衍生化HPLC-DAD法測定藥物中小分子鹵代羧酸的方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于藥品分析檢測領(lǐng)域，涉及衍生化HPLC-DAD法測定小分子鹵代羧酸的方法，尤其涉及衍生化HPLC-DAD法測定藥物中小分子鹵代羧酸的方法。

背景技術(shù)：
小分子鹵代羧酸(Halogenatedcarboxylicacids,HCAs)，作為水環(huán)境中主要的消毒副產(chǎn)物，由于具有潛在的基因毒性和致癌性[1,2]，很早就受到了許多環(huán)境監(jiān)管部門包括美國環(huán)境保護(hù)局(USEPA)[3]、世界衛(wèi)生組織(WHO)[4]等的普遍關(guān)注，并被列為水質(zhì)研究的常規(guī)監(jiān)測指標(biāo)之一。在醫(yī)藥工業(yè)中，這類化合物因具有較高的反應(yīng)活性以及特殊的生理活性(由鹵元素引入)[5]，經(jīng)常被用作有機(jī)合成中活潑的酰化劑或烷化劑，在農(nóng)藥、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[6-13]，例如，氯乙酸可用于合成維生素B6、他達(dá)拉非、腎上腺素等的中間體；2-氯丙酸常用作布洛芬綠色生產(chǎn)工藝的起始原料；溴乙酸和溴丙酸類常用于除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的制備。除了工業(yè)生產(chǎn)外，藥物儲藏過程中受外界條件影響也會產(chǎn)生鹵代羧酸，比如氯霉素降解生成二氯乙酸[14]。因此這類化合物往往容易在藥品中殘留，過量攝入可能對人體造成危害。目前國際上普遍采用毒理學(xué)關(guān)注閾值(thresholdoftoxicologicalconcern,TTC)來對基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行限度控制[15-17]?；蚨拘噪s質(zhì)的限度通常較低，因此需要建立高靈敏的分析方法對藥品中的這類化合物進(jìn)行監(jiān)控。現(xiàn)今，大多數(shù)文獻(xiàn)報道的方法都是針對于測定水環(huán)境中的鹵乙酸(Haloaceticacids,HAAs)。美國環(huán)保局(USEPA)將氣相色譜串聯(lián)電子捕獲檢測器(GC-ECD)列為檢測水環(huán)境中鹵乙酸的標(biāo)準(zhǔn)方法[18-21]，該方法需要將待測物衍生化成可揮發(fā)性的酯類，然后液液萃取富集，方能進(jìn)行分析。離子色譜法(IC)[22,23]和反相高效液相色譜法(RP-LC)[24,25]等液相色譜方法，結(jié)合電化學(xué)檢測器(ECD)或紫外檢測器(UV,210nm)被報道用于分析水樣中的鹵乙酸。這些方法往往需要繁瑣的柱前濃縮和清潔操作才能獲得足夠的專屬性和靈敏度。質(zhì)譜法(MS)，包括親水作用色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS)[26]、GC-MS[27,28]、LC-MS[29,30]和IC-MS[31,32]等也被廣泛用于測定飲用水中的鹵乙酸的含量。雖然質(zhì)譜檢測器是一種靈敏和通用的檢測器，然而高昂的價格限制了它的推廣使用。相比于水樣分析，測定藥物中殘留的小分子鹵代羧酸面臨著更多的挑戰(zhàn)[14,16,33]。首先藥品基質(zhì)的復(fù)雜性遠(yuǎn)高于水樣，尤其含有大量與小分子鹵代羧酸性質(zhì)相似的有機(jī)小分子，因此要求分析方法具備高度的專屬性[16,33]，這樣才能有效減少干擾；另一個問題是藥物本身在操作過程中容易受到外界因素影響降解生成新的小分子鹵代羧酸[14]影響測定的結(jié)果，為此前處理條件越簡單、溫和對結(jié)果的準(zhǔn)確性越有利?？紤]到上述事實，我們希望通過液相衍生化技術(shù)來改善這些問題。液相衍生化技術(shù)通過化學(xué)反應(yīng)給待測物引入特定的基團(tuán)，不僅可以提高檢測靈敏度，還能改善待測物的分離效果，特別適合于小分子極性物質(zhì)的定性定量分析[34]。SimoneJr等[35]采用柱后熒光衍生化對飲用水中的鹵乙酸進(jìn)行測定，以煙酰胺為其衍生化試劑，通過實驗室自制的自動化儀器裝置以實現(xiàn)衍生化。然而特定的裝置不僅增加了實驗成本，而且難以推廣用于常規(guī)藥物分析。Ghassempour等人[36]建立了柱前衍生化-HPLC法對甜菜堿樣品氯乙酸和二氯乙酸進(jìn)行測定。此方法使用1-萘胺作為衍生化試劑，90℃下反應(yīng)30min，隨后220nm波長下檢測。這方法的主要缺陷是：一方面，高溫容易產(chǎn)生降解雜質(zhì)[37]；另一方面，低波長下檢測基線噪音大，干擾嚴(yán)重[38]。硝基苯肼(Nitro-substitutedphenylhydrazines,NPHs)是經(jīng)典的羧酸類衍生化試劑[38-45]。相比于苯胺類，這類試劑的羧酸衍生化產(chǎn)物由于苯環(huán)上硝基吸電子基團(tuán)的存在,紫外吸收帶出現(xiàn)明顯的紅移效應(yīng)[39-41]。大多數(shù)藥物及其雜質(zhì)在近可見光區(qū)(400nm)紫外吸收很弱，所以在此波長處進(jìn)行測定可以大大提高方法的專屬性，簡化色譜分離條件。2-硝基苯肼(2-NPH)[38-43]、3-硝基苯肼(3-NPH)[44]、4-硝基苯肼(4-NPH)[45]和2，4-二硝基苯肼(2，4-DNPH)[43]是目前報道的常用的商品化硝基苯肼類衍生化試劑，但是關(guān)于這類試劑的系統(tǒng)比較還未有報道。