本申請(qǐng)要求2014年7月1日提交的臨時(shí)申請(qǐng)62/019,830的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。
引言
人們使用一批殺傷正在生長(zhǎng)和分裂的細(xì)胞并以多種方式發(fā)揮功能的治療劑來治療癌癥。常見的化療劑集合已被單獨(dú)或聯(lián)合使用了數(shù)十年，且該常見的試劑集合已成為臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐中傳統(tǒng)且常規(guī)的癌癥治療手段。這些傳統(tǒng)的化療劑通過殺傷所有快速分裂的細(xì)胞來發(fā)揮作用，快速分裂是大多數(shù)癌細(xì)胞的主要特性之一。這類試劑包括直接損傷dna的烷化劑；阻止微管形成的紫杉烷；干擾dna和rna復(fù)制的抗代謝物；干擾dna復(fù)制所涉及酶的蒽環(huán)類藥物(抗腫瘤抗生素)；阻止dna復(fù)制的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；阻止酶生成細(xì)胞繁殖所需蛋白質(zhì)的衍生自天然產(chǎn)物的生物堿和其他化合物；導(dǎo)致dna交聯(lián)以抑制dna復(fù)制和/或dna合成的基于鉑的藥物。這些化療劑類別是基于其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的基本功能原創(chuàng)性開發(fā)的，而對(duì)其靶向作用模式知之甚少。由于他們不是為特異性靶向和直接抑制已知蛋白質(zhì)而開發(fā)的，這些試劑在歷史書并未被視作“靶向”癌癥治療劑。然而，自其開發(fā)開始，這些試劑類別中的每一個(gè)的生物化學(xué)功能是熟知的且其每一個(gè)均被發(fā)現(xiàn)對(duì)于特定的蛋白質(zhì)、酶或核酸具有“靶向”作用。這些化療劑的“靶標(biāo)”也是熟知的且因此基于某一給定癌癥中是否存在這些特異性“靶標(biāo)”來選擇針對(duì)該癌癥的最有效的化療劑。該實(shí)施方式描述了測(cè)試患者來源的生物樣品中是否存在這些化療生物標(biāo)志物的特定方法。
當(dāng)一個(gè)或多個(gè)特異性靶蛋白質(zhì)給出哪一種或多種化療劑應(yīng)用于治療癌癥以抑制癌生長(zhǎng)的指標(biāo)時(shí)，癌癥療法的靶向方法是最有利的。該實(shí)施方式提供了用于一種或多種srm/mrm測(cè)定的肽和肽序列，這些測(cè)定用于定量確定直接在來自癌癥患者的患者來源的生物樣品中表達(dá)、過表達(dá)或不表達(dá)的化療蛋白質(zhì)指標(biāo)，用于改進(jìn)的針對(duì)癌癥療法的治療決定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
提供了來源于以下蛋白質(zhì)的亞序列的特定肽：ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a。ent1也稱為平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1且在本文中稱作ent1。ercc1也稱為dna切除修復(fù)蛋白質(zhì)ercc-1且在本文中稱作ercc1。folr1也稱為葉酸受體α且在本文中稱作folr1。rrm1也稱為核糖核苷二磷酸還原酶大亞基且在本文中稱作rrm1。tubb3也稱為微管蛋白β-3鏈蛋白質(zhì)且在本文中稱作tubb3。topo1也稱為dna拓?fù)洚悩?gòu)酶1且在本文中稱作topo1。topo2a也稱為dna拓?fù)洚悩?gòu)酶2α且在本文中稱作topo2a。
各種來源于蛋白質(zhì)的肽的肽序列和碎片/過渡離子可具體用于基于質(zhì)譜的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(srm)中，其也稱為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)測(cè)定，且在后文中稱作srm/mrm。描述了用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)及其同種型的定量srm/mrm分析的肽的用途。
可使用一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種，或五種或六種srm/mrm測(cè)定來測(cè)量來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種特異性肽的相對(duì)或絕對(duì)定量水平，并由此提供通過質(zhì)譜測(cè)量從生物樣品中獲得的給定蛋白質(zhì)制備物中每一種那些蛋白質(zhì)的總量的方法。所有或一部分來自那些蛋白質(zhì)的可用肽也可在單個(gè)srm/mrm測(cè)定中同時(shí)分析或可在單個(gè)srm/mrm測(cè)定的任意組合中分析。各肽提供了通過質(zhì)譜測(cè)量獲自生物樣品的給定蛋白質(zhì)制備物中各相應(yīng)蛋白質(zhì)總量的潛在方法。
更具體地，本發(fā)明所述srm/mrm測(cè)定可直接測(cè)量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織的患者組織樣品(例如，切除的腫瘤和活檢切片)取得的細(xì)胞制備的復(fù)雜蛋白質(zhì)裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質(zhì)樣品的方法描述在美國(guó)專利第7,473,532號(hào)中，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。該專利描述的方法可使用獲自表達(dá)病理學(xué)公司(expressionpathologyinc.)(馬里蘭州羅克維爾)的liquidtissue試劑和方案方便地進(jìn)行。
對(duì)從癌癥患者處手術(shù)移出的組織進(jìn)行甲醛/福爾馬林固定是病理學(xué)實(shí)踐中已經(jīng)接受的常規(guī)方法。結(jié)果是，甲醛/福爾馬林固定石蠟包埋的組織是來自那些患者的最廣泛可得的組織形式。甲醛/福爾馬林固定通常使用甲醛水溶液，其在本文中稱作福爾馬林?！?00％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％福爾馬林或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩(wěn)定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個(gè)組織在通常稱為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí)至48小時(shí))浸泡，接著在室溫下將固定的整個(gè)組織包埋在石蠟中以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。
srm/mrm測(cè)定的結(jié)果可用于關(guān)聯(lián)自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內(nèi)任意或所有這些蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確且精確的定量水平，此外還可關(guān)聯(lián)這些蛋白質(zhì)的潛在同種型的準(zhǔn)確且精確的定量水平。這不僅提供關(guān)于癌癥的診斷信息，而且容許醫(yī)師或其它醫(yī)療專業(yè)人員確定用于患者或?qū)ο蟮倪m當(dāng)療法。提供關(guān)于在患病組織或另一患者/對(duì)象樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的診斷和治療重要信息的這一測(cè)定稱為伴隨診斷測(cè)定。例如，這一測(cè)定可設(shè)計(jì)用于診斷癌癥的階段、程度或組織學(xué)特征并確定將最有效地組織癌細(xì)胞生長(zhǎng)從而使得患者或?qū)ο笞羁赡軕?yīng)答的治療劑。更具體地，對(duì)來自患者的癌細(xì)胞中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種進(jìn)行檢測(cè)和/或定量可提供某些蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)可顯示應(yīng)遵循哪種或哪幾種治療方案。
發(fā)明詳述
