一種檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和應(yīng)用，特點(diǎn)是該傳感器為表面固載電聚合的ABEI，再依次組裝有戊二醛、DNA1、通過T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)合的DNA2以及生物素的玻碳電極；其制備方法包括固載有DNA1玻碳電極的制備步驟和固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的組裝步驟，優(yōu)點(diǎn)是具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性良好、易于操作、節(jié)約試劑等。
【專利說明】-種檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光 傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬污染是現(xiàn)在環(huán)境污染的重要組成部分之一。汞（Hg)，是常溫下唯一的液態(tài) 金屬，是重金屬污染中的頭號(hào)殺手。近年來，人類對(duì)重金屬汞的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造 活動(dòng)日益增多，大量的汞進(jìn)入大氣、水、土壤中存留、積累和遷移。環(huán)境中的汞最后以食物鏈 的形式進(jìn)入動(dòng)物和人類的體內(nèi)，對(duì)生物體的生命機(jī)能造成很大傷害，產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀、震 顫、口腔炎及中毒性腎病等疾病。汞離子（Hg 2+)是汞在自然界中的主要存在形式之一，眾多 衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中要求不得檢出，因此發(fā)展高靈敏度且高選擇性的低濃度汞離子檢測(cè)方法對(duì)環(huán)境 檢測(cè)及食品安全監(jiān)測(cè)具有重要的意義。
[0003] 目前檢測(cè)汞離子的方法主要有：冷原子吸收光譜法、ICP-MS、熒光光譜法、紫外一 可見分光光度法、原子熒光法、電化學(xué)法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、重金屬快速測(cè)定儀 法、試紙條法等，但這些方法或需使用昂貴的儀器，操作繁瑣，且要求檢測(cè)人員具備一定的 專業(yè)知識(shí)，分析成本高，難以普及；或靈敏度不高、選擇性差，樣品預(yù)處理復(fù)雜，難以準(zhǔn)確定 量檢測(cè)低濃度Hg 2+。
[0004] 電化學(xué)發(fā)光（ECL)是將電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的一種分析技術(shù)，不僅具有化學(xué) 發(fā)光分析法的靈敏度高、線性范圍寬、觀察方便、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而且具有電化學(xué)分析法 的電位可控性強(qiáng)、選擇性高、試劑穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已受到科研工作者的極大關(guān)注，并 逐漸發(fā)展成為分析檢測(cè)領(lǐng)域的重要分支。固態(tài)電化學(xué)發(fā)光是將電化學(xué)發(fā)光試劑通過化學(xué)方 法或物理方法固載到電極表面后再進(jìn)行ECL檢測(cè)的技術(shù)，與溶液中的ECL相比，將電化學(xué)發(fā) 光試劑固定到電極表面構(gòu)建的固態(tài)ECL，還有以下優(yōu)點(diǎn)：減少昂貴試劑的用量、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操 作、提高ECL強(qiáng)度等。但是，目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何利用N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯 米諾（ABEI)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)水體中汞離子含量相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性 好、易于操作的用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化 學(xué)發(fā)光傳感器，所述的傳感器為表面固載電聚合的ABEI，再依次組裝有戊二醛、DNA1、通過 T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)合的DNA2以及生物素的玻碳電極。
[0007] 上述用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，具體步驟如下： (1)固載有DNA1玻碳電極的制備 a.將直徑為3?5 mm的玻碳電極依次用1. 0 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二錯(cuò) 拋光處理，然后依次用乙醇、水超聲清洗，水沖洗干凈后，氮?dú)獯蹈蓚溆茫?b. 將步驟（a)所得玻碳電極置于含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)的&504 溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電壓范圍為-0.2?1.5 V，以0.01?0.1 V/s的掃速循環(huán)掃 描20?30圈，使ABEI在玻碳電極表面電聚合；所述的含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米 諾（ABEI) WH2S04溶液中N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)濃度為0.01?0.0001 mol/L，H2S04 濃度為 0· 1 ?1 mol/L ; c. 將步驟（b)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加1?3 wt%戊二醛溶液10?20 μ L，靜置20?40分鐘； d. 將步驟（c)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加含10 μ mol/L DNA1的pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液10? 20 μ L，靜置20?40 min，使DNA1結(jié)合到電極表面； e. 將步驟（d)所得玻碳電極浸泡在10?20 μ L質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白 溶液中，封閉1?2 h(封閉非活性位點(diǎn)），即得固載有DNA1的玻碳電極； (2)固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的組裝 a. 