì)研究組之間的產(chǎn)婦特征進(jìn)行比較。使用妊娠三期內(nèi)每個(gè)對(duì)象年齡匹配的測量值以參數(shù)的和非參數(shù)的威爾科克森t檢驗(yàn)(non-parametricwilcoxont-test)對(duì)患有和未患有先兆子癇的縱向參與者之間的glyfn水平進(jìn)行比較。為了分析sflt1、plgf和sflt1/plgf比值，將樣品分組到妊娠晚期，并且通過非參數(shù)威爾科克森t檢驗(yàn)將血壓正常組與臨床先兆子癇隊(duì)列進(jìn)行比較。為了評(píng)估具有輕度先兆子癇和重度先兆子癇的參與者的glyfn水平的變化，使用33至38周的具有兩個(gè)重復(fù)測量值的患者亞組來計(jì)算平均每周變化。

對(duì)于所有隊(duì)列的每個(gè)對(duì)象，使用由來自14至40周妊娠的使用單個(gè)年齡匹配測量值的邏輯回歸模型預(yù)測的概率來生成接受者操作特征(roc)曲線。使用簡單邏輯回歸計(jì)算roc曲線下面積(auroc)和相應(yīng)的95％置信區(qū)間?；谒x的閾值報(bào)告靈敏度和特異性，并報(bào)告通過具有連續(xù)性校正的評(píng)分法計(jì)算的95％置信限。使用差異的對(duì)比矩陣計(jì)算roc曲線中差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。利用標(biāo)準(zhǔn)logit方法，使用3％、5％或7％的群體患病率計(jì)算假設(shè)的預(yù)測值和95％置信區(qū)間(ci)。

以母體和胎兒臨床特征和結(jié)局相對(duì)于glyfn值進(jìn)行事后分析。在所有隊(duì)列中，將glyfn相對(duì)于分娩時(shí)的孕齡、出生體重、收縮壓和舒張壓進(jìn)行比較。在臨床先兆子癇參與者中，將glyfn與先兆子癇開始時(shí)的孕齡、尿酸、alat、蛋白尿、hellp綜合征、小于孕齡和胎盤功能不全進(jìn)行比較分析。對(duì)于連續(xù)變量，計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)(pearsoncorrelationcoefficient)和線性回歸斜率。對(duì)于可解釋性，計(jì)算線性回歸斜率以反映glyfn的100μg的變化。對(duì)于類別變量，通過將參與者分類為具有或不具有g(shù)lyfn水平≥500μg的那些來進(jìn)行費(fèi)希爾準(zhǔn)確檢驗(yàn)。

在通過兩種方法測定的樣品上進(jìn)行g(shù)lyfn平板測定與glyfnpoc的比較以評(píng)估poc測試區(qū)分患有和未患有先兆子癇的參與者的能力以及評(píng)估glyfn在妊娠中期和妊娠晚期監(jiān)測先兆子癇進(jìn)展的能力。計(jì)算相關(guān)系數(shù)以比較兩種測量值。對(duì)glyfn平板和poc數(shù)據(jù)分別產(chǎn)生roc曲線以用于分類pe與對(duì)照、對(duì)照與輕度pe以及輕度與重度pe，并且在glyfn平板和poc測定之間比較每種的auroc。報(bào)告的p值是雙側(cè)的，p＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。使用windows的sas系統(tǒng)的sas軟件，版本9.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)施例4：用于評(píng)估先兆子癇的glyfn

圖2是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出了依照先兆子癇狀態(tài)和隊(duì)列的母體特征的表。臨床先兆子癇組的患者更可更早分娩(p＜0.01)并具有更低的新生兒出生體重(p＜0.01；圖2)。隊(duì)列之間母體年齡(p＝0.14)和未經(jīng)產(chǎn)(nulliparity)(0.31)之間沒有差異。在縱向先兆子癇組中診斷出先兆子癇時(shí)的平均孕齡顯著晚于臨床先兆子癇隊(duì)列。

圖3是示出縱向的血壓正常和先兆子癇組之比較的圖，示出了在妊娠三期的每一個(gè)內(nèi)先兆子癇患者中的glyfn水平顯著高于對(duì)照，并且圖4a和4b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出以下的表格：依照先兆子癇狀態(tài)和妊娠三期的縱向隊(duì)列中血清生物標(biāo)記物濃度(圖4a)，以及在縱向隊(duì)列中在整個(gè)妊娠期中g(shù)lyfn濃度的圖(圖4b)。縱向的血壓正常組和先兆子癇組的比較發(fā)現(xiàn)，在妊娠三期的每一個(gè)內(nèi)先兆子癇患者中的glyfn水平顯著高于對(duì)照(p＜0.01，圖3，4a和4b)。