本發(fā)明所述的測(cè)定定量或測(cè)量來自包括ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的特定未修飾的肽的相對(duì)或絕對(duì)水平并且還可測(cè)量來自那些蛋白質(zhì)的特定修飾的肽的相對(duì)或絕對(duì)水平。修飾的示例包括在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)同種型的相對(duì)定量水平可通過srm/mrm方法確定，例如通過比較srm/mrm特征峰面積(signaturepeakarea)(例如，特征峰面積或積分的片段離子強(qiáng)度)來確定。可在不同樣品(例如，對(duì)照樣品和由患者或?qū)ο蠼M織制備的樣品)中測(cè)定單個(gè)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的相對(duì)水平?；蛘撸诟鞣N肽具有其自己的特異性srm/mrm特征峰的情況下，可以比較多種一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a特征肽的多個(gè)srm/mrm特征峰面積。通過比較峰面積，可以測(cè)定一種生物樣品中或一種或多種額外或不同的生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和潛在蛋白質(zhì)同種型含量的相對(duì)水平。以此方式，可在相同實(shí)驗(yàn)條件下跨越多個(gè)(例如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè))生物樣品測(cè)定來自那些蛋白質(zhì)的具體一種或多種肽的相對(duì)含量并從而測(cè)定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)及其潛在同種型的相對(duì)含量。另外，確定單一樣品內(nèi)來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種給定肽的相對(duì)定量的方法可以是通過srm/mrm方法比較該肽的特征峰面積與同一來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的來自不同的一種或多種蛋白質(zhì)的其他和不同的一種或多種肽的特征峰面積。使用這類方法，可測(cè)定來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的具體肽的含量，并繼而測(cè)定各相應(yīng)蛋白質(zhì)及其潛在同種型的含量，該測(cè)定的方式是一種蛋白質(zhì)相對(duì)于同一樣品或不同樣品中的另一種蛋白質(zhì)。由于單個(gè)一種或多種肽的相對(duì)定量可相對(duì)于樣品內(nèi)或樣品間的另外一種或多種肽的含量來進(jìn)行測(cè)定，因此可以測(cè)定所存在肽的相對(duì)含量(例如通過測(cè)定一種相對(duì)于另一種的峰面積)，這與生物樣品中蛋白質(zhì)的絕對(duì)重量：體積或重量：重量含量無關(guān)。因此可使用來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的含量來測(cè)定多種樣品之中或之間的那些蛋白質(zhì)的含量。不同樣品之間單個(gè)特征峰面積的相對(duì)定量數(shù)據(jù)通常標(biāo)準(zhǔn)化至單位樣品中所分析蛋白質(zhì)的含量(例如，使用樣品的總蛋白質(zhì)濃度和所分析的體積來標(biāo)準(zhǔn)化樣品)?？煽缭絹碜詥蝹€(gè)樣品中同時(shí)存在的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和多個(gè)蛋白質(zhì)的許多肽和/或跨越許多樣品來進(jìn)行相對(duì)定量，從而進(jìn)一步了解相對(duì)蛋白質(zhì)含量，即相對(duì)于其他肽/蛋白質(zhì)的一種肽/蛋白質(zhì)。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量水平通過例如srm/mrm方法確定，通過該方法將來自在一種生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的單個(gè)肽的srm/mrm特征峰面積與一種或多種內(nèi)標(biāo)物的已知含量的srm/mrm特征峰面積相比較，這些內(nèi)標(biāo)物以已知含量“摻入”樣品中(例如，同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物為合成形式的完全相同的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽，其含有用一種或多種重同位素標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。合成這類同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，使得通過質(zhì)譜分析時(shí)產(chǎn)生可預(yù)測(cè)且一致的srm/mrm特征峰，其與天然ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽特征峰不同且截然不同并可用作比較峰。因此，當(dāng)內(nèi)標(biāo)物以已知含量摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)或肽制備物中并通過質(zhì)譜分析時(shí)，將天然肽的srm/mrm特征峰面積與內(nèi)標(biāo)肽的srm/mrm特征峰面積相比較。該數(shù)值比較允許計(jì)算來自生物樣品的原始蛋白質(zhì)制劑中存在的天然肽的絕對(duì)摩爾濃度和/或絕對(duì)重量，從中可測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的濃度或重量。片段肽的絕對(duì)定量數(shù)據(jù)通常根據(jù)每種樣品中所分析的蛋白質(zhì)的含量來顯示。絕對(duì)定量可跨越許多肽進(jìn)行(其允許定量測(cè)定單個(gè)樣品中同時(shí)存在的多種蛋白質(zhì)(例如，兩種、三種、四種、五種等))和/或跨越多種樣品進(jìn)行，從而了解單個(gè)生物樣品中和/或整個(gè)單個(gè)樣品的組中的絕對(duì)蛋白質(zhì)含量。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用gyai等在美國(guó)專利7,501,286中描述的肽標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
本文中，術(shù)語定量、量化、測(cè)量或度量指測(cè)定分析物的相對(duì)或絕對(duì)水平，該分析物是例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、標(biāo)準(zhǔn)品(例如內(nèi)標(biāo)物)。本發(fā)明所述的測(cè)定可用于在使用例如患者來源或?qū)ο髞碓吹慕M織(如福爾馬林固定的組織)時(shí)輔助確定癌癥階段。本發(fā)明所述的srm/mrm測(cè)定還可用于輔助確定哪種治療劑將最有利地用于治療該患者或?qū)ο蟆?/p>
為檢測(cè)與本發(fā)明所述的癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)的水平，可對(duì)經(jīng)由移出部分或全部腫瘤的手術(shù)或經(jīng)由為了確定疑似疾病的存在與否而進(jìn)行的活檢方法從患者或?qū)ο笠瞥龅囊伤瓢┬越M織或癌性組織進(jìn)行分析。分析這些組織的樣品以確定是否存在所懷疑的疾病。分析這些組織的樣品以確定患者或?qū)ο蟮臉悠分惺欠翊嬖趀nt1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及存在何種形式的這些蛋白質(zhì)。此外，可確定這些蛋白質(zhì)中一種或多種的表達(dá)水平并將其與在健康組織中發(fā)現(xiàn)的“正?！被騾⒖妓较啾容^。在健康組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的正?；騾⒖妓娇蓙碓从诶鐩]有癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的相關(guān)組織。或者，可通過分析未受癌癥影響的相關(guān)組織(例如，同一器官的一部分)來獲得具有癌癥的個(gè)體的正常或參考水平。
蛋白質(zhì)或肽的水平或含量可定義為通過srm/mrm測(cè)定確定的蛋白質(zhì)或肽的量(表示為摩爾、質(zhì)量或重量)。該水平或含量可標(biāo)準(zhǔn)化至分析的裂解物中蛋白質(zhì)或另一種成分的總體水平或含量(例如，表示為微摩爾/微克蛋白質(zhì)或微克/微克蛋白質(zhì))或甚至標(biāo)準(zhǔn)化至單位重量基礎(chǔ)上的dna含量(例如，微摩爾或微克/微克dna)。此外，蛋白質(zhì)或肽的水平或含量可以體積基礎(chǔ)測(cè)定，例如表示為微摩爾或納克/微升。通過srm/mrm測(cè)定確定的蛋白質(zhì)或肽的水平或含量還可標(biāo)準(zhǔn)化至所分析細(xì)胞的數(shù)目。涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及這些蛋白質(zhì)的同種型的信息可用于輔助確定癌癥的階段或等級(jí)，方法為關(guān)聯(lián)或比較ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)及其同種型或片段肽的水平與正常組織中觀察到的水平。一旦確定癌癥的組織學(xué)階段和/或等級(jí)和/或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達(dá)特征，則可將該信息與經(jīng)開發(fā)以特異性治療癌癥組織的(化學(xué)和生物)治療劑的列表相匹配，該癌癥組織的特征是例如所測(cè)定的一種或多種蛋白質(zhì)(例如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a)的異常表達(dá)。匹配來自特定個(gè)體的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)測(cè)定的信息與特異性靶向表達(dá)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的細(xì)胞/組織的治療劑列表代表了治療癌癥的個(gè)性化用藥方法。本發(fā)明所述的測(cè)定方法使用來自患者或?qū)ο笞陨斫M織的蛋白質(zhì)的分析作為診斷和治療決定的來源，從而形成個(gè)性化用藥方法的基礎(chǔ)。
