基于tmrm的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測方法，本發(fā)明首先對傳統(tǒng)的基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，以C17.2神經(jīng)干細(xì)胞為模型，用雙結(jié)合位點(diǎn)的方法較為準(zhǔn)確的標(biāo)定了細(xì)胞核區(qū)的TMRM非特異性吸附，提高了計算細(xì)胞靜息膜電位時的精度，并在該方法基礎(chǔ)上，通過鈉離子熒光染料CoroNa?Green對胞內(nèi)鈉離子濃度進(jìn)行檢測，進(jìn)一步計算了鈉鉀離子通透性比值，從而建立了一種具有較高精度的非侵入性的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測方法，該方法法能夠?qū)ζ矫婕?xì)胞和三維生長的細(xì)胞進(jìn)行較為準(zhǔn)確的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種細(xì)胞膜電位和鈉鉀離子通透性比值的檢測方 法。 基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測 方法

【背景技術(shù)】
[0002] 靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)離子的不均勻分布以及不同離子在細(xì)胞膜上的 通透性差異形成了細(xì)胞靜息膜電位（resting membrane potential, RMP)，它是一切生 物電產(chǎn)生和變化的基礎(chǔ)，對許多功能性的膜蛋白如離子通道（ion channels)、轉(zhuǎn)運(yùn)體 (transporters)、鈉鉀泵（pumps)、酶類（enzymes)等具有調(diào)節(jié)作用。RMP的改變對細(xì)胞膜 功能蛋白的調(diào)節(jié)是電刺激信號轉(zhuǎn)成細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵，并進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，分化， 凋亡等。因此準(zhǔn)確檢測RMP具有重要意義。由于細(xì)胞膜對氯離子的通透性相對較小，所以 由Goldman - Hodgkin - Katz方程可知鈉鉀離子的濃度分布和它們在細(xì)胞膜上的通透性比 值基本決定了細(xì)胞靜息膜電位的大小。
[0003] 目前檢測細(xì)胞靜息膜電位主要通過膜片鉗和電勢熒光染料兩種方法。膜片鉗 方法由于檢測時對細(xì)胞有一定程度的損傷，且改變了細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際離子濃度比例，被鉗 制細(xì)胞容易死亡，更適用于對細(xì)胞通道蛋白的電生理行為進(jìn)行檢測。電勢熒光染料方 法是通過按電勢分布的帶電染料的熒光強(qiáng)度來指示細(xì)胞靜息膜電位，具有非侵入性， 更容易獲取細(xì)胞真實(shí)的細(xì)胞靜息膜電位，同時也能用于一些膜片鉗方法無法操作的原 位檢測，檢測通量也更高，但該方法存在檢測精度不夠高的問題。四甲基羅丹明甲酯 (tetramethylrhodamine, methyl ester, TMRM)是一種帶一價正電荷的紅色電勢突光染料， 可自由通過細(xì)胞膜，在膜兩側(cè)形成穩(wěn)定的能斯特平衡分布，對細(xì)胞的毒性相對較小，被認(rèn)為 是一種理想的檢測細(xì)胞靜息膜電位和線粒體膜電位的熒光染料。然而目前利用TMRM進(jìn)行 細(xì)胞靜息膜電位檢測時，對其熒光粒子在核區(qū)的非特異性吸附的標(biāo)定是建立在吸附系數(shù) 不變的前提下，這與文獻(xiàn)報道的非特異性吸附存在飽和過程的結(jié)論存在差異，從而影響用 TMRM標(biāo)定細(xì)胞靜息膜電位時的精度。因此，需要對TMRM的核區(qū)非特異性吸附進(jìn)行標(biāo)定，進(jìn) 而建立一種具有較高精度的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法。
[0004] 鈉鉀離子通透性比值PNa/dt為影響細(xì)胞靜息膜電位的重要因素，常被作為研究細(xì) 胞電生理的一個重要指標(biāo)，尤其是在離子通道功能的研究中。細(xì)胞膜上的大部分離子通道 蛋白都是特異性的對某一離子具有較高的通透性，但其對其它離子也會有一定的通透性， 由于鈉、鉀離子是細(xì)胞內(nèi)外的主要陽離子，因此鈉鉀離子通透性比值對離子通道蛋白的功 能有決定性意義。大部分鈉鉀離子通透性比值的研究都聚焦在動作電位中快速響應(yīng)的通道 蛋白。近年來，靜息狀態(tài)下的一些基礎(chǔ)激活的通道（漏通道）的鈉鉀離子通透性比值也被 進(jìn)行了研究，例如K2P通道，Kir通道和非選擇性陽離子通道（比如Nalcn，被認(rèn)為是一種 鈉離子漏通道）。K2P通道被認(rèn)為具有小于0. 03的PNa/K,Kir通道的PNa/K被認(rèn)為小于0. 04。 這些長期開放的通道對鈉鉀離子的通透性以及鈉鉀泵對鈉鉀離子的轉(zhuǎn)運(yùn)一起決定了靜息 狀態(tài)的膜電位值。然而大部分PNa/K的計算都是基于膜片鉗方法，鑒于前述膜片鉗方法存在 的局限性，所以需要建立一種具有良好精度的非侵入性的鈉鉀離子通透性比值檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于對TMRM的核區(qū)非特異性吸附進(jìn)行標(biāo)定，進(jìn)而建 立一種具有較高精度的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，目的之二在于在所建立的具有較高精度 的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計算鈉鉀離子通透性比值，進(jìn)而建立一種具 有較高精度的非侵入性的鈉鉀離子通透性比值檢測方法。