圖5a和5b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出了血壓正常和臨床先兆子癇隊(duì)列中的血清生物標(biāo)志物濃度的表格(圖5a)，以及血壓正常對(duì)照和臨床先兆子癇患者中妊娠中期和妊娠晚期glyfn濃度的圖(圖5b)。為了評(píng)估在妊娠晚期血清生物標(biāo)志物的變化，將來自血壓正常對(duì)照和臨床先兆子癇隊(duì)列的年齡匹配樣品的glyfn、sflt1、plgf和sflt1/plgf比值的水平進(jìn)行比較。在患有或未患有先兆子癇的參與者之間所有血清生物標(biāo)志物有顯著差異(p＜0.01)。

圖6a和6b是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出依據(jù)周和先兆子癇狀態(tài)之glyfn濃度的平均每周變化的表格(圖6a)，以及示出在所有隊(duì)列內(nèi)生物標(biāo)志物的妊娠晚期先兆子癇分類性能的接受者操作特征曲線(圖6b)。對(duì)生物標(biāo)志物隨時(shí)間變化的重復(fù)測量分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照中在整個(gè)妊娠期中g(shù)lyfn沒有顯著變化(p＝0.83)。在患有先兆子癇的患者中，對(duì)于具有輕度先兆子癇的參與者，33周和38周之間的每周變化為81.7(se94.1)μg/ml，并且對(duì)于重度先兆子癇的參與者為195.2(se88.2)μg/ml。

圖7是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出所有隊(duì)列內(nèi)生物標(biāo)志物的妊娠晚期先兆子癇分類性能的表格，并且圖8是示出用于在不同患病率估計(jì)下預(yù)測先兆子癇的glyfnpoc值的表格。通過roc曲線測試用于檢測先兆子癇的這些生物標(biāo)志物的臨床效用。圖7中示出了glyfn、sflt1、plgf和aflt1/plgf比值的auroc。由于sflt1測定需要顯著的血清量，所以該分析限于在20至39周妊娠期間的15位對(duì)照和39位先兆子癇參與者，其具有足夠的血清用于sflt1分析。glyfn的auroc為0.99，并趨向于與sflt1(auroc：0.96，p＝0.11)和plgf(auroc：0.94，p＝0.10)的auroc顯著不同。在以176.4μg/ml的閾值分類時(shí)，glyfn示出了0.97(0.85至1.00)的靈敏度和0.93(0.66至1.00)的特異性。在該閾值，估計(jì)的先兆子癇的群體患病率為5％，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為47％(95％ci：23-72％)和89％(95％ci：80-98％)(圖8)。

圖9是根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案示出在血壓正常和臨床先兆子癇中妊娠晚期glyfn水平與臨床特征和結(jié)局之關(guān)系的表格。因此，母體和胎兒結(jié)局與glyfn的事后分析的結(jié)果在圖9中示出。glyfn值與分娩時(shí)的孕齡、出生體重、血壓、尿酸和alat具有顯著的線性關(guān)系。對(duì)于glyfn每提高100μg/ml，預(yù)測分娩孕齡下降0.59周(4天)(p＜0.01)，出生體重降低129.4克(p＜0.01)、收縮壓提高1.39mm/hg(p＝0.04)、舒張壓提高1-14mm/hg(p＝0.01)、尿酸提高13.6μmol/l(p＜0.01)并且alat提高5.88u/l(p＜0.01)。glyfn與先兆子癇診斷的孕齡(p＝0.27)或蛋白尿(p＝0.68)不顯著相關(guān)。

對(duì)于患有先兆子癇的參與者，在孕齡較小的嬰兒與glyfn水平≥500μg/ml的之間存在顯著的關(guān)系。在glyfn水平＜500μg的先兆子癇患者中，8％(1/32)具有孕齡較小的嬰兒，而對(duì)于glyfn水平≥500μg/ml的先兆子癇患者，26％(6/24)為孕齡較小(p＝0.03)?；颊呔哂懈遟lyfn水平和hellp或胎盤功能不全與患有先兆子癇沒有顯著關(guān)系(分別為p＝0.13和p＝0.27)；然而，glyfn水平≥500μg/ml的婦女中較高百分比的婦女發(fā)生hellp(26％對(duì)8％；p＝0.13)和胎盤功能不全(26％對(duì)12％；p＝0.27)。