配制一系列不同濃度的含汞離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液與含10 μ mol/L DNA2的 pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液按體積比1:1混合； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面，室 溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液清洗； c. 取適量pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液配制0· 01?0· 1 mg/mL的親和素 溶液，將10?20 μ L親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d. 將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，即 得到用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器。
[0008] 所述的 DNA1 的結(jié)構(gòu)式為：5' -NH2-(CH2)6-GACTGTCTCGTTCGCTTAG-3' ；所述的 DNA2 的結(jié)構(gòu)式為：5' -biotin-CTATGCGTACGTGACTGTC-3'。
[0009] 上述固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的用于檢測(cè)汞離子的方法，具體步驟如下： (1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 a. 將權(quán)利要求3所述的固載有DNA1的玻碳電極用0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈 后，在pH = 9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度1〇; b. 將權(quán)利要求3所述的用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器放入pH = 9?10 的0. 05?0. 2 Μ碳酸鹽緩沖液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，獲得一系列不同濃 度的Hg2+溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值L，計(jì)算一系列不同濃度的Hg 2+溶液電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度的改變值Λ 1= L-Ii，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ I與Hg2+溶液濃度之間的定量關(guān) 系； (2) 待測(cè)樣品測(cè)定 a. 將含汞離子的待測(cè)樣品溶液與含10 ymol/LDNA2的pH7?8的0.01?0. 1MPBS 緩沖液按體積比1:1混合； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面，室 溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液清洗； C.將10?20 μ L用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液配制的0· 01?0· 1 mg/ mL的親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d.將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，作 為工作電極，飽和甘汞電極或者Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)電極，構(gòu)建三電極 系統(tǒng)，置入pH = 9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度值，利用電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值△ I與Hg2+溶液濃度之間的定量關(guān)系，計(jì)算得到待 測(cè)樣品溶液中Hg2+的準(zhǔn)確濃度C Hg。
[0010] 所述的碳酸鹽緩沖液中含1 mM的過氧化氫，采用的電化學(xué)方法為電位階躍計(jì)時(shí)電 流法；電位階躍：〇 V階躍至1 V ;脈沖寬度：0. 25 S ;測(cè)量時(shí)間間隔：30 S。
[0011] 發(fā)明原理：電化學(xué)發(fā)光試劑為電聚合的ABEI，ABEI在玻碳電極表面電聚合后，原 來的兩步電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)變?yōu)橐徊?，且從不可逆變?yōu)榭赡?，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)非常穩(wěn)定。ABEI 中的氨基仍然保留，非常方便后續(xù)的偶聯(lián)DNA。在戊二醛交聯(lián)作用下，DNA1的氨基與電極 表面ABEI聚合物中的氨基偶聯(lián)，從而被固定到電極表面，此時(shí)測(cè)得的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I。很 大。當(dāng)待測(cè)溶液中有Hg 2+時(shí)，DNA1與DNA2通過T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)合，親和素與DNA2末端的 生物素結(jié)合，生物素是生物大分子，分子量約60kD，其在電極表面可有效阻礙電子與光的傳 遞，使電化學(xué)發(fā)光減弱為L(zhǎng)。待測(cè)溶液中Hg 2+含量越高，發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ 1=、- L也 就越大，這就是本固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器定量檢測(cè)Hg2+的機(jī)理。固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器檢 測(cè)Hg 2+的原理圖如圖1所示。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： (1)高靈敏度，借助于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)本身極高的靈敏度，本固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器能 定量檢測(cè)0. 01 nM Hg2+。
[0013] (2)高選擇性，常見金屬離子如？132+^112+、(：〇 2+、附2+、(：112+、2112+、〇(12+、1% 2+對(duì)檢測(cè)均 無干擾。原因在于：T-Hg2+-T錯(cuò)配對(duì)汞離子具有高特異性的識(shí)別能力，其它金屬離子的干擾 可忽略。