肽生成
原則上說，通過任何特異性已知的蛋白水解過程制備的來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的任何預(yù)測(cè)的肽均可用作替代性報(bào)告子以測(cè)定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的豐度。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用特異性已知的一種或多種蛋白酶(例如一種或多種胰蛋白酶和/或胞內(nèi)蛋白酶lys-c)消化樣品。蛋白水解處理得到的一種或多種肽可在諸如基于質(zhì)譜的srm/mrm測(cè)定的合適測(cè)定中用作替代性報(bào)告子來測(cè)定一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的豐度。類似地，也可使用已知在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)中被修飾的位點(diǎn)處含有一個(gè)氨基酸殘基的任何預(yù)測(cè)的肽序列來測(cè)定樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)的修飾程度。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽可通過多種方法來產(chǎn)生，包括使用在美國(guó)專利7,473，532中提供的liquidtissuetm方案。liquidtissuetm方案和試劑能夠通過對(duì)組織/生物樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解消化來由福爾馬林固定的石蠟包埋組織生成適用于質(zhì)譜分析的肽樣品。在liquidtissuetm方案中，將組織/生物制備物在緩沖液和升高的溫度中保持延長(zhǎng)的一段時(shí)間(例如，約80℃至約100℃，持續(xù)約10分鐘至約4小時(shí)的時(shí)間)以逆轉(zhuǎn)或釋放蛋白質(zhì)交聯(lián)。所采用的緩沖液為中性緩沖液(例如，基于tris的緩沖液或含有去垢劑的緩沖液)且優(yōu)選不干擾質(zhì)譜分析的緩沖劑。隨后，將組織/生物樣品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶lys-c的一種或多種蛋白酶處理足以破壞所述生物樣品的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)并使所述樣品液化的時(shí)間(例如，在約37℃至約65℃的溫度下持續(xù)約30分鐘至約24小時(shí)的時(shí)間)。加熱和蛋白水解的結(jié)果為液態(tài)可溶性可稀釋的生物分子裂解物。在一組實(shí)施方式中，選自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶lys-c的兩種或更多種蛋白酶被用于生物樣品的蛋白水解處理。
肽分離和測(cè)定
一旦制備好裂解物，就可對(duì)樣品中的肽應(yīng)用多種促進(jìn)其分析和測(cè)量(定量)的技術(shù)。當(dāng)通過質(zhì)譜進(jìn)行分析時(shí)，可使用一種或多種色譜方法以促進(jìn)分析。
在一個(gè)實(shí)施方式中，在通過質(zhì)譜儀器分析前通過液相色譜(lc)對(duì)肽進(jìn)行分離。例如，可使用picofrit(100μmid/10μmtipid，新目標(biāo)公司(newobjective))柱在nanoacquitylc系統(tǒng)(沃特斯公司(waters)，馬薩諸塞州米爾福德)或easy-nlcii(賽默飛世爾科技公司(thermoscientific)，加利福尼亞州圣地亞哥)上分離肽，該柱使用jupiterproteo
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過親和技術(shù)分離肽，例如基于免疫的純化(如免疫親和色譜)、離子選擇性介質(zhì)上的色譜，或在肽被修飾時(shí)通過使用適當(dāng)介質(zhì)進(jìn)行分離，該介質(zhì)是例如用于分離碳水化合物修飾的肽的凝集素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用了siscapa方法，其在質(zhì)譜分析前進(jìn)行肽的免疫分離。該siscapa技術(shù)描述于例如美國(guó)專利號(hào)7,632,686。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可在通過質(zhì)譜進(jìn)行分析前使用凝集素親和方法(例如親和純化和/或色譜)來從裂解物中分離肽。分離肽組的方法(包括基于凝集素的方法)描述于例如geng等j.chromatographyb，752：293-306(2001)。免疫親和色譜技術(shù)、凝集素親和技術(shù)和其他形式的親和分離和/或色譜(如反相、基于大小的分離、離子交換)可以合適的組合使用以促進(jìn)通過質(zhì)譜對(duì)肽進(jìn)行分析。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的許多潛在肽序列并不適合在基于質(zhì)譜的srm/mrm測(cè)定中使用或者在基于質(zhì)譜的srm/mrm測(cè)定中使用時(shí)是失效的，其原因不明。具體而言，發(fā)現(xiàn)在來自福爾馬林固定、石蠟包埋的組織的liquidtissuetm裂解物中無法有效檢測(cè)或根本無法檢測(cè)到許多來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽。由于不可能預(yù)測(cè)最適合mrm/srm測(cè)定的肽，因此必須通過實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的liquidtissuetm裂解物中鑒定修飾的和未修飾的肽以開發(fā)針對(duì)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的可靠且準(zhǔn)確的srm/mrm測(cè)定。不希望受任何理論約束，但認(rèn)為一些肽可能例如難以通過質(zhì)譜檢測(cè)，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)良好地電離或生成與其它蛋白質(zhì)不同的片段，肽也可能無法在分離(例如，液相色譜)中良好地解析，或者附著到玻璃或塑料器具上。因此，可在由福爾馬林固定的組織樣品制備的liquidtissuetm裂解物中檢測(cè)的來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的那些肽(例如，表1和2中的肽)是在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)srm/mrm測(cè)定中可針對(duì)其使用srm/mrm測(cè)定的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，在單個(gè)樣品中同時(shí)分離ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)時(shí)使用的蛋白酶將是胰蛋白酶。
在本發(fā)明所述多個(gè)實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽(例如，表1和/或表2)通過胰蛋白酶消化復(fù)雜的liquidtissuetm裂解物內(nèi)的所有蛋白質(zhì)而來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)，該裂解物由從福爾馬林固定的癌癥組織中取得的細(xì)胞制備。除非另外指出，否則在各種情況下，該蛋白酶都為胰蛋白酶。liquidtissuetm裂解物隨后通過質(zhì)譜分析以確定通過質(zhì)譜檢測(cè)并分析的來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的那些肽。用于質(zhì)譜分析的具體優(yōu)選的肽亞組的鑒定基于：1)在liquidtissuetm裂解物的質(zhì)譜分析中電離的來自蛋白質(zhì)的一種或多種肽的實(shí)驗(yàn)確定，和2)肽在制備liquidtissuetm裂解物中使用的方案和實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)存在的能力。后一性質(zhì)的范圍不僅是肽的氨基酸序列，而且是肽內(nèi)的修飾的氨基酸殘基在樣品制備期間以修飾的形式繼續(xù)存在的能力。
