Hplc-elsd法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定方法，其特征在于，包括：(1)樣品的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備豬去氧膽酸和貝羚膠囊樣品，將貝羚膠囊制備成溶液供試溶液；(2)高效液相色譜：色譜柱，流動相為乙腈-0.05％～0.15％酸溶液，二者重量百分比為50～75:25～50；流速1.0ml·min-1；進(jìn)樣體積20μl；(3)檢測：ELSD檢測器以空氣為載氣，漂移管溫度從90℃開始，每5℃檢測一次，空氣流速為1.7～3.0L·min-1，以豬去氧膽酸峰面積計算，分離度不低于2.0，理論塔板不低于3000。本發(fā)明的方法可用于豬去氧膽酸的含量測定，專屬性、耐用性、精密度、準(zhǔn)確度良好，適用于貝羚膠囊的整體質(zhì)量控制。
【專利說明】HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含量測定方法，具體涉及一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中有效成 分豬去氧膽酸的含量測定方法，屬于藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、分析化學(xué)以及藥物分析的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的含量測定方法是薄層色譜掃 描。
[0003] 薄層掃描有其自身的一些缺陷，包括重復(fù)性差，受到各種干擾多，不夠靈敏等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的 含量測定方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。適用于藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、分析化學(xué) 以及藥物分析的【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0005] 1、HPLC-ELSD法與薄層色譜法比較更簡便，準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好。作進(jìn)一步 優(yōu)化了國家標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控指標(biāo)的檢測方法，建立了豬去氧膽酸的含量測定方法，確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 項目和限度范圍，完成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升工作提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，最終形成更加全面、嚴(yán)格的內(nèi)控 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，做到質(zhì)量可控，以保證臨床使用的有效性和安全性。
[0006] 2、將原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的含量測定方法薄層色 譜掃描，改變成更加簡便，準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好的HPLC-ELSD法。
[0007] 3、由于指標(biāo)成分豬去氧膽酸在紫外區(qū)吸收較小，在近紫外區(qū)測定時色譜基線漂移 很大，不易作定量用，故選擇用蒸發(fā)光散射檢測器，在上述的漂移管溫度和氣流下，色譜有 穩(wěn)定的基線，靈敏度高，適合用于定量分析。
[0008] 貝羚膠囊主要功效為清熱化痰，止咳平喘。用于痰熱肺阻，氣喘咳嗽，小兒肺炎，喘 息性支氣管炎及成人慢性支氣管炎見上述證候者。
[0009] 貝羚膠囊的制備工藝：
[0010] (1)按照貝羚膠囊處方準(zhǔn)備原料：
[0011] 川貝母、羚羊角、豬去氧膽酸、人工麝香、沉香、人工天竺黃（飛）、煅青礞石（飛）、 硼砂（炒）以上八味；
[0012] ⑵原料的粉碎：
[0013] 羚羊角搓成細(xì)粉；
[0014] 人工天竺黃和煅青礞石分別粉碎成細(xì)粉；
[0015] 川貝母、豬去氧膽酸、人工麝香、沉香、硼砂（炒）五味分別粉碎成細(xì)粉；
[0016] (3)制粒：
[0017] 除煅青礞石外，其余7味的細(xì)粉與淀粉混勻，分次加入青礞石細(xì)粉中，配研均勻， 制成顆粒，過篩；
[0018] (4)制膠囊：
[0019] 再加硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，即得。
[0020] 其中步驟⑴中，按照重量份數(shù)計，所述川貝母、羚羊角、豬去氧膽酸、人工麝香、 沉香、人工天竺黃（飛）、煅青礞石（飛）、硼砂（炒）。