[0006] 經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 1.基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，包括以下步驟：
[0008] B. TMRM熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系標(biāo)定
[0009] 將TMRM配制成一系列梯度濃度的溶液，對上述溶液分別進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，將測 得的TMRM熒光強(qiáng)度與對應(yīng)的TMRM濃度用式（1)進(jìn)行擬合：
[0010] F = k[TMRM+] (1)
[0011] 其中F為TMRM熒光強(qiáng)度，[TMRM+]為TMRM濃度；求得標(biāo)定系數(shù)k ;
[0012] B.細(xì)胞核區(qū)TMRM的非特異性吸附標(biāo)定
[0013] 先用鉀、鈉離子通透劑處理細(xì)胞使細(xì)胞完全去極化，則細(xì)胞內(nèi)外游離TMRM濃度相 等，再用一系列梯度濃度的TMRM溶液分別孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)TMRM熒光強(qiáng)度，通過式 (1)計算出細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，再通過式（2)計算出細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃 度：
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： A. TMRM熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系標(biāo)定 將TMRM配制成一系列梯度濃度的溶液，對上述溶液分別進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，將測得的 TMRM熒光強(qiáng)度與對應(yīng)的TMRM濃度用式（1)進(jìn)行擬合： F = k[TMRM+] (1) 其中F為TMRM熒光強(qiáng)度，[TMRM+]為TMRM濃度；求得標(biāo)定系數(shù)k ; B. 細(xì)胞核區(qū)TMRM的非特異性吸附標(biāo)定 先用鉀、鈉離子通透劑處理細(xì)胞使細(xì)胞完全去極化，則細(xì)胞內(nèi)外游離TMRM濃度相等， 再用一系列梯度濃度的TMRM溶液分別孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)TMRM熒光強(qiáng)度，通過式（1) 計算出細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，再通過式（2)計算出細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃度：
其中[TMR1C]為細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，[TMRMB+]為細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃 度；[ΓΜΚΜ/]為細(xì)胞核區(qū)游離TMRM濃度，其值與胞外游離TMRM濃度相等； 然后，將計算出的細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃度與細(xì)胞核區(qū)游離TMRM濃度用一 配基兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)的模型即式（3)進(jìn)行擬合：
其中[TMRM+Bmaxl]和[TMRM+Bmax2]分別為兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)中最大非特異性結(jié)合的TMRM 濃度，KD1和&2分別為TMRM與兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)；求得[TMRM+ Bmaxl]、[TMRM+Bmax2]、 KD1 和 KD2 ; C. 基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測 用一定濃度的TMRM溶液孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)的TMRM熒光強(qiáng)度，通過式（1)計算出 細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，將式（3)代入式（2)求解得到，再通過式（4)計算出細(xì)胞 靜息膜電位：
