一種同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法
【專利摘要】一種超高效液相色譜法同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法，包括以下步驟：將經(jīng)預(yù)處理的待測樣品進行超高效液相色譜儀檢測即可；檢測使用梯度洗脫，流動相為乙腈-0.2％磷酸；梯度洗脫的條件：0～2min，6％乙腈；2～3min，6％～16％乙腈；3～8min，16％～20％乙腈；檢測波長：0～2min，271nm，2～8min時253nm；流速：0.25ml/min；柱溫：35℃；進樣體積1μL；檢測器：二極管陣列檢測器；色譜柱：BEH C18色譜柱。本發(fā)明能精確檢測桃金娘根中的沒食子酸和鞣花酸，方便快捷，試劑消耗少，靈敏度高,可用于桃金娘根藥材的質(zhì)量控制及定量分析。
【專利說明】一種同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥材化學(xué)成分檢測領(lǐng)域，具體為一種利用超高效液相色譜法同時檢 測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa)是一種優(yōu)良的野生植物資源，自然資源豐富，醫(yī) 藥、保健利用價值高，主要分布在東南亞國家，尤盛產(chǎn)于中國和日本的南部等地區(qū)；桃金娘 根（Radix Rhodomyrti)為桃金娘的干燥根，桃金娘根中化學(xué)成分主要為縣質(zhì)類、三廠類、黃 酮類等，其中以沒食子酸和鞣花酸為代表的鞣質(zhì)類化合物是桃金娘根的主要有效成分，也 是評價桃金娘根質(zhì)量的主要指標(biāo)。
[0003] 目前，沒食子酸和鞣花酸的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法和高效液相 色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。分光光度法檢測繁瑣，靈敏度低，重現(xiàn)性差；高效液相色譜法耗時長，試 劑消耗大；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法雖然具有高分辨率、高靈敏度、高重現(xiàn)性等優(yōu)點，但是 儀器價格昂貴、維護繁瑣，普及率不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 超高效液相色譜（UPLC)是一種基于小顆粒填料技術(shù)，具有超高速度、分離度和靈 敏度以及低耗的新一代液相分離技術(shù)，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，基于UPLC建立一種簡 便、快速、試劑消耗少、靈敏度高、能夠同時測定桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的含量的方 法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：一種超高效液相色譜同時檢測桃 金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法，包括以下步驟：
[0006] (1)桃金娘根藥材鑒定；
[0007] (2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別精密稱取沒食子酸對照品和鞣花酸對照品置于 IOOmL棕色容量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含沒食子酸10. 00? 150. 0 ii g/mL和鞣花酸10. 00?150. 0 ii g/mL的混合對照品溶液；臨用時，分別用二甲基亞 砜依次稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；
[0008] (3)樣品前處理：將桃金娘根打粉，過篩，得到待檢測的桃金娘根藥材樣品粉末， 置干燥器中儲存；準(zhǔn)確稱取〇. 1?I. Og桃金娘根粉末置于IOOml具塞錐形瓶中，精密加入 10?150mL甲醇，稱定重量，按照50?1500W、25?IOOkHz和25?60°C的條件進行超聲 提取10?90min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，蒸干，二甲基亞砜 溶解并定容至25ml容量瓶中，過0. 19?0. 45 ii m濾膜后供含量測試用；
[0009] (4)超高效液相色譜檢測，色譜條件如下：
[0010] 色譜柱：Waters BH! C18色譜柱（2. ImmX 10Omm, 1.711111);流動相：乙臆-〇.2(%憐 酸；梯度洗脫條件：第〇?2min使用6%乙腈；第2?3min使用6 %?16%乙腈；第3? 8111；[11使用16(%?20(%乙腈；檢測波長：第0?21]1；[11檢測波長為215?300111]1 ;第2?81]1；[11 檢測波長為220?385nm ;流速：0. 1?0. 5ml/min ;柱溫：20?45°C;進樣體積0. 3?IOii L。