從福爾馬林(甲醛)固定的組織中直接取得的細(xì)胞的蛋白質(zhì)裂解物使用liquidtissuetm試劑和方案制備，liquidtissuetm試劑和方案要求經(jīng)由組織顯微解剖將細(xì)胞收集到樣品管中，接著在liquidtissuetm緩沖液中對(duì)細(xì)胞加熱延長(zhǎng)的一段時(shí)間。一旦負(fù)面地影響到福爾馬林誘導(dǎo)的交聯(lián)，則使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶)以可預(yù)測(cè)的形式消化組織/細(xì)胞至完全消化。通過用蛋白酶消化完整的多肽將各蛋白質(zhì)裂解物而轉(zhuǎn)化成肽的集合。分析(例如，通過離子阱質(zhì)譜)各liquidtissuetm裂解物以對(duì)肽進(jìn)行多重全局性蛋白組學(xué)研究，其中數(shù)據(jù)表示為來自各蛋白質(zhì)裂解物中存在的所有細(xì)胞蛋白質(zhì)的可通過質(zhì)譜鑒定的盡可能多的肽的鑒定結(jié)果。通常采用離子阱質(zhì)譜或能夠進(jìn)行全局性概要分析的另一形式的質(zhì)譜來鑒定來自單一復(fù)雜蛋白質(zhì)/肽裂解物的盡可能多的肽以用于分析。盡管可在包括maldi、離子阱或三重四極質(zhì)譜的任何類型的質(zhì)譜上開發(fā)并進(jìn)行srm/mrm測(cè)定，但通常認(rèn)為對(duì)于srm/mrm測(cè)定而言最有利的儀器平臺(tái)是三重四極質(zhì)譜儀器平臺(tái)。
一旦在所采用的條件下在單一裂解物的單一ms分析中鑒定出盡可能多的肽，則整理肽的列表并將其用于確定在該裂解物中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。對(duì)于多種liquidtissuetm裂解物重復(fù)該過程，并將非常大的肽列表整理成單一數(shù)據(jù)集。可將該類型的數(shù)據(jù)集視為代表可在分析的生物樣品類型中(蛋白酶消化之后)、特別是在生物樣品的liquidtissuetm裂解物中檢測(cè)到的肽，且因此包括諸如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的具體蛋白質(zhì)的肽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽被鑒定為可用于測(cè)定以下肽的絕對(duì)或相對(duì)含量：ent1(例如，ncbi登錄號(hào)q99808、seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7)，ercc1(例如，ncbi登錄號(hào)p07992、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16)，folr1(例如，ncbi登錄號(hào)p15328、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20)，rrm1(例如，ncbi登錄號(hào)p23921、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37)，topo1(例如，ncbi登錄號(hào)p11387、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56、seqidno：57、seqidno：58)，topo2a(例如，ncbi登錄號(hào)p11388、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101)和/或tubb3(例如，ncbi登錄號(hào)q13509、seqidno：102、seqidno：103)，其各自列于表1。那些肽各自在由福爾馬林固定、石蠟包埋的組織制備的liquidtissuetm裂解物中通過質(zhì)譜檢測(cè)。因此，表1中的各肽或那些肽的任意組合(例如，一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表1中那些肽)是用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的定量srm/mrm測(cè)定的候選物，包括直接在福爾馬林固定的患者或?qū)ο蠼M織中進(jìn)行測(cè)定。
表1
表1中列出的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽包括從包括前列腺、結(jié)腸和乳腺的不同人類器官的多種不同福爾馬林固定的組織的多種liquidtissuetm裂解物中檢測(cè)到的那些。那些肽各自被視為可用于福爾馬林固定的組織中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的定量srm/mrm測(cè)定。這些實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析表明，并沒有優(yōu)先觀察到來自任何特定器官位點(diǎn)的任何特定肽。因此，這些肽中的每一種都被認(rèn)為是適合對(duì)來自來源于任何生物樣品或體內(nèi)的任何器官位點(diǎn)的任何福爾馬林固定的組織的liquidtissuetm裂解物進(jìn)行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm測(cè)定。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，srm/mrm測(cè)定使用topo2a和topo1各自的一種或兩種肽(例如，來自表1中列舉的肽)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，srm/mrm測(cè)定使用ent1、ercc1、folr1、rrm1和/或tubb3各自的一種或兩種肽(例如，來自表1中列舉的肽)。
在其他實(shí)施方式中，使用srm/mrm測(cè)定測(cè)量ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N并測(cè)定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的一種、兩種、三種或四種。在這類實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)施例中，通過srm/mrm測(cè)定測(cè)量folr1、rrm1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N的至少一種肽或至少兩種肽(例如表1中列舉的folr1、rrm1肽)；且測(cè)定ent1、ercc1、tubb3、topo1和/或topo2a中任意一種、兩種、三種或四種的至少一種肽或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。在這類實(shí)施方式的另一個(gè)實(shí)施例中，通過srm/mrm測(cè)定測(cè)量ent和rrm1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N的至少一種或至少兩種肽(例如表1中列舉的肽)；且測(cè)定ercc1、folr1、tubb3、topo1和/或topo2a中任一種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。本發(fā)明提供了包含肽的組合物，這些肽經(jīng)同位素標(biāo)記但其他均與本發(fā)明提供的這些實(shí)施方式中任一種所示的一種或多種肽相同，且下文描述了其制備物應(yīng)用，特別是用作質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)品。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過不依賴質(zhì)譜的方法測(cè)定一種或多種表1中的肽或那些肽的任意組合(例如，一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種)，該方法包括但不限于免疫方法(例如western印記或elisa)。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用福爾馬林固定的組織進(jìn)行測(cè)定。無論如何獲得涉及肽(絕對(duì)或相對(duì))含量的信息，該信息均可用于本發(fā)明所述任意方法，包括顯示(診斷)患者或?qū)ο笾邪┌Y的存在、確定癌癥的階段/等級(jí)/狀態(tài)、提供預(yù)后，或確定針對(duì)患者或?qū)ο蟮闹委焺┗蛑委煼桨浮?/p>
