一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中降血糖以及降血壓藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中31種常見降血壓、降血糖藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)檢測目標(biāo)化合物的確認；(2)樣品處理：采用有機溶劑沉淀蛋白法處理樣品；(3)初篩檢測：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分時間段進行初篩檢測；(4)對步驟(3)中初篩檢測陽性樣本進行復(fù)核：對于篩查檢測陽性樣本，處理濃縮后進行UPLC-MS/MS檢測；任選地，和(5)對步驟(4)中復(fù)核檢測陽性樣本進行復(fù)檢，可以采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QTOF)進行復(fù)檢。本發(fā)明根據(jù)每種藥物在本發(fā)明設(shè)定的檢測條件下，存在不同的保留時間，從而獨創(chuàng)性地完成了分段進行檢測的方法。本發(fā)明全部檢測完31種藥物所需要的時間可以在11分鐘以內(nèi)。
【專利說明】一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中降血糖以及降血壓藥物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中降血糖以及降血壓藥物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]飛行安全是關(guān)系國計民生的重大問題，高血壓、糖尿病是飛行員常見疾病，是許多失能性疾病的基礎(chǔ)疾病，也是飛行員停飛的重要原因。合理使用藥物仍然是目前治療高血壓、糖尿病的重要措施，從而預(yù)防高血壓、糖尿病所致的心、腎、腦、神經(jīng)系統(tǒng)等并發(fā)癥，延長飛行員飛行年限；然而降壓藥、降糖藥的不合理使用，可能會導(dǎo)致血壓、血糖急劇下降，造成飛行員突發(fā)失能。根據(jù)《民用航空人員體檢合格證管理規(guī)則》(CCAR-67FS-R2)的規(guī)定，中國民航飛行員收縮壓/舒張壓持續(xù)高于155/95mmHg不合格；患有使用胰島素控制的糖尿病不合格；使用可能影響安全履行職責(zé)的藥物控制的糖尿病不合格。根據(jù)《空勤人員和空中交通管制員體檢鑒定》(AP-67FS-002)的規(guī)定，允許飛行員使用的抗高血壓藥物為噻嗪類利尿齊IJ、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑或β受體阻滯劑，同時也規(guī)定了飛行員首次或更換抗高血藥物，應(yīng)經(jīng)至少3至4周的地面觀察，血壓控制良好，無癥狀，無所使用藥物的不良反應(yīng)，方能荷藥飛行。AP-67FS-002同時還規(guī)定，允許飛行員使用的口服降糖藥物包括雙胍類，或單獨使用的α -糖苷酶抑制劑，不能服用磺脲類藥物。初次口服降血糖藥物后，經(jīng)地面觀察至少60日，證實其病情得到控制，無所服用藥物的不良反應(yīng)。因此，嚴格遵守民航法規(guī)規(guī)定，科學(xué)合理使用降血壓、降血糖藥物，是保證飛行員健康，避免藥物不良反應(yīng)影響飛行安全的前提。
[0003]為了掌握飛行員糖尿病、高血壓的真實患病情況及服藥情況，避免因高血壓、糖尿病引起飛行員突發(fā)失能；同時，為了更準確掌握目前飛行員使用降血壓、降血糖藥物種類、用量等情況，具體分析當(dāng)前常用藥物在飛行中使用的有效性、安全性，對我國飛行員安全使用相關(guān)藥物進行評估和分析，需要對中國民航飛行員進行藥物專項檢查。
[0004]目前有相關(guān)的文獻報道，如高效薄層色譜法測定血液中氨氯地平的藥代動力學(xué)研究(“Detect1n and determinat1n of total amlodipine by highperformance thin-layerchromatography:a useful technique for pharmacokinetic studies，，，K.K.Pandya,等，Journal of Chromatography B, 667 (1995) 315-320,下稱文獻 I);膠束電動色譜法測定血清樣品中格列齊特等6種常用抗高血壓藥物(“Determinat1n of antihyperglycemicdrugs in nanomolar concentrat1n levels by micellar electrokinetic chromatographywith non-1onic surfactant，，，Vit " ezslav Maierj 等，Journal of ChromatographyA，1216(2009)4492 - 4498，下稱文獻2);高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)測定以猴的空白血液為樣品基質(zhì)中二甲雙胍等7種常用降血糖藥物(“Mult1-componentplasma quantitat1n of ant1-hyperglycemic pharmaceutical compounds using liquidchromatography - tandem mass spectrometry”，Ming Wang 等，Journal of ChromatographyB，856 (2007) 318 - 327，下稱文獻3)，以馬的空白血漿為樣品基質(zhì)中格列吡嗪等10種降血糖藥物(“Detect1n of ant1-diabetics in equine plasma and urine by liquidchromatography - tandem mass spectrometry，，，Emmie N.M.Hoa,,等，Journal ofChromatography B, 811 (2004)65 - 73,下稱文獻4),以及血衆(zhòng)樣品中包括降糖降壓藥物在內(nèi)的 55 種心血管治療藥物(“Development of an LC - MS/MS method for the quantitat1nof55compounds prescribed in combined card1vascular therapy，，，Oskar Gonzalez,等，Journal of Chromatography B, 879 (2011) 243 - 252,下稱文獻 5);超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)測定血清中辛伐他汀和阿托伐他汀等(“Ultra high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometric detect1n in clinical analysisof simvastatin and atorvastatin，，，Lucie Novakovaa,,等，Journal of ChromatographyB, 877 (2009) 2093 - 2103，文獻 6)。