Noonan等[38]人曾用2-硝基苯肼作為衍生化試劑，在吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的催化活化下，成功對食物中的氟乙酸進(jìn)行了衍生化。這篇文章主要側(cè)重在LC-MS的應(yīng)用，未有對其產(chǎn)物的紫外吸收特性進(jìn)行深入挖掘。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員無法由該現(xiàn)有技術(shù)公開的信息推測是否可以使用HPLC-DAD對氟乙酸衍生化物進(jìn)行定性或定量檢測。研究表明羧酸和胺基反應(yīng)需要經(jīng)過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,EDC·HCl)的活化方能進(jìn)行，而活化過程經(jīng)常加入吡啶作為催化劑[41]。因此，發(fā)明人最初選擇EDC·HCl和吡啶作為催化體系來加速酰肼合成，并成功實現(xiàn)了氯乙酸的衍生化；然而，當(dāng)將這一條件擴(kuò)展到其他檢測對象時，衍生化產(chǎn)物出現(xiàn)了異常的不穩(wěn)定。我們發(fā)現(xiàn)常用的催化劑吡啶容易造成α-鹵代衍生物的脫鹵現(xiàn)象。通過調(diào)整反應(yīng)溫度、體系pH值以及改變硝基苯肼的類型均不能有效解決上述問題，這大大妨礙了該方法的推廣應(yīng)用。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)衍生過過程中還會發(fā)生氯代反應(yīng)，且氯代反應(yīng)與體系中存在的大量鹽酸鹽有關(guān)，而鹽酸鹽主要來源于體系中的EDC·HCl和2-NPH·HCl。盡管可以通過減少鹽酸鹽的用量來降低氯代反應(yīng)發(fā)生的概率，但是卻不能遏止脫氯反應(yīng)發(fā)生。加上目前商品化的試劑均是含有鹽酸鹽的，不含鹽酸鹽的EDC和2-NPH溶解性差，綜合考慮，僅僅通過降低活化劑和衍生化試劑的濃度是無法有效改善衍生物穩(wěn)定性的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供衍生化HPLC-DAD法測定小分子鹵代羧酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供衍生化HPLC-DAD法測定藥品中小分子鹵代羧酸的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：衍生化HPLC-DAD法測定小分子鹵代羧酸的方法，包含以下步驟：(1)在常溫下，使用硝基苯肼類衍生化試劑對小分子鹵代羧酸衍生化生成在紫外可見光區(qū)(320-450nm)有較強(qiáng)的吸收的產(chǎn)物；(2)以步驟(1)中衍生化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液作為進(jìn)樣樣品，利用HPLC反相分配色譜法在紫外可見光區(qū)(320-450nm)測定其中鹵代羧酸的衍生化產(chǎn)物，從而實現(xiàn)對小分子鹵代羧酸的定性或定量檢測。所述的衍生化HPLC-DAD法測定小分子鹵代羧酸的方法，優(yōu)選包含以下步驟：(1)在常溫下，以乙腈-水為反應(yīng)體系，以碳二亞胺類偶聯(lián)劑的鹽酸鹽為活化劑，使用硝基苯肼類衍生化試劑對小分子鹵代羧酸衍生化反應(yīng)生成在330～420nm有較強(qiáng)的吸收的產(chǎn)物；(2)以步驟(1)中衍生化反應(yīng)產(chǎn)物，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色譜法原理在330～420nm測定其中鹵代羧酸的衍生化產(chǎn)物，從而實現(xiàn)對小分子鹵代羧酸的定性或定量檢測。其中，所述的小分子鹵代羧酸優(yōu)選自鹵素取代的C1～C6的羧酸，進(jìn)一步優(yōu)選鹵素取代的C1～C4的羧酸，更進(jìn)一步優(yōu)選氯乙酸、溴乙酸、二氯乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸或2-溴丙酸中的任意一種。所述的碳碳二亞胺類偶聯(lián)劑優(yōu)選自二環(huán)己基碳二亞胺，N,N'-二異丙基碳二亞胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺中的任意一種；進(jìn)一步優(yōu)選1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。硝基苯肼類衍生化試劑優(yōu)選自2-硝基苯肼鹽酸鹽、3-硝基苯肼鹽酸鹽、4-硝基苯肼鹽酸鹽和2，4-二硝基苯肼中的任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選2-硝基苯肼鹽酸鹽。衍生化反應(yīng)的條件進(jìn)一步優(yōu)選以乙腈-水＝10：90～90:10(V：V)為反應(yīng)體系，2-硝基苯肼鹽酸鹽濃度為0.2～3mg/mL，EDC·HCl濃度為1～4mg/mL，反應(yīng)1～3h；更進(jìn)一步優(yōu)選常溫下，以乙腈-水＝70：30(V：V)為反應(yīng)體系，2-硝基苯肼鹽酸鹽濃度為1mg/mL，EDC·HCl2mg/mL，反應(yīng)時間為2h。