在其他實(shí)施方式中，通過不依賴質(zhì)譜的方法測(cè)定ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N，并測(cè)定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的一種、兩種、三種或四種，該方法包括但不限于免疫方法(例如western印記或elisa)。在這類實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定了ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的ent1和ercc1肽)；且測(cè)定了folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的任意一種、兩種、三種或四種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。在這類實(shí)施方式的另一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定了folr1和rrm1蛋白質(zhì)之一或全部?jī)煞N的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的folr1和rrm1肽)；且測(cè)定了ent1、ercc1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)中任一種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。
在進(jìn)行srm/mrm測(cè)定時(shí)一個(gè)重要的考慮因素為可用于肽分析的儀器的類型。盡管可在包括maldi、離子阱或三重四極質(zhì)譜儀的任何類型的質(zhì)譜儀上開發(fā)并進(jìn)行srm/mrm測(cè)定，但目前用于srm/mrm測(cè)定的最有利的儀器平臺(tái)通常被認(rèn)為是三重四極儀器平臺(tái)。該類型的質(zhì)譜常被視作最適用于分析可由來自細(xì)胞內(nèi)含有的所有蛋白質(zhì)的數(shù)萬至數(shù)百萬個(gè)單個(gè)肽組成的很復(fù)雜的蛋白質(zhì)裂解物內(nèi)的單個(gè)分離的靶標(biāo)肽。
為了對(duì)來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的各種肽最有效地實(shí)施srm/mrm測(cè)定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。該額外信息可用于引導(dǎo)并指導(dǎo)質(zhì)譜(例如，三重四極質(zhì)譜)對(duì)特異性靶標(biāo)肽進(jìn)行正確且集中的分析，從而可有效地進(jìn)行測(cè)定。
關(guān)于靶標(biāo)肽總體和關(guān)于特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息可包括各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子和各過渡離子的離子類型中的一種、兩種、三種、四種或更多種?？捎糜陂_發(fā)針對(duì)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm測(cè)定的額外肽信息示于表2中，其針對(duì)表1中列舉的十二(12)種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽?？芍苽?、獲得針對(duì)表2中顯示的肽進(jìn)行描述的該額外信息并將其應(yīng)用到來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的任意其它肽的分析中，包括通過其他蛋白酶或蛋白酶組合(例如胰蛋白酶和/或lysc)生成的那些肽。
表2
在一些實(shí)施方式中，適用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的測(cè)定的肽(例如表1所示和sedidno.1-103所示的肽)可含有肽序列內(nèi)部的額外蛋白水解位點(diǎn)，其在被切割時(shí)將生成子肽(sub-peptide)。這類子肽可通過評(píng)估針對(duì)所需蛋白酶的蛋白水解切割位點(diǎn)的經(jīng)鑒定肽的序列來識(shí)別。在一個(gè)實(shí)施方式中，胰蛋白酶肽可包括額外的內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)，其可在由胰蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步切割后生成子肽。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，胰蛋白酶肽可含有蛋白酶的內(nèi)部位點(diǎn)，該蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc，其可導(dǎo)致在由胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc中的任意一種、兩種或更多種切割后形成子肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，lysc肽可含有其他蛋白酶的內(nèi)部位點(diǎn)，該其他蛋白酶是例如gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶，其可導(dǎo)致在由gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶中的任意一種、兩種或更多種切割后形成子肽。應(yīng)理解，這類子肽，且具體而言是seqidno.1-103所示肽中任意一種或多種的胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc切割片段，列入且包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明所列實(shí)施方式包括組合物，其包含一種或多種表1和2中的肽且可任選地包含經(jīng)同位素標(biāo)記但其他方面與一種或多種表1和2中的肽相同的肽。在一些實(shí)施方式中，這些組合物包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或全部一百零三(103)種表1和2中的肽。這類組合物可任選地包括肽、多肽或蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含經(jīng)同位素標(biāo)記但其他方面與一種或多種表1和表2中的肽相同的肽。使用包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種表1和2中肽的經(jīng)同位素標(biāo)記的合成或天然肽、多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白酶處理釋放經(jīng)同位素標(biāo)記但其他方面與表1和2中的肽相同的肽。
例如，可使用同位素標(biāo)記的氨基酸在程序化的細(xì)胞裂解物或組織培養(yǎng)物中制備這類同位素標(biāo)記的生物或生物合成肽。各同位素標(biāo)記的肽可使用一種或多種同位素標(biāo)記，這些同位素獨(dú)立地選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合。無論是否經(jīng)同位素標(biāo)記，包含來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽的組合物均無需含有所有來自該蛋白質(zhì)的肽(例如完整的胰蛋白酶肽組)。在一些實(shí)施方式中，這些組合物不含有來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的組合形式的所有肽，且具體而言不含有所有表1和表2中出現(xiàn)的肽。包含肽的組合物可以是干燥或凍干的材料、液體(如水性)溶液或懸浮液、陣列或印記的形式。
在一個(gè)實(shí)施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的lysc蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。在一個(gè)實(shí)施方式中，來自各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的單個(gè)胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解肽以及相關(guān)額外信息被用于診斷確定(diagnosticdetermination)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的具體實(shí)施方式如下。
1.一種測(cè)量生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平的方法，包括使用質(zhì)譜檢測(cè)和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量；并計(jì)算所述樣品中修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平；且所述含量是相對(duì)含量或絕對(duì)含量。