[0005]但上述文獻中，文獻I和2采用的方法靈敏度較低，消耗樣本量大；文獻3和文獻4采用的是猴血漿或者馬血漿為空白基質(zhì)，與人體的空白血液基質(zhì)有差異，不能真實反映目標(biāo)藥物在人體內(nèi)受到的血液基質(zhì)影響；而且文獻4在樣品預(yù)處理時采用液-液萃取法，提取過程復(fù)雜、費時；另外，文獻3和4所檢測的降血糖藥物種類較少，一些臨床常用的藥物如二甲雙胍沒有涉及。文獻5檢測的心血管藥物種類多，其中包括臨床常用的降糖降壓藥物；預(yù)處理采用甲醇沉淀蛋白法，方法簡單快速；但采用的是液相色譜質(zhì)譜法，部分目標(biāo)化合物檢測限和定量限相比本實驗方法偏高。文獻6雖然也采用超高效液相色譜質(zhì)譜法，但檢測藥物就2種，種類少，而且樣品預(yù)處理采用的是固相萃取法，提取過程復(fù)雜、費時。
[0006]國內(nèi)外常用的降血壓、降血糖藥物種類有所不同，而且現(xiàn)有技術(shù)中上述檢測方法都不能涵蓋中國常用的藥物種類。此外，由于受檢對象多(除3萬多現(xiàn)役飛行員外，還用于招收飛行學(xué)生、外籍飛行員和軍轉(zhuǎn)民飛行員))，檢測時間有限(影響飛行員取得體檢合格證)，生物樣本量少，檢測目標(biāo)化合物多，現(xiàn)有方法無法滿足上述要求。
[0007]目前尚缺乏可用于飛行員的用藥情況的快速易行，靈敏可靠，具有良好的重現(xiàn)性和準確性的檢測血液常見降血壓、降血糖藥物的方法。
[0008]因此,本發(fā)明人旨在建立一種樣品處理簡便、筒靈敏、聞準確性的超聞效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，該方法還能夠同時測定人血漿中臨床上常用的11種降糖藥物、19種降壓藥物和I種降脂藥物，用來滿足飛行員體內(nèi)降糖降壓藥物的篩查檢測需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，旨在提供一種采用超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中常見降血壓、降血糖藥物的方法，以更準確掌握使用降血壓、降血糖藥物種類、用量等情況，尤其涉及對我國飛行員安全使用相關(guān)藥物進行評估和分析，以確定當(dāng)前常用降血壓、降血糖藥物在飛行中使用的有效性、安全性。
[0010]本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0011]一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中常見降血壓、降血糖藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0012]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，針對所選定的降血壓、降血糖藥物進行分時間段初篩檢測。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，所述方法還包括對上述步驟中初篩檢測陽性樣本進行復(fù)核的步驟，其中，所述復(fù)核步驟針對篩查檢測陽性樣本，進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，所述方法還包括對上述復(fù)核后的樣本進行復(fù)檢的步驟。優(yōu)選地，通過采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QTOF)進行復(fù)檢。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，所述初篩檢測法步驟中，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。
[0016]優(yōu)選的液相條件為:ACQUITYUPLCHSSC18 柱(1.8μπιΧ2.ImmX 150mm)，流動相為含0.1 %甲酸的5mM乙酸銨水溶液-含0.1 %甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min ;柱溫30°C;質(zhì)譜條件為:離子源:ESI+，離子源溫度120°C;去溶劑化溫度350°C;正離子方式檢測；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);液氮氣體流速650L/hr，毛細管電壓(capillary) 3.0KV。
[0017]優(yōu)選地，所述初篩檢測分時間段檢測。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟中的分段檢測可以分為6個時間段，優(yōu)選可以為5個時間段，或者4個時間段。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟中的檢測時間段分為:0-2分鐘，2-4分鐘，4-6分鐘，6_8分鐘，8-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘。
[0020]或者檢測時間段分為:0-2.5分鐘，2.5-5分鐘，5-7.5分鐘，7.5-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘。