所述的HPLC-DAD法優(yōu)選：采用HPLC色譜儀；采用反相分配色譜法；以非極性鍵合相為固定相，采用極性流動相，檢測波長位于320-450nm之間，進(jìn)一步優(yōu)選位于300～420nm之間，更進(jìn)一步優(yōu)選位于390～400nm之間。述的HPLC-DAD法更進(jìn)一步優(yōu)選使用的儀器為ShimadzuLC20AT液相色譜儀，該色譜儀配制有在線真空脫氣機(jī)、二元梯度泵，自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和LC-solution色譜工作站；色譜柱采用250mm×4.6mm,5μm的島津InertsilODS-3；進(jìn)樣量：20μL；流動相流速：1.0mL/min；流動相梯度：A相為乙腈，B相為0.1％磷酸，0min28％A相，10min40％A相，14min40％A相，20min55％A相；柱溫：40℃；檢測波長：392nm。本發(fā)明所述的方法可用于多種樣品中小分子鹵代羧酸的定性與定量檢測，優(yōu)選在測定藥物中小分子鹵代羧酸中的應(yīng)用。衍生化HPLC-DAD法測定藥物中小分子鹵代羧酸的方法，包含以下步驟：(1)常溫下，在碳二亞胺類偶聯(lián)劑的鹽酸鹽的活化作用下，使用2-硝基苯肼鹽酸鹽對待測藥物進(jìn)行衍生化反應(yīng)1～3h，反應(yīng)液作為樣品進(jìn)樣測定；所述的碳二亞胺類偶聯(lián)劑選自二環(huán)己基碳二亞胺，N,N'-二異丙基碳二亞胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺中的一種，優(yōu)選為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺；(2)以步驟(1)中衍生化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液作為進(jìn)樣樣品，利用HPLC-DAD法在320-450nm測定其中鹵代羧酸的衍生化產(chǎn)物，從而實現(xiàn)對藥物中小分子鹵代羧酸的定性或定量檢測。其中，其中，所述的小分子鹵代羧酸優(yōu)選自鹵素取代的C1～C6的羧酸，進(jìn)一步優(yōu)選鹵素取代的C1～C4的羧酸，更進(jìn)一步優(yōu)選氯乙酸、溴乙酸、二氯乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸或2-溴丙酸中的任意一種。衍生化反應(yīng)的條件優(yōu)選常溫下，以乙腈體積濃度為10％～90％的乙腈-水為反應(yīng)體系，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽濃度為1～4mg/mL，2-硝基苯肼鹽酸鹽濃度為0.2～3mg/mL，反應(yīng)時間為1～3h；所述的衍生化反應(yīng)的條件進(jìn)一步優(yōu)選以乙腈-水＝70：30(V：V)為反應(yīng)體系，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽2mg/mL，2-硝基苯肼鹽酸鹽濃度為1mg/mL，反應(yīng)時間為2h。步驟(2)中所述的HPLC-DAD法優(yōu)選采用HPLC色譜儀；采用反相分配色譜法；以非極性鍵合相為固定相，采用極性流動相，檢測波長位于320-450nm之間，優(yōu)選位于330～420nm之間，進(jìn)一步優(yōu)選位于390～400nm之間；所述的HPLC-DAD法優(yōu)選使用的儀器為ShimadzuLC20AT液相色譜儀，該色譜儀配制有在線真空脫氣機(jī)、二元梯度泵，自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和LC-solution色譜工作站；色譜柱采用250mm×4.6mm,5μm的島津InertsilODS-3；進(jìn)樣量：20μL；流動相流速：1.0mL/min；流動相梯度：A相為乙腈，B相為0.1％磷酸，0min28％A相，10min40％A相，14min40％A相，20min55％A相；柱溫：40℃；檢測波長：392nm。本發(fā)明所述的常溫是指常規(guī)的分析實驗進(jìn)行的溫度，通常為10～30℃之間均可。有益效果：本發(fā)明基于硝基苯肼類衍生化試劑的羧酸衍生化產(chǎn)物由于苯環(huán)上硝基吸電子基團(tuán)的存在,紫外吸收帶出現(xiàn)明顯的紅移效應(yīng)。而大多數(shù)藥物及其雜質(zhì)在近可見光區(qū)紫外吸收很弱，建立了一種簡單、通用的柱前衍生化HPLC-DAD測定小分子鹵代羧酸的方法。方法學(xué)驗證的結(jié)果顯示藥物中常見的有機(jī)酸和其他雜質(zhì)均不會對分析造成干擾，表明該方法專屬性良好。此外，方法的檢測限為0.02-0.05μg/mL,定量限為0.05-0.12μg/mL，線性關(guān)系良好(r>0.999)；日內(nèi)和日間精密度分別小于1.98％和4.39％；平均回收率在82.4-105.6％之間(RSD<4.30％)，無明顯的基質(zhì)干擾；且衍生化產(chǎn)物在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。針對衍生化過程中出現(xiàn)的脫氯反應(yīng)和氯代反應(yīng)，創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)，將吡啶從衍生化反應(yīng)的催化體系中剔除時可以避免脫氯反應(yīng)和氯代反應(yīng)的發(fā)生。