[0011] 進一步地，本發(fā)明還包括以下用于驗證所述的方法的精密度、穩(wěn)定性和回收率的 步驟：
[0012] (5)方法線性范圍、精密度和檢出限計算：在上述色譜條件下，分別精密吸取不同 濃度的沒食子酸和鞣花酸的混合對照品溶液注入液相色譜儀，以色譜峰峰面積（y)為縱坐 標(biāo)，以濃度（X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對沒食子酸和鞣花酸混合對照品溶液進行3? 17次平行測定，計算沒食子酸和鞣花酸峰面積和遷移時間的RSD，驗證方法精密度；根據(jù) IUPAC規(guī)定，計算本法檢出限。
[0013] (6)穩(wěn)定性試驗：精密稱取樣品粉末，按步驟（3)樣品前處理方法處理制備供試 品，分別在制備后〇、1、2、4、8、12、2處進樣，測定峰面積；計算沒食子酸和鞣花酸峰面積的 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗證樣品在24h內(nèi)是否穩(wěn)定。
[0014] (7)回收率試驗：精密稱取桃金娘根粉末樣品9份，按步驟（3)樣品前處理制備供 試品方法制備供試品，分別向每一份供試品添加步驟（2)制備的含沒食子酸和鞣花酸混合 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度制備三份平行樣品，并進樣分析，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn) 偏差。
[0015] 本發(fā)明利用超高效液相色譜法同時檢測桃金娘根沒食子酸和鞣花酸的方法，與現(xiàn) 有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：
[0016] (1)本發(fā)明超高效液相色譜法同時檢測桃金娘根沒食子酸和鞣花酸，樣品前處理 采用超聲提取，整個檢測時間8min，流動相試劑消耗僅需2mL，具有簡便、快速、試劑消耗 少、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。
[0017] ⑵根據(jù)IUPAC規(guī)定，本發(fā)明檢出限（3〇，n = 11)沒食子酸為0.45ng/mL，鞣花酸 為 0?23ng/mL。
[0018] (3)本發(fā)明可用于桃金娘根藥材的質(zhì)量控制及定量分析，同時對含沒食子酸和鞣 花酸的其它藥材分析具有重要參考價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明中沒食子酸和鞣花酸對照品的紫外光譜圖，其中A代表沒食子酸，B 代表縣花酸。
[0020] 圖2沒食子酸和鞣花酸混合對照品色譜圖，其中1代表沒食子酸，2代表鞣花酸。
[0021] 圖3為桃金娘根樣品色譜圖，其中1代表沒食子酸，2代表鞣花酸。
[0022] 圖4為本發(fā)明中沒食子酸和鞣花酸混合對照品中沒食子酸和鞣花酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施方法和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。
[0024] 以下所述3個實施例所采用的桃金娘根藥材分別為玉林1號、2號和3號，產(chǎn)地廣 西玉林，經(jīng)廣西植物研究所溫放副研究員鑒定為桃金娘根Radix Rhodomyrti。
[0025] 實施例1
[0026] (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別精密稱取沒食子酸對照品和鞣花酸對照品適量置 IOOmL棕色容量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含沒食子酸68. 60 y g/ mL、縣花酸50. 37 ii g/mL的混合對照品溶液。
[0027] (2)樣品前處理：玉林1號桃金娘根藥材打粉，過60目篩，準(zhǔn)確稱取0.2g細粉，至 于IOOml具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇超聲（350W，53kHz，30°C)提取40min，過濾，蒸 干，二甲基亞砜溶解并定容至25ml容量瓶中，過0. 2 y m濾膜后供含量測試用。
[0028] (3)色譜條件：色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（2. ImmX 100mm，I. 7 ii m);流動相： 乙腈-0? 2%磷酸；梯度洗脫條件：0?Zminj1%乙腈；2?Sminj1%?16%乙腈；3?8min， 16%?20% 乙腈；檢測波長：0 ?2min，271nm，2 ?8min 時 253nm ;流速：0? 25ml/min ;柱溫： 35°C ;進樣體積I y L。