[0021] 本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0022] 作為本發(fā)明的第一方面，一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定 方法，其特征在于，包括 ：
[0023] (1)樣品的準(zhǔn)備
[0024] 準(zhǔn)備豬去氧膽酸和貝羚膠囊樣品，將貝羚膠囊制備成溶液供試溶液；
[0025] (2)高效液相色譜
[0026] 色譜柱，流動相為乙腈-0.05 %?0. 15 %酸溶液，二者重量百分比為50? 75:25 ?50 ;流速 1. 0ml · min 1 ;進(jìn)樣體積 20 μ 1 ;
[0027] (3)檢測
[0028] ELSD檢測器以空氣為載氣，漂移管溫度從90°C開始，每5°C檢測一次，空氣流速為 1. 7?3. 0L · mirT1，以豬去氧膽酸峰面積計算，分離度不低于2. 0,理論塔板不低于3000。
[0029] 步驟⑴還包括樣品前處理，采用75%甲醇溶劑50ml，超聲提取20min。
[0030] 步驟（1)中，貝羚膠囊制備成溶液供試溶液進(jìn)一步包括：取貝羚膠囊內(nèi)容物，混 勻，研細(xì)，取0. 3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入75%甲醇50ml，密塞，稱定重量，超 聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量；用75%甲醇再補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液， 作為供試品溶液。
[0031] 步驟⑵中，所述色譜柱為 Inertsil 0DS-3,規(guī)格為 4. 6 X 150mm，5 μ m ;Agilent XDB-C18,規(guī)格為 4. 6X250mm，5ym ;以及 Kromasill00-5C18 規(guī)格為 4. 6X150mm，5ym。優(yōu) 選為 Kromasill00_5C18 (4· 6X 150mm，5 μ m)色譜柱。
[0032] 步驟（2)中，所述流動相乙腈：0. 1%酸溶液二者重量百分比為50:50 ;所述酸為磷 酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相體系。
[0033] 步驟⑵中，所述色譜柱的溫度為25°C?35°C。25°C下的理論塔板數(shù)最高，分離 度高，優(yōu)選為25°C柱溫。
[0034] 步驟（2)中，所述漂移管溫度90°C較佳。
[0035] 步驟⑵中，所述色譜柱的載氣流速為2. 5L · mirT1。2. 5L · mirT1氣體流速下，噪 音最小，峰型最好。
[0036] 步驟（3)中，豬去氧膽酸的線性回歸方程：Y = 1. 0595X+3. 8387，r = 0. 9999,豬去 氧膽酸在10. 48?42. 408 μ g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，含量測定采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算。
[0037] 作為本發(fā)明的第二方面，一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定 方法的用途，其特征在于，測定貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的含量。
[0038] 本發(fā)明的有益效果：
[0039] 貝羚膠囊目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定方法為薄層色譜掃描法，存在的問題是重復(fù)性 差，受到各種干擾多，不夠靈敏等。因此將其改成高校色譜法。
[0040] 由于指標(biāo)成分豬去氧膽酸在紫外區(qū)吸收較小在近紫外區(qū)測定時色譜基線漂移很 大，不易作定量用，故選擇用蒸發(fā)光散射檢測器，在上述的漂移管溫度和氣流下，色譜有穩(wěn) 定的基線，靈敏度高，適合用于定量分析。
[0041] 本發(fā)明的豬去氧膽酸的含量測定方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，回收率高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1豬去氧膽酸對照品色譜圖。
[0043] 圖2貝羚膠囊樣品色譜圖。
[0044] 圖3貝羚膠囊陰性樣品色譜圖。
[0045] 圖4豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0047] 實(shí)施例1
[0048] HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的含量測定方法的具體研究：
[0049] 1儀器和材料
[0050] 1. 1 儀器