基于此發(fā)現(xiàn)，對衍生化體系進(jìn)行了優(yōu)化，不僅能確保鹵代羧酸被完全衍生化，還能有效避免產(chǎn)物的降解。附圖說明圖1分別以2-硝基苯肼(A)、3-硝基苯肼(B)、4-硝基苯肼(C)、2,4-二硝基苯肼(D)作為衍生化試劑與氯乙酸反應(yīng)生成產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖。圖2用2-硝基苯肼對氯霉素(15mg/mL)中微量二氯乙酸(2.5μg/mL)進(jìn)行衍生化時得到的色譜圖(a-e代表不同檢測波長)：a.224nm,b.275nm,c.337nm,d.356nm,e.392nm。(Imp1-5代表氯霉素原料藥中所含的其他內(nèi)源性雜質(zhì))圖3相同條件下空白溶液(a)、甲酸(b)、乙酸(c)、三氟乙酸(d)、甲磺酸(e)、苯甲酸(f)、苯磺酸(g)、對甲苯磺酸(h)以及6種小分子鹵代羧酸(i)衍生化產(chǎn)物的色譜圖：(1)氯乙酸衍生物；(2)溴乙酸衍生物；(3)3-氯丙酸衍生物；(4)2-氯丙酸衍生物；(5)2-溴丙酸衍生物；(6)二氯乙酸衍生物；(7)三氟乙酸衍生物；(8)苯甲酸衍生物。有機(jī)酸的濃度均為1μg/mL。圖4反應(yīng)條件對鹵代羧酸衍生化的影響：(A)吡啶對鹵代羧酸衍生物穩(wěn)定性的影響；(B)體系中有機(jī)相比例對衍生化效率的影響；(C)2-硝基苯肼濃度對衍生化效率的影響；(D)反應(yīng)時間對衍生化效率的影響。B、C、D均是在無吡啶參與的條件下考察的結(jié)果。待測物的濃度均為1μg/mL。圖5用于驗證吡啶對衍生化穩(wěn)定性影響的典型色譜圖和質(zhì)譜圖：(A)在吡啶和EDC·HCl存在下單獨(dú)對二氯乙酸(a)和氯乙酸(b)進(jìn)行衍生化；(B)在吡啶和EDC·HCl存在下單獨(dú)對溴乙酸(d)和氯乙酸(b)進(jìn)行衍生化；(C)在吡啶和EDC·HCl存在下單獨(dú)對2-溴丙酸(f)和2-氯丙酸(g)進(jìn)行衍生化。c、e、h分別代表在沒有吡啶參與條件下單獨(dú)對二氯乙酸、溴乙酸和2-溴丙酸進(jìn)行衍生化。待測物濃度均為5μg/mL。具體實施方式1.1.儀器ShimadzuLC20AT液相色譜儀(含在線真空脫氣機(jī)、二元梯度泵，自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和LC-solution色譜工作站)；Aglient6520LC-TOF液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(含在線真空脫氣機(jī)、高壓二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器、電噴霧(ESI)接口和AgilentMassHunterAcquisitionSoftwareVer.A.01.00工作站)；METTLERTOLEDOAB135-S分析天平(梅特勒瑞典公司)；sartoriousBS110分析天平(北京賽多利斯有限公司)。1.2.試劑氯乙酸(98％)、溴乙酸(98％)、二氯乙酸(98％)、2-氯丙酸(97％)、2-溴丙酸(98％)、3-氯丙酸(98％)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(97％)、2-硝基苯肼鹽酸鹽(97％)、，3-硝基苯肼鹽酸鹽(98％)、4-硝基苯肼鹽酸鹽(98％)和2，4-二硝基苯肼(99.0％)、他達(dá)拉非(97％)、氯霉素(95％)、維生素B6(98％)、布洛芬(98％)、5-(哌嗪-1-基)苯并呋喃-2-甲酰胺(維拉佐酮中間體，99.2％)、6-羥基-3，4-二氫-2-喹啉酮(西洛他唑，99.5％)、甲霜靈(97％)、氯霉素滴眼液(8mL:20mg)。純化水，乙腈(TEDIA，色譜純)、磷酸(分析純)、甲酸(分析純)。1.3.溶液的制備各鹵代羧酸儲備液(以下簡稱HCA)：取適量HCA，精密稱定，置于10mL量瓶中，用70％乙腈稀釋至刻度線，搖勻即可。各儲備液室溫下8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2-硝基苯肼鹽酸鹽、3-硝基苯肼鹽酸鹽、4-硝基苯肼鹽酸鹽和2，4-二硝基苯肼試液(以下簡稱2-NPH·HCl，3-NPH·HCl，4-NPH·HCl和DNPH)：取各試劑約100mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，用80％乙腈稀釋至刻度，搖勻即可。需新鮮配制。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液(以下簡稱EDC·HCl)：取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽200mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，用60％乙腈稀釋至刻度，搖勻即可。需新鮮配制。1.4.衍生化實驗條件精密稱定適量藥品，或精密移取100μL鹵代羧酸對照品試液，置于5mL量瓶中，分別加入500μL衍生化試劑和500μLEDC·HCl溶液，加70％乙腈稀釋至刻度，渦旋10s，搖勻。避光反應(yīng)2h，搖勻，過濾后取20μL直接進(jìn)樣。實施例1以氯乙酸為代表，用相同濃度的4種硝基苯肼類衍生化試劑對其進(jìn)行衍生化。衍生化實驗條件見1.4。在相同的色譜條件下，用DAD掃描各衍生化產(chǎn)物，記錄產(chǎn)物的光譜圖和色譜圖，以產(chǎn)物的最大吸收波長和吸收強(qiáng)度來評價衍生化試劑的優(yōu)劣。