[0029] (4)方法線性范圍、精密度和檢出限：在步驟（3)色譜條件下，分別精密吸取不同 濃度的沒食子酸和鞣花酸的混合對照品溶液注入液相色譜儀，以色譜峰峰面積（y)為縱坐 標(biāo)，以濃度（X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)沒食子酸濃度在〇. 686?68. 60y g/mL，鞣花 酸濃度在〇. 504?50. 37ii g/mL范圍時，沒食子酸回歸方程為y = 12368x+3568. 2, r = 0? 9999 ;鞣花酸回歸方程為 y = 38157X+8631. 1，r = 0? 9999。
[0030] 表1沒食子酸和鞣花酸的線性方程和相關(guān)系數(shù)
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種超高效液相色譜同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 桃金娘根藥材鑒定； (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別精密稱取沒食子酸對照品和鞣花酸對照品置于lOOmL棕色 容量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含沒食子酸10.00?150. Oy g/mL 和鞣花酸10. 〇〇?150. 0 y g/mL的混合對照品溶液；臨用時，分別用二甲基亞砜依次稀釋上 述標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液； (3) 樣品前處理：將桃金娘根打粉，過篩，得到待檢測的桃金娘根藥材樣品粉末，置干 燥器中儲存；準(zhǔn)確稱取〇. 1?1. 〇g桃金娘根粉末置于l〇〇ml具塞錐形瓶中，精密加入10? 150mL甲醇，稱定重量，按照50?1500W、25?100kHz和25?60°C的條件進行超聲提取 10?90min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，蒸干，二甲基亞砜溶解 并定容至25ml容量瓶中，過0. 19?0. 45 y m濾膜后供含量測試用； (4) 以步驟（2)所得的標(biāo)準(zhǔn)工作液為對照，將步驟（3)所得樣品進行超高效液相色譜檢 測分析，色譜條件如下： 色譜柱：Waters BEH C18色譜柱；流動相：乙腈-0. 2%磷酸；梯度洗脫條件：第0? 2111；[11使用6(%乙腈；第2?3111；[11使用6(%?16 (%乙腈；第3?8111；[11使用16(%?20(%乙腈 ；檢測波長：第0?2min，檢測波長為215?300nm ;第2?8min，檢測波長為220?385nm ; 流速：0? 1?0? 5ml/min ;柱溫：20?45°C ;進樣體積0? 3?10 ii L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的 方法，其特征在于，還包括以下驗證步驟： 方法線性范圍、精密度和檢出限計算：在步驟（4)所述的色譜條件下，分別精密吸取不 同濃度的沒食子酸和鞣花酸的混合對照品溶液注入液相色譜儀，以色譜峰峰面積（y)為縱 坐標(biāo)，以濃度（x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對沒食子酸和鞣花酸混合對照品溶液進行3? 17次平行測定，計算沒食子酸和鞣花酸峰面積和遷移時間的RSD，驗證方法精密度；根據(jù) IUPAC規(guī)定，計算檢出限。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的 方法，其特征在于，還包括以下驗證步驟： 穩(wěn)定性試驗：精密稱取樣品粉末，按步驟（3)樣品前處理方法處理制備供試品，分別在 制備后0、1、2、4、8、12和24h進樣，測定峰面積；計算沒食子酸和鞣花酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn) 偏差，驗證樣品在24h內(nèi)是否穩(wěn)定。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜同時檢測桃金娘根中沒食子酸和鞣花酸的 方法，其特征在于，還包括以下驗證步驟： 回收率試驗：精密稱取桃金娘根粉末樣品9份，按步驟（3)樣品前處理制備供試品方 法制備供試品，分別向每一份供試品添加步驟（2)制備的含沒食子酸和鞣花酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶 液，每個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度制備三份平行樣品，并進樣分析，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
【文檔編號】G01N30/88GK104407087SQ201410735042
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】銀慧慧, 劉偉, 趙武, 姜源明, 孟菲, 覃振華, 孫建華, 郭善康 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所