[0051] AgilentllOO高效液相色譜儀、ELSD檢測器、ChemStation B. 03. 01色譜工作站 (安捷倫科技）；Milli-Q超純水機(jī)（Milli-Pore) ;CQ-250超聲波清洗器（上海新超超聲波 儀器有限公司）；BS224S電子天平（Sartorius)。
[0052] 1. 2 材料
[0053] 豬去氧膽酸（批號：100087-200610，純度97.3%，購自中國藥品生物制品檢定 所）；貝羚膠囊樣品，共16批，上海雷允上藥業(yè)有限公司。
[0054] 試劑：乙腈（HPLC級，Merck);甲酸、甲醇（AR，國藥化學(xué)試劑有限公司）；超純水， 實(shí)驗室自制。
[0055] 2貝羚膠囊含量測定
[0056] 2. 1溶液的制備
[0057] 2. 1. 1對照品溶液制備
[0058] 取對照品適量，用甲醇溶液制成1ml含豬去氧膽酸1. 314mg的對照品溶液。
[0059] 2. L 2供試品溶液制備
[0060] 取裝量差異項下的貝羚膠囊內(nèi)容物（裝量檢查按照2010版藥典一部中，膠囊劑裝 量檢查法規(guī)定），混勻，研細(xì)，取0. 3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50ml， 密塞，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇再補(bǔ)足減失的重量，搖 勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。
[0061] 2. 1. 3陰性供試品溶液的制備
[0062] 按原處方，照貝羚膠囊產(chǎn)品生產(chǎn)工藝制備缺豬去氧膽酸的陰性供試品，再按2. 1. 2 項下供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。
[0063] 2. 2色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗
[0064] 色譜柱 Kromasill00_5C18 (4. 6 X 150mm，5 μ m);流動相為甲醇 _0· 1 % 甲酸（50 : 50);流速1. 0ml · min-1 ;進(jìn)樣體積20 μ 1。以ELSD為檢測器，以空氣為載氣，漂移管溫度 90°C .空氣流速為2. 5L 以豬去氧膽酸峰面積計算，分離度不低于2. 0,理論塔板數(shù) 不低于3000。
[0065] 2· 3色譜條件優(yōu)化
[0066] 2. 3. 1色譜柱選擇
[0067] 在其他條件相同的情況下，比較 Inertsil 0DS-3 (4· 6Χ 150mm，5 μ m)、Agilent 父08-(：18(4.6\250111111，5 4 111)以及1(1'〇11^811100-5(：18(4.6\150111111，5 4 111)等3款色譜柱的分 離效果。比較各色譜柱分離效果，結(jié)果表明，Agilent XDB-C18分離效果最好，但分離時間 長，故選分離效果較好，分析時間短，各項性能指標(biāo)最優(yōu)的Kromasill00-5C18 (4. 6X 150mm， 5 u rn)色譜柱。
[0068] 2· 3· 2流動相種類選擇
[0069] 在其他條件相同的情況下，比較甲醇-0. 1%冰醋酸與乙腈-0. 1%冰醋酸兩種流 動相體系，乙腈體系峰型好，理論板數(shù)與分離度相對甲醇體系高，故選擇乙腈體系。比較乙 腈：0· 1 % HAC的25:75、50:50、75:25三個不同比例，發(fā)現(xiàn)25:75洗脫不下來，75:25主成分 出峰時間太早，分離效果不好，50 :50該條件分離效果好7min鐘內(nèi)完成分離，因此選擇流動 相的比列為：50:50。
[0070] 2. 3. 3流動相中酸種類選擇
[0071]貝羚膠囊中的豬去氧膽酸在酸性流動相中分離較好。在其他條件相同的條件下， 流動相乙腈：〇. 1%酸溶液（50:50)，比較磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相時的分離，結(jié) 果甲酸水溶液分離效果最好，故水相體系選擇甲酸水溶液。
[0072] 2. 3. 4流動相中酸濃度的考察
[0073] 在其他條件相同的情況下，依據(jù)2. 3. 2選擇的條件，比較0· 05%、0· 1%、0· 15%三 種濃度的甲酸溶液的分離，〇. 1 %甲酸溶液分離效果最好，故選擇〇. 1 %的甲酸溶液。因此， 流動相的條件確定為：乙腈：〇. 1 %甲酸（50:50)。
[0074] 2. 3. 5色譜柱溫度考察
[0075] 在其他條件相同的情況下，比較25°C、30°C、35°C等三種不同的色譜柱溫度下的分 離效果，25°C下的理論塔板數(shù)最高，分離度高，故選擇25°C柱溫。
[0076] 2. 3. 6漂移管溫度選擇
[0077] 在上述已選擇的最佳色譜條件下，優(yōu)化漂移管溫度，從90°C開始，每5°C檢測一 次，直到信噪比不可接受為止。實(shí)驗結(jié)果表明隨著溫度的降低，噪音相對減小，但是減小的 幅度不是太大，但是隨溫度降低，蒸發(fā)光檢測器積液增加。如果溫度太高，噪音又會太大，故 選擇90°C為最佳的漂移管溫度。