[0014] (3)成本低廉。所需試劑量極少。
[0015] (4)精密度高。采用固態(tài)電化學(xué)發(fā)光，信號(hào)穩(wěn)定，結(jié)果精密度高。
[0016] 綜上所述，本發(fā)明擬制備一種用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器，具有靈 敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性良好、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度汞離子的 檢測(cè)目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)汞離子的原理圖； 圖2為不同濃度汞離子對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)； 圖3為發(fā)光強(qiáng)度的改變值△ I與汞離子濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系圖； 圖4為本發(fā)明固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)汞離子的選擇性檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0019] 具體實(shí)施例一 一種用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器，該傳感器為表面固載電聚合的ABEI， 再依次組裝有戊二醛、DNA1、通過T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)合的DNA2以及生物素的玻碳電極，具體制 備步驟如下： (1) 固載有DNA1玻碳電極的制備 a. 將直徑為3?5 mm的玻碳電極依次用1. Ο μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二錯(cuò) 拋光處理，然后依次用乙醇、水超聲清洗，水沖洗干凈后，氮?dú)獯蹈蓚溆茫?b. 將步驟（a)所得玻碳電極置于含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)的&504 溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電壓范圍為-0.2?1.5 V，以0.05 V/s的掃速循環(huán)掃描20圈， 使ABEI在玻碳電極表面電聚合；上述含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)的&50 4 溶液中N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)濃度為0. 001 mol/L，H2S04濃度為0. 1? 1 mol/L ； c. 將步驟（b)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加1?3 wt%戊二醛溶液10?20 μ L，靜置20?40分鐘； d. 將步驟（c)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加含10 μ mol/L DNA1的pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液10? 20 μ L，靜置20?40 min，使DNA1結(jié)合到電極表面；其中DNA1的結(jié)構(gòu)式為：5'-NH2-(CH2) 6 -GACTGTCTCGTTCGCTTAG-3,； e. 將步驟（d)所得玻碳電極浸泡在10?20 μ L質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白 溶液中，封閉1?2 h(封閉非活性位點(diǎn)），即得固載有DNA1的玻碳電極； (2) 固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的組裝 a. 配制一系列不同濃度的含汞離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液與含10 μ mol/L DNA2的 pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液按體積比1:1混合；其中DNA2的結(jié)構(gòu)式為：5'-bi otin-CTATGCGTACGTGACTGTC-3' ； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面，室 溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液清洗； c. 取適量pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液配制0· 01?0· 1 mg/mL的親和素 溶液，將10?20 μ L親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d. 將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，即 得到用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器。
[0020] 除上述具體實(shí)施例外，上述固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器制備的步驟中： 循環(huán)伏安掃描的掃速還可以為〇.〇1?0.1 v/s內(nèi)的任一值，圈數(shù)還可以為20?30 圈內(nèi)的任一值，含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)的H2S04溶液中N-(4-氨丁 基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)濃度還可以為0.01?0.0001 mol/L內(nèi)的任一值，H2S04& 度可以為〇. 1?1 mol/L內(nèi)的任一值； 戊二醛溶液的濃度可以為1?3 wt%內(nèi)的任一值，滴加體積可以為10?20 μ L內(nèi)的 任一值，靜置時(shí)間為20?40分鐘內(nèi)的任一值； 含10 μ mol/L DNA1的pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液的滴加體積可以為 10?20 μ L內(nèi)的任一值，靜置時(shí)間可以為20?40分鐘內(nèi)的任一值； 牛血清白蛋白（BSA)溶液滴加體積可以為10?20 μ L內(nèi)的任一值，靜置時(shí)間可以為 1?2 h內(nèi)的任一值； 標(biāo)準(zhǔn)溶液與含10 μ mol/L DNA2的pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液按體積比 1:1混合所得混合溶液滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面的滴加體積可以為10?20 μ L 的任一值，孵育時(shí)間可以為20?30 min內(nèi)的任一值； 親和素溶液的濃度可以為0.01?0.1 mg/mL內(nèi)的任一值，滴加體積可以為10?20 yL 內(nèi)的任一值； PBS緩沖液的濃度可以為0. 01?0. 1 Μ內(nèi)的任一值，pH可以為7?8內(nèi)的任一值。