圖1顯示，除了3-硝基苯肼外，其他三種衍生化試劑與氯乙酸生成的產(chǎn)物紫外吸收帶均呈現(xiàn)一定的紅移效應(yīng)，最大吸收波長分別為392nm(2-硝基苯肼)356nm(4-硝基苯肼)和337nm(2,4-二硝基苯肼)。本實驗理想的情況是在近可見光區(qū)(400nm)處進(jìn)行測定，可以使背景干擾降到最低，簡化色譜分離條件，提高方法專屬性[40,41]。從圖1來看，2-硝基苯肼產(chǎn)物的紅移效應(yīng)最明顯，其他鹵代羧酸衍生物也表現(xiàn)出類似的吸收特性。因此2-硝基苯肼最為合適；且從各產(chǎn)物的紫外吸收強(qiáng)度來看，2-硝基苯肼產(chǎn)物的吸收強(qiáng)度高于其他三種。故而，本發(fā)明選擇2-硝基苯肼進(jìn)行后續(xù)研究。在實際測樣中，由于大量藥物基底的存在，對微量的鹵代羧酸衍生化產(chǎn)物而言影響較大，若推廣使用則每個藥物都要建立一個色譜條件去分離藥物和雜質(zhì)，干擾多，靈敏度低(基線噪音大)。而使用2-硝基苯肼作為衍生化試劑時，由于大多數(shù)藥物及其雜質(zhì)在近可見光區(qū)(400nm)紫外吸收很弱，所以在此波長處進(jìn)行測定可以大大提高方法的專屬性，簡化色譜分離條件。例如，當(dāng)用2-硝基苯肼對氯霉素中的二氯乙酸進(jìn)行衍生化，并采用DAD記錄不同檢測波長下的色譜圖時(圖2)發(fā)現(xiàn)，相比于其他較短波長，392nm波長檢測下的色譜圖能夠提供更為平衡的基線和較少的雜質(zhì)吸收峰，有利于改善基線噪音，減少背景干擾，提高方法的專屬性和靈敏度[39,40]。這一事實作為2-硝基苯肼重要的優(yōu)勢在其他藥物身上也有體現(xiàn)。實施例2供試品溶液制備：精密稱定適量藥品，置于5mL量瓶中，分別加入500μL衍生化試劑和500μLEDC·HCl溶液，加70％乙腈稀釋至刻度，渦旋10s，搖勻，避光反應(yīng)2h，搖勻，即得供試品溶液。過濾后取20μL直接進(jìn)樣。對照品溶液制備：精密移取100μL不同濃度鹵代羧酸儲備液，置于5mL量瓶中，分別加入500μL衍生化試劑和500μLEDC·HCl溶液，加70％乙腈稀釋至刻度，渦旋10s，搖勻，避光反應(yīng)2h，搖勻，即得對照品溶液。過濾后取20μL直接進(jìn)樣。色譜條件：ShimadzuLC20AT液相色譜儀(含在線真空脫氣機(jī)、二元梯度泵，自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和LC-solution色譜工作站)；色譜柱：島津InertsilODS-3(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：乙腈(A相)-0.1％磷酸(B相)，梯度洗脫見表1，流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃；檢測波長：392nm。表1.梯度洗脫程序標(biāo)曲繪制方法：分別精密移取各對照品儲備液適量置于同一只5mL量瓶中，加70％乙腈稀釋至刻度，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度溶液。按1.4.項下方法進(jìn)行衍生化，取20μL注入液相色譜儀，測定各衍生化產(chǎn)物的峰面積。以鹵代羧酸濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，衍生化產(chǎn)物峰面積(A)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。定量方法：采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。實施例3按照實施例2的方法，對氯乙酸、溴乙酸、3-氯丙酸、2-氯丙酸、2-溴丙酸、二氯乙酸進(jìn)行考察。由圖3的i可知，在上述色譜條件下，6種鹵代羧酸衍生化產(chǎn)物與衍生化試劑、催化劑之間分離度較好?？紤]到藥物合成中常用的有機(jī)酸(甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、苯甲酸、苯磺酸和對甲苯磺酸)可能會與2-硝基苯肼發(fā)生反應(yīng)，所以本實驗在相同的條件下對這七種有機(jī)酸進(jìn)行考察，研究其與2-硝基苯肼生成的物質(zhì)是否干擾目標(biāo)物的測定。結(jié)果如圖3，這七種藥物合成中常用的有機(jī)酸衍生化后的產(chǎn)物在待測物的峰處沒有干擾，說明該方法的專屬性良好。實施例4研究表明羧酸和胺基反應(yīng)需要經(jīng)過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,EDC·HCl)的活化方能進(jìn)行，而活化過程經(jīng)常加入吡啶作為催化劑[41]。因此，本實驗最初選擇EDC·HCl和吡啶作為催化體系來加速酰肼合成，并成功實現(xiàn)了氯乙酸的衍生化；然而，當(dāng)將這一條件擴(kuò)展到其他檢測對象時，衍生化產(chǎn)物出現(xiàn)了異常的不穩(wěn)定。精密移取100μL鹵代羧酸對照品試液(50μg/mL)，置于5mL量瓶中，加入500μL衍生化試劑(10mg/mL)、500μLEDC·HCl溶液(20mg/mL)和20μL吡啶，加70％乙腈稀釋至刻度，渦旋10s，搖勻。避光反應(yīng)2h，搖勻，過濾后取20μL直接進(jìn)樣。圖4的A顯示，當(dāng)同時對6種鹵代羧酸進(jìn)行衍生化時，隨著反應(yīng)時間的增加，二氯乙酸、溴乙酸和2-溴丙酸的衍生物峰響應(yīng)呈現(xiàn)遞減趨勢，相應(yīng)地，氯乙酸和2-氯丙酸的衍生物峰響應(yīng)持續(xù)增加。