將glyfn平板測定的結(jié)果與樣品亞組上glyfnpoc測定進(jìn)行比較。在平板和poc測定之間存在強(qiáng)相關(guān)性(r＝0.76，p＜0.01)。對(duì)于兩種方法分別產(chǎn)生roc曲線，并且平板(auroc＝0.99，95％ci：0.99至1.00)和poc(auroc0.93，95％ci：0.85至1.00)測定之間的auroc類似。對(duì)于poc和平板測定，產(chǎn)生roc曲線以比較區(qū)分輕度和重度pe的能力，并且poc勝過平板測定(auroc＝0.78對(duì)0.68)。

實(shí)施例5：glyfn作為先兆子癇的生物標(biāo)志物

在本文中示出了glyfn為先兆子癇的強(qiáng)大的生物標(biāo)志物，因此，glyfn可用于多種評(píng)估和診斷方法中，例如基于妊娠早期母體血清中的升高水平隨時(shí)間推移評(píng)估先兆子癇的進(jìn)展，以及監(jiān)測整個(gè)妊娠的遞增以便在對(duì)象中預(yù)測或診斷先兆子癇。如本文中所公開的，glyfn水平提高與重要的臨床特征和結(jié)局相關(guān)，包括提早分娩、出生體重降低、以及血壓、尿酸和alat升高。glyfn是監(jiān)測先兆子癇的獨(dú)特地可用的分析物，因?yàn)間lyfn水平在整個(gè)妊娠中在對(duì)照中保持恒定。發(fā)現(xiàn)對(duì)于預(yù)測先兆子癇的最佳靈敏度和特異性為在176.4μg/ml的glyfn的截?cái)嘀堤帯?/p>

因此，在多個(gè)實(shí)施方案中，血清glyfn水平的測量可用于控制先兆子癇的方法、預(yù)測不良臨床結(jié)局(低出生體重、hellp等)的方法、以及區(qū)分輕度和重度子癇的方法。

該glyfn級(jí)分的優(yōu)越性能推斷反映了glyfn與啟動(dòng)先兆子癇的病理過程強(qiáng)烈關(guān)連。不受理論的束縛，這繼而可反映顯示獨(dú)特糖基化模式的fn剪接變體或蛋白水解片段的先兆子癇發(fā)生中的特定關(guān)連。令人感興趣的是，最近已報(bào)道氧水平調(diào)節(jié)人胎盤中核心-1o-聚糖galβ1-3galnac表位的表達(dá)；因此，不受理論的約束，胎盤功能不全可造成改變先兆子癇中的糖蛋白水平。

不受理論的束縛，glyfn與妊娠糖尿病以及先兆子癇的關(guān)聯(lián)可以是以下事實(shí)的結(jié)果：兩種病癥均與炎癥和內(nèi)皮功能障礙相關(guān)。因此，與破壞的螺旋動(dòng)脈重塑有關(guān)的妊娠早期炎癥和內(nèi)皮功能障礙可與特定形式的糖基化fn水平提高相關(guān)。在這兩種相關(guān)病癥中g(shù)lyfn豐度的不同模式依然有趣(例如，所有妊娠三期中妊娠糖尿病始終升高，但在先兆子癇期間逐漸提高)，但它可表明在妊娠早期建立觸發(fā)妊娠糖尿病的因素并保持在恒定的水平，而先兆子癇的開始和發(fā)生涉及產(chǎn)生glyfn的病癥的持續(xù)提高。

本文中公開的方法使能夠使用glyfn作為生物標(biāo)志物來監(jiān)測先兆子癇的嚴(yán)重程度以及使用glyfn來預(yù)測先兆子癇的發(fā)生，特別是在妊娠早期或妊娠中期患者中。sflt1和plgf目前用于診斷先兆子癇的調(diào)查性研究中，但不用于疾病進(jìn)展的早期預(yù)測或監(jiān)測。在glyfn和臨床結(jié)局之間發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性是重要且獨(dú)特的，因?yàn)樗⒘擞糜陬A(yù)測哪些患者將具有差的母體和/或胎兒結(jié)局的方法。該分析示出了在整個(gè)妊娠期(包括在先兆子癇的臨床表現(xiàn)之前)，在患有和未患有先兆子癇的患者之間glyfn顯著不同，對(duì)于其他先兆子癇分析物則沒有示出，并且支持該疾病的早期發(fā)病機(jī)制的理念。如本文中所公開的，glyfn水平升高可用作先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的早期指示物。