[0021] 具體實(shí)施例二 利用上述具體實(shí)施例二制備得到的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)汞離子的方法，檢測(cè)汞 離子的原理如圖1所示，具體步驟如下： a. 將上述具體實(shí)施例二制備得到的固載有DNA1的玻碳電極用0.01?0.1 M PBS緩沖 液沖洗干凈后，在pH = 9?10的0. 05?0. 2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度1〇 ; b. 將上述具體實(shí)施例二制備得到的用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器放入pH =9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，獲得一系 列不同濃度的Hg2+溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值L，計(jì)算一系列不同濃度的Hg 2+溶液電化 學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ 1=、- Ip 電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ 1= L-Ii，與汞離子濃度對(duì)數(shù)在0.01?10 nM濃度范 圍內(nèi)呈線性關(guān)系(不同濃度汞離子對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，如圖2所示)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Λ 1= 2493. 25 + 843.63 log CHg (ηΜ)(發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ I與汞離子濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān) 系圖，如圖3所75); (2)待測(cè)樣品測(cè)定 a. 將含汞離子的待測(cè)樣品溶液與含10 μ mol/L DNA2的ρΗ7?8的0. 01?0. 1 M PBS 緩沖液按體積比1:1混合； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到上述具體實(shí)施例一制備得到的固 載有DNA1的玻碳電極表面，室溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0. 01?0. 1 Μ PBS緩沖液清洗； c. 將10?20 μ L用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液配制的0· 01?0· 1 mg/ mL的親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d. 將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，作 為工作電極，飽和甘汞電極或者Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)電極，構(gòu)建三電極 系統(tǒng)，置入pH = 9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Λ 1= 2493. 25 + 843.63 log (ηΜ)，計(jì)算得到待測(cè)樣品溶液中 Hg2+的準(zhǔn)確濃度CHg，單位為ηΜ。
[0022] 上述碳酸鹽緩沖液中含1 mM的過氧化氫，采用的電化學(xué)方法為電位階躍計(jì)時(shí)電流 法；電位階躍：〇 V階躍至1 V ;脈沖寬度：0. 25 s ;測(cè)量時(shí)間間隔：30 s。
[0023] 具體實(shí)施例三 1?選擇性和1?靈敏性的檢測(cè)試驗(yàn) 高靈敏性由具體實(shí)施例二體現(xiàn)，由于電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ 1= ，與汞離子 濃度對(duì)數(shù)在0. 01?10 nM濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，因此，具體實(shí)施例一制備得到的檢測(cè)汞 離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器對(duì)Hg2+的檢測(cè)靈敏度達(dá)0. 01 nM。
[0024] 高選擇性：以上述具體實(shí)施例二同樣的實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)10 μ Μ的常見干擾離子： Pb2+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu 2+，Zn2+，Cd2+，Mg2+，結(jié)果如圖 4 所示。
[0025] 結(jié)果表明：0. 01 nM Hg2+造成傳感器的Λ I為800左右，而10 μ M的常見干擾離 子造成傳感器的Λ I均小于200,意味著1000000倍的常見干擾離子不影響檢測(cè)，主要原因 為Hg2+與Τ堿基之間的T-Hg 2+-T錯(cuò)配、生物素和親和素之間的特異性識(shí)別。
[0026] 具體實(shí)施例四 以上述具體實(shí)施例一制備得到的檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器為工作電極，以 上述具體實(shí)施例二同樣的實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)高中低三種濃度的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如下表。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)萊離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于：所述的工作電極表面 固載有電聚合的N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)，所述的N-(4-氨丁基）-N-乙基 異魯米諾上依次組裝有戊二醛、DNA1、通過T-Hg 2+-T錯(cuò)配結(jié)合的DNA2以及生物素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于：所 述的工作電極為玻碳電極。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法， 其特征在于具體步驟如下： (1) 固載有DNA1玻碳電極的制備 a. 將直徑為3?5 mm的玻碳電極依次用1. Ο μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二錯(cuò) 拋光處理，然后依次用乙醇、水超聲清洗，水沖洗干凈后，氮?dú)獯蹈蓚溆茫? b. 