其中Vm為細(xì)胞靜息膜電位，[TMR1C]為細(xì)胞外TMRM濃度。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，其特征在于，步驟A中 是以含有 5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCldPlOmM 葡萄糖的 20mM HEPES 緩沖 液為溶劑，將 TMRM 配制成濃度分別為 5、50、100、250、500、1500、2500、3500、5000、10000、 50000nM的溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，其特征在于，步驟B中 所述鉀、鈉離子通透劑分別為纈氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ纈氨霉素、10 μ Μ莫能菌 素、135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCljP 10mM葡萄糖的20mM HEPES緩沖液處理細(xì)胞使細(xì)胞 完全去極化，再以含有135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCljPlOmM葡萄糖的20mMHEPES緩沖 液為溶劑配制的濃度分別為500、1500、5000、10000、20000nM的TMRM溶液孵育細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求1所述的基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測方法，其特征在于，步驟C中 所述用一定濃度的TMRM溶液孵育細(xì)胞是以含有5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2 和lOmM葡萄糖的20mM HEPES緩沖液為溶劑配制的濃度為500nM的TMRM溶液孵育細(xì)胞。
5.基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： A. TMRM熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系標(biāo)定 將TMRM配制成一系列梯度濃度的溶液，對上述溶液分別進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，將測得的 TMRM熒光強(qiáng)度與TMRM濃度用式（1)進(jìn)行擬合： F = k[TMRM+] (1) 其中F為TMRM熒光強(qiáng)度，[TMRM+]為TMRM濃度；求得標(biāo)定系數(shù)k ; B. 細(xì)胞核區(qū)TMRM的非特異性吸附標(biāo)定 先用鉀、鈉離子通透劑處理細(xì)胞使細(xì)胞完全去極化，則細(xì)胞內(nèi)外游離TMRM濃度相等， 再用一系列梯度濃度的TMRM溶液分別孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)TMRM熒光強(qiáng)度，通過式（1) 計算出細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，再通過式（2)計算出細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃度：
其中[TMR1C]為細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，[TMRMB+]為細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃 度；[ΓΜΜ#/]為細(xì)胞核區(qū)游離TMRM濃度，其值與胞外游離TMRM濃度相等； 然后，將計算出的細(xì)胞核區(qū)非特異性結(jié)合的TMRM濃度與細(xì)胞核區(qū)游離TMRM濃度用一 配基兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)的模型即式（3)進(jìn)行擬合：
其中[TMRM+Bmaxl]和[TMRM+Bmax2]分別為兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)中最大非特異性結(jié)合的TMRM 濃度，KD1和&2分別為TMRM與兩個獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)；求得[TMRM+ Bmaxl]、[TMRM+Bmax2]、 KD1 和 KD2 ; C. 基于TMRM的細(xì)胞靜息膜電位檢測 用一定的濃度TMRM溶液孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)的TMRM熒光強(qiáng)度，通過式（1)計算出 細(xì)胞核區(qū)TMRM總濃度，將式（3)代入式（2)求解得到[ΓΜΛΜ/],再通過式（4)計算出細(xì)胞 靜息膜電位：
其中Vm為細(xì)胞靜息膜電位，[TMR1C]為細(xì)胞外TMRM濃度； D. 梯度去極化時胞內(nèi)鈉離子濃度檢測 先用鉀、鈉離子通透劑處理細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)外的鈉離子平衡，同時對細(xì)胞加載鈉離子熒 光染料CoroNa Green，再用一系列梯度濃度的鈉離子溶液分別孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞熒光強(qiáng) 度，將熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)鈉離子濃度用式（5)進(jìn)行擬合：