2.實(shí)施方式1的方法，還包括在檢測(cè)和/或定量一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量前對(duì)所述蛋白質(zhì)消化物進(jìn)行分級(jí)的步驟。
3.實(shí)施方式2的方法，其中所述分級(jí)步驟選自凝膠電泳、液相色譜、毛細(xì)管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜。
4.實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品的所述蛋白質(zhì)裂解物通過liquidtissuetm方案制備。
5.實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)消化物包括蛋白酶消化物。
6.實(shí)施方式5的方法，其中所述蛋白質(zhì)消化物包括胰蛋白酶和/或lysc消化物。
7.實(shí)施方式1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述質(zhì)譜包括串聯(lián)質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、三重四極質(zhì)譜、maldi-tof質(zhì)譜、maldi質(zhì)譜和/或飛行時(shí)間質(zhì)譜。
8.實(shí)施方式7的方法，其中使用的質(zhì)譜模式是選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(srm)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)和/或多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(msrm)，或其任意組合。
9.實(shí)施方式1-8中任一項(xiàng)的方法，其中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103所示的氨基酸序列。
10.實(shí)施方式1-9中任一項(xiàng)的方法，其中該生物樣品是血液樣品、尿樣品、血清樣品、腹水樣品、疲液樣品、淋巴液、唾液樣品、細(xì)胞或?qū)嶓w組織。
11.實(shí)施方式1-10中任一項(xiàng)的方法，其中該生物樣品是福爾馬林固定的組織。
12.實(shí)施方式1-11中任一項(xiàng)的方法，其中該生物樣品是石蠟包埋的組織。
13.實(shí)施方式1-12中任一項(xiàng)的方法，其中該生物樣品是獲自腫瘤的組織。
14.實(shí)施方式13的方法，其中該腫瘤是原發(fā)性腫瘤。
15.實(shí)施方式13的方法，其中該腫瘤是繼發(fā)性腫瘤。
16.實(shí)施方式1-15中任一項(xiàng)的方法，還包括定量修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽。
17(a).實(shí)施方式1-16中任一項(xiàng)的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括比較一種生物樣品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的約8至約45各氨基酸殘基的氨基酸序列的一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量與不同和單獨(dú)的樣品或生物樣品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量。
17(b).實(shí)施方式1-16中任一項(xiàng)的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括比較一種生物樣品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的約8至約45個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量與不同和單獨(dú)的樣品或生物樣品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量，所述片段肽示于seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103。
18.實(shí)施方式17(a)或17(b)的方法，其中定量一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括通過與添加的已知含量的內(nèi)標(biāo)肽比較來測(cè)定生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽中每一種的含量，其中該生物樣品中的各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽與具有相同氨基酸序列的添加的內(nèi)標(biāo)肽相比較。
19.實(shí)施方式18的方法，其中該內(nèi)標(biāo)肽是同位素標(biāo)記的肽。
20.實(shí)施方式19的方法，其中該同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽包含選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合的一種或多種重穩(wěn)定同位素。
21.實(shí)施方式1-20中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量表示存在修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及與患者或?qū)ο笾邪┌Y的相關(guān)性。
22.實(shí)施方式21的方法，還包括關(guān)聯(lián)所述檢測(cè)和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量的結(jié)果與癌癥的診斷階段/等級(jí)/狀態(tài)。
23.實(shí)施方式22的方法，其中關(guān)聯(lián)所述檢測(cè)和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量的結(jié)果與癌癥的診斷階段/等級(jí)/狀態(tài)與檢測(cè)和/或定量其他蛋白質(zhì)或來自其他蛋白質(zhì)的肽的含量以多重方式聯(lián)用，從而提供關(guān)于癌癥的診斷階段/等級(jí)/狀態(tài)的額外信息。
24.實(shí)施方式1-23中任一項(xiàng)的方法，還包括針對(duì)患者或?qū)ο筮x擇治療，所述生物樣品獲自所述患者或?qū)ο?，所述治療基于一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的存在、不存在或含量或者ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量。
25.實(shí)施方式1-24中任一項(xiàng)的方法，還包括向患者或?qū)ο蠼o予治療有效量的治療劑，所述生物樣品獲自所述患者或?qū)ο螅渲薪o予的治療劑和/或治療劑的含量基于一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量。
26.實(shí)施方式24和25的方法，其中該治療或該治療劑針對(duì)表達(dá)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞。
27.實(shí)施方式1-27的方法，其中該生物樣品是經(jīng)處理的福爾馬林固定的腫瘤組織，所述處理用于使用liquidtissuetm方案和試劑定量一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量。
28.實(shí)施方式1-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽是一種或多種表1中的肽。
29.一種組合物，其包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表1中的肽和/或其抗體。
30.實(shí)施方式30的組合物，其包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表2中的肽和/或其抗體。
示例性srm/mrm測(cè)定方法
下文所述的方法用于：1)鑒定可用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的基于質(zhì)譜的srm/mrm測(cè)定的來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的候選肽，2)針對(duì)來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的靶標(biāo)肽開發(fā)單個(gè)srm/mrm測(cè)定或多種srm/mrm測(cè)定，和3)將定量測(cè)定應(yīng)用于癌癥診斷和/或最佳療法的選擇。