為了闡明這一現(xiàn)象，我們單獨(dú)對各個鹵代羧酸進(jìn)行了衍生化，發(fā)現(xiàn)同時添加EDC·HCl和吡啶催化反應(yīng)時，二氯乙酸衍生物容易快速脫氯降解生成氯乙酸衍生物；而溴乙酸和2-溴丙酸衍生物容易脫溴發(fā)生氯代反應(yīng)形成氯乙酸和2-氯丙酸衍生物。此現(xiàn)象可從圖5的色譜保留時間和質(zhì)譜結(jié)果得到進(jìn)一步佐證。通過調(diào)整反應(yīng)溫度、體系pH值以及改變硝基苯肼的類型均不能有效解決上述問題，這大大妨礙了該方法的推廣應(yīng)用。實施例5由于缺少吡啶的催化，因此當(dāng)使用高濃度的活化劑EDC·HCl時(2mg/mL)，為了確保衍生化反應(yīng)快速進(jìn)行同時避免產(chǎn)物降解，需要對體系中有機(jī)相的比例、衍生化試劑的用量和反應(yīng)時間進(jìn)行考察。以生成的衍生化產(chǎn)物的峰面積為指標(biāo)，單因素考察了不同濃度的2-硝基苯肼鹽酸鹽(0.2、0.5、0.8、1.0、1.25mg/mL)、有機(jī)相的比例(10％、30％、50％、70％和90％)和反應(yīng)時間(1、2、3、5、7h)對衍生化反應(yīng)效率的影響。具體結(jié)果見圖4的B-D。實施例6方法學(xué)驗證與應(yīng)用6.1.專屬性專屬性試驗主要考察了藥物合成中常用的7種有機(jī)酸(甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、苯甲酸、苯磺酸和對甲苯磺酸)與2-硝基苯肼生成的物質(zhì)對目標(biāo)衍生物的干擾。結(jié)果如圖3，這七種羧酸衍生化后的產(chǎn)物在待測物的峰處沒有干擾，說明該方法的專屬性良好。6.2.線性與范圍分別精密移取各對照品儲備液適量置于同一只5mL量瓶中，加70％乙腈稀釋至刻度，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度溶液。按1.4.項下方法進(jìn)行衍生化，取20μL注入液相色譜儀，測定各衍生化產(chǎn)物的峰面積。以鹵代羧酸濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，衍生化產(chǎn)物峰面積(A)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，氯乙酸和2-氯丙酸線性范圍為0.05～0.5μg/mL，溴乙酸、二氯乙酸和3-氯丙酸線性范圍為0.08～0.8μg/mL，2-溴丙酸線性范圍為0.12～1.2μg/mL。且各待測物線性關(guān)系良好(r>0.999)。結(jié)果見表2。6.3.檢測限與定量限以信噪比3:1為方法的檢測限，以信噪比10:1為方法的定量限。結(jié)果顯示，6種鹵代羧酸的檢測限在0.02～0.05μg/mL之間，定量限在0.05～1.2μg/mL之間。具體見表2。6.4.精密度試驗(日內(nèi)精密度和日間精密度)按6.2.項下方法配制100％限度水平(0.2～0.6μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取100μL上述溶液，置于5ml量瓶中，按照1.4.項下方法加入衍生化試劑及活化劑進(jìn)行前處理后，日內(nèi)精密度重復(fù)進(jìn)樣6次，日間精密度連續(xù)3天每天重復(fù)進(jìn)樣6次，以衍生化生成物峰面積計算RSD值。由表2可知，此方法的日內(nèi)精密度和日間精密度良好，RSD分別小于1.98％和4.39％。6.5.衍生物穩(wěn)定性按6.2.項下方法配制100％限度水平(0.2～0.6μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取100μL上述溶液，置于5ml量瓶中，按照1.4.項下方法進(jìn)行衍生化后，分別于室溫下放置0，1，2，3，5h時進(jìn)行測定，以待測物峰面積的變化考察衍生物的穩(wěn)定性。由表2可知，衍生化產(chǎn)物室溫放置時，在0～5h內(nèi)峰面積的RSD小于4.62％，即穩(wěn)定性良好。表2方法學(xué)試驗結(jié)果x-待測物的濃度(μg/mL),y-峰面積,r–回歸方程的相關(guān)系數(shù).6.6.加樣回收率為了評價該方法的準(zhǔn)確性，我們分別計算了各鹵代羧酸的加樣回收率。涉及的藥物本底包括他達(dá)拉非(5mg/mL)、氯霉素(15mg/mL)、維生素B6(8mg/mL)、布洛芬(8mg/mL)、甲霜靈(10mg/mL)、維拉佐酮中間體(1mg/mL)、西洛他唑中間體(8mg/mL)和氯霉素滴眼液(1mg/mL)。回收率對照溶液：按6.2項下方法配制100％限度水平(0.2～0.6μg/mL)單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，不加藥物本底，按1.4.項下方法進(jìn)行衍生化，過濾后取20μL進(jìn)樣。每個濃度水平6份?；厥章蕵悠啡芤海壕芊Q取適量各藥物本底，置于5mL量瓶中，分別加入100μL100％限度水平單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照同樣的方法衍生化，過濾后取20μL進(jìn)樣。每個濃度水平6份。加樣回收率＝(樣品峰面積—本底峰面積)/對照品峰面積×100％。并計算各個濃度水平加樣回收率的平均值和RSD。由表3可知，各鹵代羧酸的加樣回收率均在82.4～105.6％之間，且RSD均小于4.30％。