[0021]或者檢測時間段分為:0-3分鐘，3-6分鐘，6-9分鐘，9分鐘以后，優(yōu)選只檢測到9分鐘。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，所述上述步驟中的復(fù)核步驟，以保留時間、兩對母離子/子離子對進行復(fù)核，優(yōu)選還以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)核步驟中，對于初篩檢測陽性樣本，在樣品預(yù)處理后，進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對，優(yōu)選還以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)檢步驟中，可以采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QTOF)進行復(fù)檢，以保留時間、精確分子量和/或同位素峰豐度比進行確認。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，所述藥物為選自如下的31種藥物:
[0026]11種降糖藥物:二甲雙胍(Metformin)、格列美脲(Glimepiride)、瑞格列奈(Repaglinide)、格列喹酮(Glurenor)、羅格列酮(Rosiglitazone)、西他列汀(Sitagliptin)、卩比格列酮(P1glitazone hyrochloride)、格列卩比嗪(Glipizide)、格列齊特(Gliclazide)、格列本服(Glybenzcyclamide)、那格列奈(Nateglinide)；
[0027]19種降壓藥物:氨氯地平(Amlodipin)、厄貝沙坦(Irbesartan)、硝苯地平(Nifedipine)、培哚普利(Perindopril)、卩引咕帕胺(Indapamide)、依那普利(Enalaprilmaleate)、拉貝諾爾(Labetalol)、尼卡地平(Nicardipine)、拉西地平(Lacidipine)、尼群地平(Nitrendipine)、非洛地平(Felodipine)、福辛普利(Fosinopril)、坎地沙坦酯(Candesartan cilextetil)、貝那普利(Benazepril)、纟顏沙坦(Valsartan)、維拉帕米(Verapamil)、氯沙坦(Losartan)、阿替洛爾(Atenolol)、地爾硫卓(Diltiazem)；
[0028]I種降脂藥:阿托伐他汀(Atorystatin)。因常與高血壓藥物組成復(fù)方制劑，故也列入檢測范圍。
[0029]上述藥物的選擇是根據(jù)《中國高血壓防治指南2010》、《中國2型糖尿病防治指南(2010年版)》推薦的降血壓、降血糖藥物目錄，并征求臨床醫(yī)生、臨床藥師、航空醫(yī)師、航空體檢醫(yī)師的意見后，綜合藥物是否吸收入血、入血后的活性代謝產(chǎn)物標(biāo)準品能否購買到等情況后進行的確認。
[0030]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中31種常見降血壓、降血糖藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0031 ] (I)檢測目標(biāo)化合物的確認
[0032]設(shè)定31種藥物作為檢測目標(biāo)化合物，分別是:
[0033]11種降糖藥物:二甲雙胍(Metformin)、格列美脲(Glimepiride)、瑞格列奈(Repaglinide)、格列喹酮(Glurenor)、羅格列酮(Rosiglitazone)、西他列汀(Sitagliptin)、卩比格列酮(P1glitazone hyrochloride)、格列卩比嗪(Glipizide)、格列齊特(Gliclazide)、格列本服(Glybenzcyclamide)、那格列奈(Nateglinide)；
[0034]19種降壓藥物:氨氯地平(Amlodipin)、厄貝沙坦(Irbesartan)、硝苯地平(Nifedipine)、培哚普利(Perindopril)、卩引達帕胺(Indapamide)、依那普利(Enalaprilmaleate)、拉貝諾爾(Labetalol)、尼卡地平(Nicardipine)、拉西地平(Lacidipine)、尼群地平(Nitrendipine)、非洛地平(Felodipine)、福辛普利(Fosinopril)、坎地沙坦酯(Candesartan cilextetil)、貝那普利(Benazepril)、纟顏沙坦(Valsartan)、維拉帕米(Verapamil)、氯沙坦(Losartan)、阿替洛爾(Atenolol)、地爾硫卓(Diltiazem)；
[0035]I種降脂藥:阿托伐他汀(Atorystatin)。因常與高血壓藥物組成復(fù)方制劑，故也列入檢測范圍。
[0036](2)樣品處理:采用有機溶劑沉淀蛋白法處理樣品；
[0037](3)初篩檢測:采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分時間段進行初篩檢測；
[0038](4)對步驟(3)中初篩檢測陽性樣本進行復(fù)核:對于篩查檢測陽性樣本，處理濃縮后進行UPLC-MS/MS檢測；任選地，和
[0039](5)對步驟(4)中復(fù)核檢測陽性樣本進行復(fù)檢，可以采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QT0F)進行復(fù)檢。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(2)的樣品處理步驟中，所述有機溶劑優(yōu)選為乙腈。
[0041]優(yōu)選地，先將待測抗凝血液離心分離后取上清液至離心管中，加入乙腈混合，再離心分離；取上清液備檢。
[0042]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(2)的樣品處理步驟包括:取待測抗凝血液5000rpm離心3min,取上清200 μ L至1.5mL離心管中，加入600uL乙腈，潤旋混合lmin, 12000rpm離心lOmin，取上清液備檢。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(3)的初篩檢測法步驟中，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。
[0044]步驟(3)中，優(yōu)選的液相條件為:ACQUITY UPLC HSS C18柱(1.8ymX2.1_X 150mm)，流動相為含0.1 %甲酸的5mM乙酸銨水溶液-含0.1 %甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min ;柱溫30°C;質(zhì)譜條件為:離子源:ESI+，離子源溫度120°C;去溶劑化溫度350°C ;正離子方式檢測；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);液氮氣體流速650L/hr,毛細管電壓(capillary) 3.0KV。