[0078] 2. 3. 7載氣流速選擇
[0079] 在90°C的漂移管溫度下，優(yōu)化空氣流速，比較了 3· 0、2· 7、2· 5、2· 2、2· 0、1· 8、1· 5、 1.3、1.9、2. Ul.7L.min_1的氣體流速下，色譜峰型，噪音大小。結(jié)果表明2. SL.mirr1氣體 流速下，噪音最小，峰型最好。故選氣體流速為2. 5L · mirT1。
[0080] 依據(jù)上述實(shí)驗，優(yōu)選出豬去氧膽酸的色譜條件：色譜柱 KR0MASIL100-5C18(4.6X150mm，5ym);流動相為乙腈-0· 1 % 甲酸（50:50);流速 1. 0ml · min-1 ;進(jìn)樣體積20 μ 1。以ELSD為檢測器，以空氣為載氣，漂移管溫度90°C .空氣 流速為2. 5L · min、
[0081] 3樣品前處理方法考察
[0082] 3· 1提取溶劑考察
[0083] 以指標(biāo)成分豬去氧膽酸的相對峰面積（單位質(zhì)量的峰面積）為評價標(biāo)準(zhǔn)，按2. 1. 2 供試品溶液的制備方法提取，測試結(jié)果見表1。通過比較各溶劑在超聲提取時的相對峰面積 的大小，75%的甲醇提取效率最高，故選擇75%的甲醇為提取溶劑。
[0084] 表1提取溶劑選擇
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 一種HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定方法，其特征在于，包括： (1) 樣品的準(zhǔn)備 準(zhǔn)備豬去氧膽酸和貝羚膠囊樣品，將貝羚膠囊制備成溶液供試溶液； (2) 高效液相色譜 色譜柱，流動相為乙腈-0.05 %?0. 15 %酸溶液，二者重量百分比為50?75:25?50 ; 流速1. 〇ml · mirT1 ;進(jìn)樣體積20 μ 1 ; (3) 檢測 ELSD檢測器以空氣為載氣，漂移管溫度從90°C開始，每5°C檢測一次，空氣流速為 1. 7?3. 0L · mirT1，以豬去氧膽酸峰面積計算，分離度不低于2. 0,理論塔板不低于3000。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)還包括樣品前處理，采用75%甲 醇溶劑50ml，超聲提取20min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，貝羚膠囊制備成溶液供 試溶液進(jìn)一步包括： 取貝羚膠囊內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取〇. 3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中； 精密加入75%甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量； 用75%甲醇再補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述色譜柱為Inertsil ODS-3,規(guī)格為 4. 6X150mm，5ym ; Agilent XDB-C18,規(guī)格為 4. 6X250mm，5ym ;以及 Kromasill00-5C18 規(guī)格為 4. 6X150mm，5ym。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述流動相乙腈：0. 1%酸溶 液二者重量百分比為50:50 ; 所述酸為磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相體系。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述色譜柱的溫度為25°C? 35。。。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述漂移管溫度90°C較佳。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述色譜柱的載氣流速為 2. 5L · mirT1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，豬去氧膽酸的線性回歸方 程：Y = 1. 0595X+3. 8387, r = 0. 9999,豬去氧膽酸在10. 48?42. 408 μ g范圍內(nèi)呈良好的 線性關(guān)系，含量測定采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算。
10. -種如權(quán)利要求1所述的HPLC-ELSD法對貝羚膠囊中豬去氧膽酸的含量測定方法 的用途，其特征在于，測定貝羚膠囊中有效成分豬去氧膽酸的含量。
【文檔編號】G01N30/06GK104090056SQ201410301889
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】錢湧, 胡馨, 張赟, 郭美蘭 申請人:上海雷允上藥業(yè)有限公司