實施例7根據(jù)藥物的最大服用劑量以及各雜質(zhì)TTC值，制備一定濃度藥物的供試品溶液。按1.4.項方法進(jìn)行衍生化，過濾后按照實施例2方法取20μL進(jìn)樣，記錄衍生化產(chǎn)物的峰面積，計算待測物在藥物中的含量(μg/g)。結(jié)果表明，除了維生素B6、維拉佐酮中間體和西洛他唑中間體外，其余5種藥品均能檢測出相應(yīng)的鹵代羧酸。其中，他達(dá)拉非樣本中的氯乙酸、布洛芬樣本中的2-氯丙酸和甲霜靈樣本中的2-溴丙酸含量均未超過定量限水平(<12μg/g)。然而，氯霉素原料藥和氯霉素滴眼液中的二氯乙酸含量分別達(dá)到167μg/g和454μg/g，均超過標(biāo)準(zhǔn)限度。表3該方法在8種藥品樣本中的應(yīng)用結(jié)果a:檢測限(μg/g)表示為[待測物的檢測限(μg/mL)]/[藥物的濃度(mg/mL)]。b:定量限(μg/g)表示為[待測物的定量限(μg/mL)]/[藥物的濃度(mg/mL)]。ND:未檢測到。參考文獻(xiàn)[1]J.E.Andrews,H.P.Nichols,J.E.Schmid,L.M.Mole,E.S.HunterIII,G.R.Klinefelter,Developmentaltoxicityofmixtures:thewaterdisinfectionby-productsdichloro-,dibromo-andbromochloroaceticacidinratembryoculture,Reprod.Toxicol.19(2004)111-116.[2]S.D.Richardson,M.J.Plewa,E.D.Wagner,R.Schoeny,D.M.DeMarini,Occurrence,genotoxicity,andcarcinogenicityofregulatedandemergingdisinfectionby-productsindrinkingwater:areviewandroadmapforresearch,Mutat.Res.636(2007)178-242.[3]USEnvironmentalProtectionAgency,Stage2Disinfectantsanddisinfectionbyproductsrule,EPA-HQ-OW-2002-0043,Washington,DC,2006.[4]WorldHealthOrganization,GuidelinesforDrinking-WaterQuality(2006)http://www.who.int/watersanitationhealth/dwq/gdwq0506.pdf.[5]Y.S.Hwang,H.A.Navvab-Gojrati,M.S.Mulla,OvercrowdingFactorsofMosquitoLarvae.11.BiologicalActivityof2-HalooctadecanoicAcidsandAlkyl2-HalooctadecanoatesagainstMosquitoLarvae,J.Agric.FoodChem.26(1978)1294.[6]Moser,Hans,Phenylaminoacetamidesforregulatingplantgrowth,US4008066,1997.[7]C.Loncaric,W.D.Wulff,Anefficientsynthesisof(-)-chloramphenicolviaasymmetriccatalyticaziridination:acomparisonofcatalystspreparedfromtriphenylborateandvariouslinearandvaultedbiaryls,Org.Lett.3(2001)3675-3678.[8]X.T.Li,J.Sui,X.M.Yang,Environmentfriendlysynthesisof1-chloroethyl4-isobutylphenylketone,CN200510200040,2005.[9]P.B.Deshpande,B.B.Boda,S.S.Surti,P.P.Shah,ProcessforpreparationofTadalafilanditsintermediate,US7223863,2007.[10]A.Bathe,S.Emmert,B.Helfert,H.Boettcher,Preparationof5-(1-Piperazinyl)-benzofuran-2-carboxamide,WO2001040219,2001.[11]B.S.Lee,I.K.Park,S.F.Shin,Preparationof6-hydroxy-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoline,JP:2000229944,2000.[12]S.A.Harris,K.Folkers,SynthesisofvitaminB6,J.Am.Chem.Soc.61(1939)1245-1247.[13]Z.S.Zhang,Q.B.Zhang,J.Wang,X.L.Shi,J.J.Zhang,H.F.Song,Synthesisanddrugreleaseinvitroofporphyrancarrying5-Fluorouracil,Carbohydr.Polym.79(2010)628-632.[14]M.H.Nie,Y.Yang,Z.J.Zhang,C.X.Yan,X.N.Wang,H.J.Li,W.B.Dong,Degradationofchloramphenicolbythermallyactivatedpersulfateinaqueoussolution,Chem.Eng.J.246(2014)373-382.