1.ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm候選片段肽的鑒定：
a.使用一種或多種蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白質(zhì)，從而由福爾馬林固定的生物樣品制備liquidtissuetm蛋白質(zhì)裂解物
b.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的所有片段肽，其中單個(gè)片段肽不含任何諸如磷酸化或糖基化的肽修飾
c.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自帶有諸如磷酸化或糖基化殘基的肽修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的所有片段肽
d.可測(cè)量由完整的全長(zhǎng)ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)通過具體消化方法可能產(chǎn)生的所有肽，但用于開發(fā)srm/mrm測(cè)定的優(yōu)選肽為在由福爾馬林固定的生物樣品制備的復(fù)雜liquidtissuetm蛋白質(zhì)裂解物中通過質(zhì)譜直接鑒定的那些
e.在分析來自福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissuetm裂解物時(shí)將在患者或?qū)ο蠼M織中特異性修飾(磷酸化、糖基化等)并在質(zhì)譜中電離化且因此可被檢測(cè)的肽鑒定為用于測(cè)定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽修飾的候選肽
2.來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的質(zhì)譜測(cè)定
a.將針對(duì)liquidtissuetm裂解物中鑒定的單個(gè)片段肽的三重四極質(zhì)譜上的srm/mrm測(cè)定應(yīng)用于來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽
i.針對(duì)包括但不限于以下實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件確定片段肽的最佳保留時(shí)間：凝膠電泳、液相色譜、毛細(xì)管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜
ii.確定肽的單同位素質(zhì)量、各肽的前體電荷狀態(tài)、各肽的前體m/z值、各肽的m/z過渡離子和各片段肽的各過渡離子的離子類型以開發(fā)用于各肽的srm/mrm測(cè)定。
iii.隨后可使用來自(i)和(ii)的信息在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行srm/mrm測(cè)定，其中各肽均具有特征性且獨(dú)特的srm/mrm特征峰，該特征峰精確地限定在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行的獨(dú)特的srm/mrm測(cè)定
b.進(jìn)行srm/mrm分析使得來自srm/mrm質(zhì)譜分析的獨(dú)特srm/mrm特征峰面積的函數(shù)形式的所檢測(cè)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的含量可指示特定蛋白質(zhì)裂解物中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的相對(duì)含量和絕對(duì)含量。
iv.相對(duì)定量可通過以下實(shí)現(xiàn)：
1.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissuetm裂解物中檢測(cè)到的給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與來自至少第二、第三、第四或更多的福爾馬林固定的生物樣品的至少第二、第三、第四或更多的liquidtissue裂解物中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽的相同srm/mrm特征峰面積
2.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissue裂解物中檢測(cè)到的給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與由來源于不同且單獨(dú)的生物來源的其它樣品中的其它蛋白質(zhì)的片段肽發(fā)展的srm/mrm特征峰面積，其中針對(duì)肽片段的兩種樣品之間的srm/mrm特征峰面積的比較標(biāo)準(zhǔn)化至各樣品中分析的蛋白質(zhì)的含量。
3.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與來自福爾馬林固定的生物樣品的相同liquidtissue裂解物內(nèi)的不同蛋白質(zhì)來源的其它片段肽的srm/mrm特征峰面積，從而將ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的變化水平標(biāo)準(zhǔn)化至多種細(xì)胞條件下都不改變其表達(dá)水平的其它蛋白質(zhì)的水平。
4.這些測(cè)定可應(yīng)用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以與確定未修飾的肽的相對(duì)含量相同的方式確定修飾的肽的相對(duì)水平。
v.給定肽的絕對(duì)定量可通過比較以下數(shù)值來實(shí)現(xiàn)：來自單個(gè)生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的給定片段肽的srm/mrm特征峰面積與摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的srm/mrm特征峰面積
1.內(nèi)標(biāo)物為測(cè)量中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標(biāo)記的合成形式。將該標(biāo)準(zhǔn)物以已知量摻入樣品中，并可單獨(dú)地確定生物樣品中的天然肽片段和內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的srm/mrm特征峰面積，接著比較兩個(gè)峰面積
2.這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中這些修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以與確定未修飾的肽的絕對(duì)水平相同的方式來確定修飾的肽的絕對(duì)水平。
3.將片段肽定量應(yīng)用于癌癥診斷和治療
a.進(jìn)行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對(duì)和/或絕對(duì)定量并說明證實(shí)了患者或?qū)ο竽[瘤組織中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達(dá)與階段/等級(jí)/狀況的先前確定的關(guān)聯(lián)性，如同在癌癥領(lǐng)域中充分理解的那樣
b.進(jìn)行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對(duì)和/或絕對(duì)定量并說明與來自不同治療策略的臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，其中該關(guān)聯(lián)性已經(jīng)在該領(lǐng)域中說明或可在將來說明(通過針對(duì)患者或?qū)ο笕夯騺碜阅切┗颊呋驅(qū)ο蟮慕M織的關(guān)聯(lián)性研究)。一旦通過該測(cè)定證實(shí)了先前確立的關(guān)聯(lián)性或?qū)淼贸龅年P(guān)聯(lián)性，則該測(cè)定方法可用于確定最佳治療策略
內(nèi)標(biāo)物可以是來自正被測(cè)量的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標(biāo)記合成形式(或包含蛋白水解后釋放的片段肽的經(jīng)標(biāo)記合成形式的蛋白質(zhì)或多肽)。該標(biāo)準(zhǔn)物以已知含量摻入樣品中，且可單獨(dú)確定生物樣品中內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物和天然片段肽的srm/mrm特征峰面積，隨后比較這兩個(gè)峰面積。這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且可以與測(cè)定未修飾肽的絕對(duì)水平相同的方式測(cè)定修飾的肽的絕對(duì)水平。