[0045]本發(fā)明，步驟(3)的分時間段掃描大大地提高靈敏度和駐留時間。由于同時對31種藥物進行掃描,完成一次樣本的檢測至少需要45分鐘以上；而本發(fā)明根據(jù)每種藥物在本發(fā)明設(shè)定的檢測條件下，存在不同的保留時間，從而獨創(chuàng)性地完成了分段進行檢測的方法。本發(fā)明全部檢測完31種藥物所需要的時間可以在20分鐘以內(nèi)，優(yōu)選15分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選12分鐘以內(nèi)，還更優(yōu)選11分鐘以內(nèi)。檢測準確性高達95%以上，優(yōu)選99%以上。
[0046]根據(jù)本發(fā)明，所述31種藥物的保留時間如下表I所示。
[0047]根據(jù)本發(fā)明，所述31種藥物的一對母離子/子離子對的數(shù)值如下表I所示。
[0048]根據(jù)本發(fā)明，所述31種藥物的血液中檢出限如下表I所示。
[0049]本發(fā)明步驟(3)中，根據(jù)保留時間和一對母離子/子離子對的同時匹配初步確定所檢測藥物，從而顯示為陽性。
[0050]表1、31種降壓藥、降糖藥的UPLC-MS/MS初篩定性分析參數(shù)
[0051]
錐孔電
母離子/子離子對碰撞龜量保留時間 JtA中栓由名稱壓
(MS)((:\) (min) _.(ng/mL)
(V)
二甲藏凰l?J4/70.?30201.385,0
何替洛爾2i7J3/M_42MIJf?
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羅鉻羅_358.08/135.044827LW?
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馬來酸儂驛普 S 37X17/90.98Il721520
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氬氣地平409.18/238.0722143.382.0
Il那普利425.23/351.2050223.712,0
維拉帕米455.32/165.0654303.690,5
尼卡地平480.24/315.1244263.590.5
?Ι 達幀齅3S6.1f/I32J432144.17U
爲(wèi)廁費 Λ4226453IJ
袼肩《ft嗪44(>.2?28164.322J
[0052]
格列齊特324,10/127.0440215,67?.S
硝苯地平347.15/315.1826 | 85.220.5
纈沙坦436,26/235.1428185,201J
氟沙坦423.19/207.11 3226 Ζ?βHM)
阿托伐他汀?；59,28/4_.25—^44—^|M —^5^8—^(Κ5
那袼列奈318.丨 7/166.05^30—^|14 —^6J4—^
尼群地乎36L1/3K.0f
瑞格列奈453.37/23§.2i—....“OJ
格列美脲491.32/352.22 332—|14 6J4(LS
格列本脲494.1l/168J5喔—^^^
非洛地平384.04/352.07一格列喹酮528.30/403.20 3212 TM03
福辛普利564.33/152.17 IiSi 8.35LO
坎地沙坦職611.29/423.18"—^^
拉西地平456.26/354.15'^3§Ii 8:87—^LO
[0053]本發(fā)明中，所述響應(yīng)值是指在色譜儀器分析中，組分通過檢測器時所給出的信號的大小。物質(zhì)的響應(yīng)值取決于物質(zhì)的性質(zhì)和濃度，同一含量的不同物質(zhì)由于其理化性質(zhì)的不同在同種檢測器上會產(chǎn)生不同的響應(yīng)值。在本發(fā)明，采用檢測限或者檢出限作為響應(yīng)值的評價標(biāo)準。
[0054]由于不同的檢測條件，各化合物的保留時間不同；不同的樣品處理方法和檢測條件，其檢測限或者檢出限也不同，所以本發(fā)明上述表格以及下述表格中列出的保留時間和檢測限是與本實驗優(yōu)化獲得的檢測方法相對應(yīng)的，也是判別待測樣品陽性與否的依據(jù)。其中檢測限為某特定方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中檢出待測物質(zhì)的最小濃度或量。它是判斷建立的檢測方法靈敏與否的重要參考指標(biāo)。
[0055]本發(fā)明中，豐度比是最大的離子峰(M+)作為基峰(100% )，其他離子峰與該離子峰的強度百分比。而這些離子豐度比或者同位素豐度比是根據(jù)圖譜比較獲得的。
[0056]本發(fā)明中，母離子裂解時會產(chǎn)生很多的碎片離子(子離子)，在優(yōu)化質(zhì)譜條件時選擇信號最好，穩(wěn)定性最高的I個或者多個子離子(稱為子離子對)進行檢測結(jié)果的評價，這樣目標(biāo)化合物的檢測信號就會越好，分辨率越高干擾越小，檢測結(jié)果的準確性越高。
[0057]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(3)中的分段檢測可以分為6個時間段，優(yōu)選可以為5個時間段，或者4個時間段。
[0058]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(3)中的檢測時間段分為:0-2分鐘，2-4分鐘，4-6分鐘，6-8分鐘，8-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘。
[0059]或者檢測時間段分為:0-2.5分鐘，2.5-5分鐘，5-7.5分鐘，7.5-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘。
[0060]或者檢測時間段分為:0-3分鐘，3-6分鐘，6-9分鐘，9分鐘以后，優(yōu)選只檢測到9分鐘。
[0061]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(4)中的復(fù)核步驟中，以保留時間、兩對母離子/子離子對，優(yōu)選還以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。
[0062]優(yōu)選地，步驟(4)的檢測條件優(yōu)選同步驟(3)。
[0063]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(4)復(fù)核步驟中，對于初篩檢測陽性樣本，在樣品預(yù)處理后，進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對，優(yōu)選還以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。