[15]CommitteeforMedicinalProductsforHumanUse(CHMP)Guidelinesonthelimitsofgenotoxicimpurities(CPMP/SWP/5199/02)[S].London:EuropeanMedicinesAgencyEvaluationofMedicinesforHumanUse(EMEA),2006.[16]L.Müller,R.J.Mauthe,C.M.Riley,M.M.Andioetal.Arationalefordetermining,testing,andcontrollingspecificimpuritiesinpharmaceuticalsthatpossesspotentialforgenotoxicity,Regul.Toxicol.Pharm.44(2006)198–211.[17]InternationalConferenceonHarmonisation(ICH),AssessmentandControlofDNAReactive(Mutagenic)ImpuritiesinPharmaceuticalstoLimitPotentialCarcinogenicRisk,GuidelineM7,2013,Geneva,Switzerland.[18]USEPA,Method552:DeterminationofHaloaceticAcidsinDrinkingWaterbyLiquid–LiquidExtraction,DerivatizationandGasChromatographywithElectronCaptureDetector,EnvironmentalMonitoringandSystemLaboratory,Cincinnati,OH,1990.[19]USEPA,Method552.2:DalaponinDrinkingWaterbyIonExchangeLiquidSolidExtraction,DerivatizationandGasChromatographywithElectronCaptureDetector,EnvironmentalMonitoringandSystemLaboratory,Cincinnati,OH,1995.[20]USEPA,Method552.1:DeterminationofHaloaceticAcidsandDalaponinDrinkingWaterbyIonExchangeLiquidSolidExtraction,DerivatizationandGasChromatographywithElectronCaptureDetection,EnvironmentalMonitoringandSystemLaboratory,Cincinnati,OH,1992.[21]USEPA,Method552.3:DeterminationofHaloaceticAcidsandDalaponinDrinkingWaterbyLiquid–liquidMicroextraction,DerivatizationandGasChromatographywithElectronCaptureDetection,EnvironmentalMonitoringandSystemLaboratory,Cincinnati,OH,2003.[22]L.M.Nair,R.Saari-Nordhaus,J.M.Anderson,Determinationofhaloaceticacidsbyionchromatography,J.Chromatogr.A.671(1994)309-313.[23]M.C.Bruzzoniti,R.S.DeCarlo,K.Horvath,D.Perrachonetal.Highperformanceionchromatographyofhaloaceticacidsonmacrocycliccryptandanionexchanger,J.Chromatogr.A.1187(2008)188-196.[24]K.Alhooshani,C.Basheer,J.Kaur.A.Gjelstad,K.E.Rasmussen,S.Pedersen-Bjergaard,H.K.Lee,ElectromembraneextractionandHPLCanalysisofhaloaceticacidsandaromaticaceticacidsinwastewater,Talanta,86(2011)109-113.[25]H.Nsubugaa,C.Basheer,Determinationofhaloaceticacidsinswimmingpoolwatersbymembrane-protectedmicro-solidphaseextraction,J.Chromatogr.A.1315(2013)47-52.[26]A.D.Delinsky,D.C.Delinsky,S.Muralidhara,J.W.Fisher,J.V.Bruckner,M.G.Bartlett,Analysisofdichloroaceticacidinratbloodandtissuesbyhydrophilicinteractionliquidchromatographywithtandemmassspectrometry.RapidCommun.MassSpectrom.19(2005)1075-1083.[27]M.Saraji,A.A.H.Bidgoli,Single-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