通過在離子阱和三重四極質(zhì)譜上分析所有肽來開發(fā)特定肽相關(guān)的特定且獨(dú)特的特性。該信息包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、該前體的過渡m/z值和各鑒定的過渡離子的離子類型。該信息必須針對(duì)在來自福爾馬林固定的樣品/組織的liquidtissue裂解物中直接存在的每個(gè)和每一個(gè)候選srm/mrm肽通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定；原因在于，有趣的是，并非所有來自蛋白質(zhì)的肽都可使用本發(fā)明所述的srm/mrm在這類裂解物中檢測(cè)，表明未檢測(cè)的肽無法被視為開發(fā)用于定量來自福爾馬林固定的樣品/組織的liquidtissue裂解物中直接存在的肽/蛋白質(zhì)的srm/mrm測(cè)定的候選肽。
在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行特定肽的具體srm/mrm測(cè)定。通過具體的srm/mrm測(cè)定分析的實(shí)驗(yàn)樣品是例如從福爾馬林固定和石蠟包埋的組織中制備的liquidtissue蛋白質(zhì)裂解物。來自這類測(cè)定的數(shù)據(jù)顯示存在針對(duì)福爾馬林固定的樣品中該肽的獨(dú)特srm/mrm特征峰。
該肽的特定過渡離子特性被用于定量測(cè)量福爾馬林固定的生物樣品中具體的肽。這些數(shù)據(jù)顯示該肽的絕對(duì)含量，顯示為每微克所分析蛋白質(zhì)裂解物中肽的摩爾含量的函數(shù)形式。
基于福爾馬林固定的患者來源或?qū)ο髞碓唇M織的分析進(jìn)行的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的評(píng)估可提供涉及具體患者或?qū)ο蟮脑\斷、預(yù)后和治療上相關(guān)的信息。本發(fā)明描述了一種測(cè)量生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的方法，包括使用質(zhì)譜檢測(cè)和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量；和計(jì)算所述樣品中修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平；且其中所述水平是相對(duì)水平或絕對(duì)水平。在相關(guān)的實(shí)施方式中，定量一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括通過與添加的已知含量的內(nèi)標(biāo)肽相比較來測(cè)定生物樣品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量，其中該生物樣品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽與具有相同氨基酸序列的內(nèi)標(biāo)肽相比較。在一些實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物是同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽，其包含一種或多種選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合的重穩(wěn)定同位素。
本發(fā)明所述的測(cè)定生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)(或作為其替代物的片段肽)的水平的方法可用作患者或?qū)ο笾邪┌Y的診斷學(xué)指示物。在一個(gè)實(shí)施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的測(cè)量結(jié)果可用于確定癌癥的診斷階段/等級(jí)/狀態(tài)，方法為關(guān)聯(lián)(如比較)組織中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平與正常和/或癌性或癌前組織中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平。
僅有的正在使用的檢測(cè)福爾馬林固定的患者樣品中特定蛋白質(zhì)水平的方法是免疫組化(ihc)。該方法在來自患者腫瘤組織樣品的單個(gè)組織切片上一次僅分析一種蛋白質(zhì)。因此，為分析多種蛋白質(zhì)樣品，必須同時(shí)測(cè)量多個(gè)組織切片，這費(fèi)時(shí)且費(fèi)力。ihc使用抗體檢測(cè)靶蛋白質(zhì)的存在，且任何ihc實(shí)驗(yàn)中都因?yàn)榭贵w與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的潛在可能性而存在巨大的固有潛在信號(hào)背景。此外，ihc充其量不過是半定量的。由于這些問題，ihc無法同時(shí)提供多種蛋白質(zhì)的客觀定量分析。當(dāng)前的實(shí)施方式能夠使用單個(gè)患者組織樣品切片以100％測(cè)定特異性同時(shí)提供ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的客觀定量，在節(jié)約大量時(shí)間和金錢的同時(shí)提供更富有價(jià)值的涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)據(jù)。
該多重srm/mrm測(cè)定還可包括在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以外同時(shí)分析其他額外蛋白質(zhì)，包括藥物靶蛋白質(zhì)如egfr、igf-1r和cmet。這是有價(jià)值的，因?yàn)轭~外蛋白質(zhì)的分析還顯示哪些額外蛋白質(zhì)可用于治療具體癌癥。基于額外示例性藥物靶蛋白質(zhì)分析的額外蛋白質(zhì)的示例包括靶向egfr受體的愛必妥(erbitux)、靶向igf-1r的figitumumab，以及靶向c-met和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vegfr-2)的foretinib。
因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)兩者都可由相同的liquidtissuetm生物分子制備物分析，所以可以由用于蛋白質(zhì)分析的相同樣品中的核酸生成關(guān)于疾病診斷和藥物治療決定的額外信息。例如，如果ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)由某些細(xì)胞以增加的水平表達(dá)，當(dāng)通過srm測(cè)定時(shí)，數(shù)據(jù)可提供關(guān)于細(xì)胞的狀態(tài)及其不受控制地生長(zhǎng)的潛在性、潛在的抗藥性和癌癥發(fā)展的信息。同時(shí)，可從相同的liquidtissuetm生物分子制備物中存在的核酸中獲得關(guān)于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a基因和/或核酸及其編碼的蛋白質(zhì)的狀況的信息(例如，mrna分子及其表達(dá)水平或剪接變化)，可在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm分析的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)?？稍趀nt1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm分析的同時(shí)對(duì)不來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a且存在于相同生物分子制備物中的任何基因和/或核酸進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方式中，關(guān)于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和/或一種、兩種、三種、四種或更多種額外的蛋白質(zhì)的信息可通過檢查編碼那些蛋白質(zhì)的核酸來評(píng)價(jià)。那些核酸可例如通過以下方法中的一種或多種、兩種或更多種或三種或更多種檢查：測(cè)序方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、限制性片段多態(tài)性分析、插入、缺失的鑒定，和/或是否存在突變的確定，包括但不限于單堿基對(duì)多態(tài)性、轉(zhuǎn)換、顛換或其組合。
上述說明書以及方法和組合物的示例性實(shí)施方式說明了本發(fā)明的范圍。然而，由于變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的，本發(fā)明不限于上文所述的具體實(shí)施方式。
序列表
<110>愛科譜迅病理研究公司(expressionpathologyinc)
<120>針對(duì)化療靶標(biāo)的srm測(cè)定
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2025