[0064]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(4)復(fù)核步驟的預(yù)處理包括如下步驟:先將待測抗凝血液離心分離后取上清液至離心管中，加入乙腈混合，再離心分離；取上清液氮氣吹干，殘渣用乙腈-乙酸銨水溶液溶解離心，取上清液備檢。優(yōu)選地，所述復(fù)核步驟的預(yù)處理包括:篩查陽性抗凝血液5000rpm離心3min,取上清200 μ L至1.5mL離心管中，加入600 μ L乙腈,潤旋混合lmin，12000rpm離心lOmin，取上清于60°C水浴中氮氣吹干，殘渣加入100 μ L80%乙腈-5mM乙酸銨水溶液溶解,潤旋混合lmin, 12000rpm離心1min,取上清液備檢。
[0065]根據(jù)本發(fā)明，所述相對離子豐度比的最大允許誤差如表2所示。
[0066]表2相對離子豐度比的最大允許相對誤差(％ )
[0067]
_______20^50Wm<--
允許的相對談差*20土2S^30±50
[0068]根據(jù)本發(fā)明，所述兩對母離子對/子離子對如表3第3欄所示。
[0069]優(yōu)選地，所述復(fù)核方法包括，將同一質(zhì)譜掃描時間段內(nèi)的化合物、結(jié)構(gòu)類似的化合物以及保留時間接近的化合物分在不同的復(fù)核組內(nèi)?；谠撛瓌t，所述分組方法可以有很多種。
[0070]根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)核方法分為如下五組:
[0071]第一組的藥物包括:二甲雙胍、羅格列酮、氨氯地平、吲噠帕胺、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
[0072]第二組的藥物包括:阿替洛爾、依那普利、貝那普利、厄貝沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酷；
[0073]第三組的藥物包括:培哚普利、維拉帕米、格列吡嗪、纈沙坦、格列本脲、拉西地平;
[0074]第四組的藥物包括:拉貝洛爾、地爾硫卓、氯沙坦、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平；
[0075]第五組的藥物包括:西他列汀、比格列酮、格列齊特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮。
[0076]根據(jù)本發(fā)明，所述分組方法如下表3所示。
[0077]表3、血液中常見降壓藥、降糖藥的UPLC-MS/MS復(fù)核定性分析參數(shù)
[0078]
復(fù)核方?錐孔電壓I碰撞能量保留時_ 血液申檢?
名_ 母離子/子離子對法(V)<eV)(min) 限(ι—ιιΟ
二甲一129J4/59.M — M14
第一組____ 1.385.0
Metformin j— 3020
[0079]
358J8/119jS———
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Nitrendipine 361.1(1/329.122822
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阿替洛爾267X1/71,634222..............................................................................................................1JfiJ
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[0082]根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)核方法還可以分為如下五組:
[0083]第一組的藥物包括:阿替洛爾、羅格列酮、貝那普利、厄貝沙坦、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
[0084]第二組的藥物包括:二甲雙胍、依那普利、氨氯地平、Π引咕帕胺、瑞格列奈、坎地沙坦酷；
[0085]第三組的藥物包括:培哚普利、地爾硫卓、氯沙坦、纈沙坦、格列本脲、拉西地平；
[0086]第四組的藥物包括:拉貝洛爾、維拉帕米、格列吡嗪、阿托伐他汀、那格列奈、格列喹酮；
[0087]第五組的藥物包括:西他列汀、比格列酮、格列齊特、尼卡地平、格列美脲、非洛地平。
[0088]當(dāng)然，將結(jié)構(gòu)相近或者保留時間相近的物質(zhì)分在不同的組進行測定的方法還可以為其他情形。本發(fā)明并不限于上述明確列舉的情形。
[0089]本發(fā)明步驟(5)中，所述復(fù)檢條件如下:
[0090]色譜柱:XBridgeTM C18 (2.1 X 150mm, 5 μ m)等；柱溫:30°C ;進樣量:5 μ L,離子源:電噴霧電離-正離子模式(ESI+);檢測方式:全掃描。
[0091 ] 流動相組成如下表4所示:
[0092]表4
[0093]
Time Flow speed Phase APhase B
(min) (mVmin)乙酸銨.—0.1% 甲膾醮)

酸緩沖液)
oOJm40
1.50.2m40
100.21090
is92iim
15.1OJ6040
25OJ6040
[0094]本發(fā)明步驟(5)中，根據(jù)保留時間和精確分子量的同時匹配初步確定所檢測藥物，從而顯示為陽性。
[0095]根據(jù)本發(fā)明，在復(fù)檢步驟中，所述31種藥物的保留時間如下表5所示。
[0096]根據(jù)本發(fā)明，所述31種藥物的精確分子量如下表5所示。
[0097]根據(jù)本發(fā)明，所述31種藥物的檢測限如下表5所示。
[0098]表5、血液中常見降壓藥、降糖藥的HPLC-QTOF分析參數(shù)
[0099]其中，干燥氣為7.0L/min，干燥溫度為200°C。
[0100]
I精確分子I

碰撞饞量離子λ量Rtmmm
目標(biāo)物名稱量t 、

(eV)CeV)Cng/nil)

('/)
^格列巉.^楊.1834535.250
^旙列夤調(diào)^528212653?J25
^兩酬療^408 1241-12Λ50
_二甲取胍^130.1087532.050
^那制奈^318.206353IL3
^麟瞢觸^3ef<B72532,825
^,雜蘼^Vi60()6g534Λ2S
^鋃那普利^377.2U57532,4?