將步驟（a)所得玻碳電極置于含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)的&504 溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電壓范圍為-0.2?1.5 V，以0.01?0.1 V/s的掃速循環(huán)掃 描20?30圈，使ABEI在玻碳電極表面電聚合；所述的含N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米 諾（ABEI) WH2S04溶液中N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)濃度為0.01?0.0001 mol/L，H2S04 濃度為 0· 1 ?1 mol/L ; c. 將步驟（b)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加1?3 wt%戊二醛溶液10?20 μ L，靜置20?40分鐘； d. 將步驟（c)所得玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈后， 在玻碳電極表面滴加含10 μ mol/L DNA1的pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液10? 20 μ L，靜置20?40 min，使DNA1結(jié)合到電極表面； e. 將步驟（d)所得玻碳電極浸泡在10?20 μ L質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白 溶液中，封閉1?2 h，即得固載有DNA1的玻碳電極； (2) 固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的組裝 a. 配制一系列不同濃度的含汞離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液與含10 μ mol/L DNA2的 pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液按體積比1:1混合； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面，室 溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液清洗； c. 取適量pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液配制0· 01?0· 1 mg/mL的親和素 溶液，將10?20 μ L親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d. 將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，即 得到用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法， 其特征在于：所述的DNA1的結(jié)構(gòu)式為：5' -NH2-(CH2)6-GACTGTCTCGTTCGCTTAG-3' ；所述的 DNA2 的結(jié)構(gòu)式為：5' -biotin-CTATGCGTACGTGACTGTC-3'。
5. -種根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)萊離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的檢 測(cè)方法，其特征在于具體步驟如下： (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 a.將權(quán)利要求3所述的固載有DNA1的玻碳電極用0. 01?0. 1 M PBS緩沖液沖洗干凈 后，在pH = 9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度I0; b.將權(quán)利要求3所述的用于汞離子檢測(cè)的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器放入pH = 9?10 的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，獲得一系列不同濃 度的Hg2+溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值L，計(jì)算一系列不同濃度的Hg 2+溶液電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度的改變值Λ 1= L-Ii，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值Λ I與Hg2+溶液濃度之間的定量關(guān) 系； (2)待測(cè)樣品測(cè)定 a. 將含汞離子的待測(cè)樣品溶液與含10 μ mol/L DNA2的pH7?8的0. 01?0. 1 M PBS 緩沖液按體積比1:1混合； b. 取步驟（a)所得的混合溶液10?20 μ L，滴加到固載有DNA1的玻碳電極表面，室 溫下孵育20?30 min后，用pH = 7?8的0· 01?0· 1 M PBS緩沖液清洗； c. 將10?20 μ L用pH = 7?8的0.01?0· 1 M PBS緩沖液配制的0.01?0· 1 mg/ mL的親和素溶液滴加到步驟（b)所得玻碳電極表面，孵育5 min后； d. 將步驟（c)所得的玻碳電極用pH = 7?8的0. 01?0. 1 M PBS緩沖液清洗后，作 為工作電極，飽和甘汞電極或者Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)電極，構(gòu)建三電極 系統(tǒng)，置入pH = 9?10的0.05?0.2 Μ碳酸鹽緩沖液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)試電化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的改變值△ I與Hg2+溶液濃度之間的定量關(guān)系，計(jì)算得到待 測(cè)樣品溶液中Hg2+的準(zhǔn)確濃度C Hg。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)汞離子的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測(cè)方法，其特 征在于：所述的碳酸鹽緩沖液中含1 mM的過氧化氫，采用的電化學(xué)方法為電位階躍計(jì)時(shí)電 流法；電位階躍：〇 V階躍至1 V ;脈沖寬度：0. 25 s ;測(cè)量時(shí)間間隔：30 s。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK104155289SQ201410289966
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】郭智勇, 陳貝貝, 沙玉紅, 徐成銀, 郝婷婷 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)