以poc形式使用該測試的能力為從業(yè)人員提供了一種快速確定其妊娠患者中先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)以及確定那些患有先兆子癇的患者中差的母體和胎兒結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的方法。

實(shí)施例6：糖基化纖連蛋白側(cè)向流免疫測定(fnlfia)

在一些實(shí)施方案中，可使用側(cè)向流裝置評(píng)估glyfn水平?？墒褂枚喾N側(cè)向流測定方法來測試生物樣品中分析物(例如glyfn)的存在或不存在或量。在一個(gè)實(shí)例中，“夾心”測定方法使用固定在固體支持物上與標(biāo)記抗體形成復(fù)合物的一部分的抗體以通過觀察結(jié)合有分析物標(biāo)記的抗體復(fù)合物的存在和量來確定靶分析物的存在。對(duì)于側(cè)向流免疫測定的目的，標(biāo)記可以是酶、彩色微球、熒光標(biāo)記的微球，或可使用提供用于檢測和/或定量與測試線結(jié)合的分析物的其他類似檢測方法。

常規(guī)的側(cè)向流測試條具有固體支持物，在所述固體支持物上有樣品接收區(qū)域和靶標(biāo)捕獲區(qū)。固體支持材料是這樣的材料，其能夠支持樣品接收區(qū)和靶標(biāo)捕獲區(qū)，并且當(dāng)側(cè)向流測試條暴露于合適的溶劑或緩沖液(其用作樣品的載液)時(shí)，提供樣品從樣品接收區(qū)向靶標(biāo)捕獲區(qū)毛細(xì)管流動(dòng)?？捎米髦С治锏囊话悴牧项悇e包括有機(jī)或無機(jī)聚合物以及天然和合成聚合物。合適的固體支持物的更具體的實(shí)例包括但不限于玻璃纖維、纖維素、尼龍、交聯(lián)葡聚糖、多種色譜紙和硝酸纖維素。一種特別可用的材料是硝酸纖維素。

圖10a和10b示出了可根據(jù)本文中公開的多個(gè)實(shí)施方案使用的側(cè)向流免疫測定(圖10a)和側(cè)向流測試裝置(圖10b)的實(shí)例的示意圖。在這樣的裝置的一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，將200μg/ml兔抗glyfn作為測試線(0.5μl/條)固定在膜上，并將300μg/ml山羊抗小鼠igg作為操作對(duì)照線(0.5μl/條)固定。將小鼠抗fn-綴合的微球(10μl的150μg/ml小鼠抗纖連蛋白，1mg/ml固體)在已經(jīng)用(每升)含有以下成分的溶液處理的綴合物墊上干燥：3.81g硼酸鈉、2.0g葡聚糖、5.0gbsa、1.0g吐溫20和0.5g疊氮化鈉，ph8.0，然后在50℃下干燥1小時(shí)。

然后將樣品在hepes運(yùn)行緩沖液(10mmhepes、0.1mmcacl2、155mmnacl、0.1％nan3、0.75％吐溫20和0.01％聚乙烯醇)中1∶500稀釋。當(dāng)將樣品施加于樣品墊時(shí)，毛細(xì)管流使含glyfn的樣品水合并與標(biāo)記的微球相互作用，形成經(jīng)glyfn標(biāo)記的微球復(fù)合物，其進(jìn)一步遷移至測試線，在那里它們被兔抗glyfn捕獲。

毛細(xì)管遷移完成后，將裝置掃描并通過定量光密度測定法相對(duì)于經(jīng)純化的glyfn作為標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中g(shù)lyfn的量。盡管本文中描述了特定的側(cè)向流裝置，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到側(cè)向流裝置是常規(guī)的，并且可使用所公開的裝置的變化形式。

盡管本文中已經(jīng)舉例說明和描述了某些實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，用于實(shí)現(xiàn)相同目的的很多種替代和/或等價(jià)實(shí)施方案或?qū)嵤┛梢蕴娲境龊兔枋龅膶?shí)施方案而不脫離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，可以以很多種方式實(shí)現(xiàn)實(shí)施方案。本申請(qǐng)旨在覆蓋本文中所討論的實(shí)施方案的任何修改或變化。因此，顯然希望實(shí)施方案僅由權(quán)利要求及其等價(jià)形式限制。