拉貝潘爾329.18?532.550
^旙雕釋^324137753*.95
,格列鷸358.1204532-2W
旙列臭脲491.2289531L2W
—耱列本脲—4mA4njj10.7?Ο
^財應(yīng)乎^480.2089534Λ2
^拉西地平^456.236253<‘8
^尼鮮地乎^36L13撕531°*5W
—非洛騎—mmms312.625
^魂_國^357.1269533.0S
—端格列奈—453.27!95J10-5S
^硝笨地平^347.1138537.SH
^氬氟.^409.152553反7W
^見貝沙坦^429.2397535.80S
^托托伐他?了^559.2603S3婦.8W
—福辛普利—564 301253140100
坎地沙 JSSI611.2618531425
^貝那普韻^425.2076533.95
纈沙坦436.2349538.55

[0101]
維翻米455J910—IiI i4.55
氟沙坦423.1700535.25
地爾硫卓415.1540533.310
[0102]根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)檢方法中，如果待測樣本中檢出的色譜峰保留時間與空白血漿添加對照品的色譜峰保留時間比較，相差小于±0.1min ;并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，均出現(xiàn)目標(biāo)物分子離子峰，質(zhì)量數(shù)偏差小于5mDa，且同位素峰形匹配良好，則可判斷樣品中存在這種化合物。
[0103]本發(fā)明另一方面還提供了一種檢測血液中31種常見降血壓、降血糖藥物的方法的確認方法，其特征在于包括如下步驟:
[0104](I)專屬性考察
[0105]特異性:(a)選擇多個(優(yōu)選6個)不同來源的人空白血漿樣品，確定內(nèi)源性物質(zhì)是否對目標(biāo)化合物檢測有干擾；(b)確定不同化合物間是否存在相互干擾。
[0106](2)檢出限:依據(jù)信噪比S/N彡3判定(η = 3)。
[0107](3)樣品穩(wěn)定性:2倍檢出限濃度的質(zhì)控樣本(η = 5);分別考察進樣室溫(10°C ；15h)、冷藏(4°C ;7天)、冷凍(-18°C ;15天)后的穩(wěn)定性。
[0108]本發(fā)明另一目的是提供一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測飛行員血液中常見降糖降壓藥物的方法，包括如下步驟:
[0109](I)收集民航醫(yī)院臨床服藥患者血液樣本，應(yīng)用建立的超高效液相-質(zhì)譜法檢測方法進行檢測，并與實際服藥情況進行對比。
[0110](2)對飛行員血液樣本采用本發(fā)明的降糖降壓藥物篩查檢測，并與《民用航空人員體檢合格證管理系統(tǒng)》中記錄的飛行員患病情況、服藥情況進行對比，以確認是否存在不符合服藥要求的情形。
[0111]民航相關(guān)法規(guī)規(guī)定，允許飛行員使用的抗高血壓藥物為噻嗪類利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑或β受體阻滯劑。AP-67FS-002同時還規(guī)定，允許飛行員使用的口服降糖藥物包括雙胍類，或單獨使用的α-糖苷酶抑制齊U，不能服用磺脲類藥物。如果飛行員服用民航法規(guī)規(guī)定外的降糖降壓藥物即為不符合服藥要求；另外，私自服用降糖降壓藥物未上報民航局的也為不符合服藥要求。
[0112]本發(fā)明具有如下技術(shù)效果:
[0113]1.我們采用超高效液相-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀-對以上31種化合物進行研究，建立了《血液中31種常見降壓、降糖藥物的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法》，并對方法進行了確證研究，包括專屬性、重現(xiàn)性、檢出限、樣品穩(wěn)定性等的研究，結(jié)果表明該檢測方法滿足《中華人民共和國藥典》(2010年版二部)的相關(guān)要求；并經(jīng)查閱文獻和藥品說明書等，本方法檢出限(η = 3)均低于藥物有效血藥濃度，滿足實際檢測的要求。
[0114]2.自方法建立以來，本實驗室不同的檢測人員對3批血漿盲樣進行了檢測，其中每2名檢測人員檢測同一份盲樣，以便同時進行結(jié)果比對和重現(xiàn)性考察。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第I批盲樣含有二甲雙胍、氯沙坦、貝那普利和氨氯地平；第二批盲樣含有格列喹酮、非洛地平和格列齊特；第3批盲樣含有厄貝沙坦、拉西地平和纈沙坦。每2名檢測人員檢測結(jié)果一致，檢測結(jié)果準確。不同檢測人員進行盲樣檢測考核，均得到滿意結(jié)果，表明檢測結(jié)果證明重現(xiàn)性良好；對14例臨床使用藥物的病人血樣進行了檢測，檢測結(jié)果與服藥情況基本相符；并對185名飛行員血液樣本進行了檢測，經(jīng)與《民用航空人員體檢合格證管理系統(tǒng)》核對，檢測結(jié)果與飛行員患病情況、或服藥情況相符合。
[0115]3.本發(fā)明人建立的常見降糖降壓藥物的超高效液相色譜質(zhì)譜法，采用乙腈直接沉淀蛋白，樣品預(yù)處理簡單，分析時間僅用10多分鐘即可對31種藥物進行快速檢測；從以上結(jié)果可以看出，該方法快速易行，靈敏可靠，具有良好的重現(xiàn)性和準確性，可作為實驗室檢測標(biāo)準執(zhí)行，用于飛行員的用藥情況檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0116]圖1為臨床樣本(編號42號)初篩檢測結(jié)果圖譜；