其中[NaJ為對應(yīng)熒光強(qiáng)度下的胞內(nèi)鈉離子濃度，F(xiàn)為對應(yīng)鈉離子濃度下的熒光強(qiáng)度 值；Fmin為不含鈉離子的熒光強(qiáng)度值，通過用不含鈉離子的溶液孵育細(xì)胞獲??；Fmax為含飽 和鈉離子的熒光強(qiáng)度值，通過用lOOOmM鈉離子溶液孵育細(xì)胞使細(xì)胞中CoroNa Green完全 飽和的情況下獲取；求得鈉離子與CoroNa Green的解離常數(shù)Kd ; 然后，按上述方法檢測未使用鉀、鈉離子通透劑處理的細(xì)胞在添加 CoroNa Green的梯 度濃度鉀離子溶液中的熒光強(qiáng)度，將測得的熒光強(qiáng)度代入式（5)計算出胞內(nèi)鈉離子濃度， 再將胞外鉀離子濃度與胞內(nèi)鈉離子濃度用式（6)進(jìn)行擬合：
(6) 其中DC]為胞外鉀離子濃度；求得φ ; E.鈉鉀離子通透性比值檢測 細(xì)胞靜息膜電位可用簡化的Goldman方程計算：
其中DC]為胞內(nèi)鉀離子濃度，[NaJ為胞外鈉離子濃度；對應(yīng)不同DC]的[Ν<]可 由式（6)獲得；在細(xì)胞內(nèi)外鈉鉀離子濃度總和相等的情況下，Vm可由DC]來表示：
其中，PNa/K為鈉鉀離子通透性比值； 用含有一定濃度TMRM的梯度濃度鉀離子溶液孵育細(xì)胞，測定細(xì)胞核區(qū)的TMRM熒光強(qiáng) 度，通過式（4)計算出對應(yīng)的細(xì)胞靜息膜電位，然后將細(xì)胞靜息膜電位與胞外鉀離子濃度 用式⑶進(jìn)行擬合，即可求出PNa/K。
6. 如權(quán)利要求5所述的基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，步驟 A 中是以含有 5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCljPlOmM 葡萄糖的 20mMHEPES 緩 沖液為溶劑，將 TMRM 配制成濃度分別為 5、50、100、250、500、1500、2500、3500、5000、10000、 50000nM的溶液。
7. 如權(quán)利要求5所述的基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，步驟 B中所述鉀、鈉離子通透劑分別為纈氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ纈氨霉素、10 μ Μ莫 能菌素、135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCldPlOmM葡萄糖的20mM HEPES緩沖液處理細(xì)胞使 細(xì)胞完全去極化，再以含有135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCldP 10mM葡萄糖的20mM HEPES 緩沖液為溶劑配制的濃度分別為500、1500、5000、10000、20000nM的TMRM溶液孵育細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求5所述的基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，步驟 C中所述用一定濃度的TMRM溶液孵育細(xì)胞是以含有5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2和lOmM葡萄糖的20mM HEPES緩沖液為溶劑配制的濃度為500nM的TMRM溶液孵育細(xì) 胞。
9. 如權(quán)利要求5所述的基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，步驟 D中所述鉀、鈉離子通透劑分別為纈氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ纈氨霉素、10 μ Μ莫 能菌素、5以]?(：〇1'〇恥6代611、511111((：1、13〇1111恥(：1、111111%(：12、21111〇3(：1 2和1〇1111葡萄糖的 20mM HEPES緩沖液處理細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)外的鈉離子平衡，再以濃度分別為10mM、25mM、55mM、 80mM、100mM、120mM、130mM的鈉離子溶液孵育細(xì)胞，所述鈉離子溶液中還含有不同濃度的 KCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2、10mM葡萄糖和20mM HEPES，其中鉀鈉離子濃度總和為135mM。
10.如權(quán)利要求5所述的基于TMRM的鈉鉀離子通透性比值檢測方法，其特征在于，步 驟D中所述添加 CoroNa Green的梯度濃度鉀離子溶液是含有5 μ M CoroNa Green且鉀離 子濃度分別為5、7. 5、15、35、55、80、130mM的溶液，所述溶液中還含有不同濃度的NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2、10mM葡萄糖和20mM HEPES，其中鉀鈉離子濃度總和為135mM。
【文檔編號】G01N21/64GK104101589SQ201410366655
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】吳澤志, 張利光, 林雨, 鐘冬火 申請人:重慶大學(xué)