[0117]圖2為臨床樣本(編號42號)復(fù)核檢測結(jié)果圖譜；
[0118]圖3為臨床樣本(編號43號)初篩檢測結(jié)果圖譜；
[0119]圖4為臨床樣本(編號43號)復(fù)核檢測結(jié)果圖譜；
[0120]圖5中，(a)為人空白血漿樣品總離子流圖；(b)為二甲雙胍、羅格列酮、氨氯地平、吲噠帕胺、硝苯地平、尼群地平和福辛普利的提取離子對色譜圖(TIC)。
[0121]圖6中，(a)為人空白血漿樣品總離子流圖；(b)為阿替洛爾、依那普利、貝那普利、厄貝沙坦、氯沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酯的提取離子對色譜圖(TIC)。
[0122]圖7中，(a)為人空白血漿樣品總離子流圖；(b)為培哚普利、維拉帕米、格列吡嗪、纈沙坦、格列本脲、拉西地平的提取離子對色譜圖(TIC)。
[0123]圖8中，(a)為人空白血漿樣品總離子流圖；(b)為拉貝洛爾、地爾硫卓、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平的提取離子對色譜圖(TIC)。
[0124]圖9中，(a)為人空白血漿樣品總離子流圖；(b)為西他列汀、比格列酮、格列齊特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮的提取離子對色譜圖(TIC)。
[0125]圖10:血漿濃度為100.0ng/mL的福辛普利提取特征離子色譜圖(TIC)
[0126]圖11:血衆(zhòng)濃度為50.0ng/mL的二甲雙胍、西他列汀、拉貝諾爾、依那普利和格列吡嗪提取特征離子色譜圖(TIC)。
[0127]圖12:血漿濃度為25.0ng/mL的培哚普利、拉西地平、格列喹酮、吲哚帕胺、那格列奈和非洛地平提取特征離子色譜圖(TIC)。
[0128]圖13:血漿濃度為10.0ng/mL的羅格列酮、硝苯地平、氨氯地平、厄貝沙坦、阿托伐他汀、地爾硫卓、尼群地平、格列美脲和格列本脲提取特征離子色譜圖(TIC)。
[0129]圖14:血漿濃度為5.0ng/mL的貝那普利、瑞格列奈、坎地沙坦酯、氯沙坦、纈沙坦、吡格列酮、格列齊特和維拉帕米提取特征離子色譜圖(TIC)。
[0130]圖15:血漿濃度為2.0ng/mL的尼卡地平提取特征離子色譜圖(TIC)。
[0131]圖16:人空白血漿樣品色譜圖(TIC)。
[0132]圖17: (a) (b) (c)為5位實驗室檢測人員檢測的三批盲樣結(jié)果。

【具體實施方式】
[0133]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳細說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，下述實施例不是對本發(fā)明保護范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改進和變化，都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0134]實施例1建立血液中降糖降壓藥物檢測方法
[0135]1.1檢測目標(biāo)化合物的確立及化合物的基本性質(zhì)
[0136]31種常用降血壓、降血糖藥物相關(guān)的化學(xué)特性見表6 ;藥物適應(yīng)癥、不良反應(yīng)、文獻報道代謝半衰期、最低檢出限、最低定量限見表7-1和7-2。
[0137]表6目標(biāo)化合物化學(xué)性質(zhì)列表
[0138]
序中文名稱 Λ學(xué)式/分子量鍤構(gòu)式CAS號
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[0143]表7-1、31種藥物半衰期、最低檢出限、最低定量限
[0144]
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(緩制6.2)
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(控釋片2-5)
[0145]
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4.5-12


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[0147]表6_2、31種藥物適應(yīng)癥、不良反應(yīng)列表
[0148]
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[0149]
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見群地平高土壓
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氟氣地+
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-賢血管性高血壓-各級心力衰竭
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-充血性心衰

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朋沙坦的2型糖尿病腎病
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坎地沙坦醸原發(fā)性高▲壓
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典制刺酶升高，肌病
[0150]1.2目標(biāo)化合物檢測儀器方法的建立
[0151]1.2.1UPLC-MS/MS檢測方法的建立
[0152]1.2.1.1 原理
[0153]本法采用有機溶劑沉淀血漿蛋白，高速離心去除蛋白，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。對于篩查檢測陽性樣本，處理濃縮后進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對及豐度比、響應(yīng)值增加進行復(fù)核。
[0154]1.2.1.2試劑和儀器
[0155]1.2.1.2.1 試劑
[0156]除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。二甲雙胍、氨氯地平、厄貝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、噴哚帕胺、依那普利、拉貝諾爾、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、貝那普利、纈沙坦、維拉帕米、氯沙坦、阿替洛爾、地爾硫卓對照品，純度彡97%。乙腈(GR);乙酸銨(GR);甲酸(優(yōu)級純)；去離子水由超純水儀(Millipore純水系統(tǒng))制備。
[0157]1.2.1.2.2 儀器
[0158]超高效液相色譜/三重四級桿質(zhì)譜儀(TQD UPLC-MS，美國沃特斯有限公司)；可調(diào)移液器(法國吉爾森)；SIGMA3-18K型臺式高速冷凍離心機(德國)；賽多利斯BT25S十萬分之一天平(德國)；漩渦混勻器。
[0159]采用Waters 公司色譜柱ACQUITY UPLC HSS C18 柱(1.8 μ mX 2.1mmX 150mm);配制31種化合物0.5 μ g/mL的甲醇溶液,在質(zhì)譜進樣口直接連續(xù)進樣,使用質(zhì)譜自動優(yōu)化功能，分別優(yōu)化31種化合物的錐孔電壓、碰撞能量、氬氣壓強、篩選離子對等。
[0160]1.2.1.3樣品預(yù)處理方法
[0161]初篩檢測時,待測抗凝血液5000印111離心31]1；[11,取上清20(^ L至1.5mL離心管中，加入600 μ L乙腈,潤旋混合lmin, 12000rpm離心1min,取上清備檢。
[0162]在初篩檢測法步驟中，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。液相條件為:ACQUITY UPLC HSS C18 柱(1.8 μ mX 2.1mmX 150mm)，流動相為含 0.1 % 甲酸的 5mM 乙酸銨水溶液-含0.1%甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min ;柱溫30°C ;質(zhì)譜條件為:離子源:ESI+，離子源溫度120°C;去溶劑化溫度350°C;正離子方式檢測；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);液氮氣體流速650L/hr，毛細管電壓(capillary) 3.0KV。
[0163]所述31種藥物的保留時間、母離子對/子離子對、血液中檢出限如本發(fā)明表I所
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[0164]1.2.1.4陽性樣本復(fù)檢方法
[0165]對于初篩檢測陽性樣本，進行復(fù)核檢測，處理方法如下:取篩查陽性血漿樣品200 μ L至1.5mL離心管中，加入600 μ L乙腈,潤旋混合lmin, 12000rpm離心1min,取上清氮氣吹干，殘渣加入100 μ L80%乙腈-5mM乙酸銨水溶液溶解，渦旋混合lmin，12000rpm離心5min，取上清液備檢。
[0166]處理樣品后，進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對及豐度t匕、響應(yīng)值增加進行復(fù)核。復(fù)核方法分五組，同一質(zhì)譜掃描時間段內(nèi)的化合物、結(jié)構(gòu)類似的化合物以及保留時間接近的化合物分在不同的復(fù)核方法組內(nèi)。31種藥物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間如表3所示。
[0167]各取6個不同來源的人空白血漿樣品200 μ L，按“1.2.1.3”項樣品預(yù)處理方法處理后，作UPLC-MS/MS檢測，得到人空白血漿樣品總離子流圖；另外，各取這6個不同來源的人空白血漿樣品200μ L，分別添加31種化合物的對照品工作液，制成質(zhì)量濃度為上述化合物的2倍最低檢測限濃度的質(zhì)控樣品，同法處理后作UPLC-MS/MS檢測，得到各化合物提取特征離子色譜圖。兩者比對，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)化合物檢測有干擾(見圖5?圖9)，而且，目標(biāo)化合物峰形良好，所優(yōu)選出的離子對質(zhì)譜峰響應(yīng)信號較高，各化合物間分離度良好。
[0168]1.2.2HPLC-QT0F復(fù)核檢測方法的建立
[0169]1.2.2.1試劑與儀器
[0170]1.2.2.1.1 試劑
[0171]除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。二甲雙胍、氨氯地平、厄貝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、噴咕帕胺、依那普利、拉貝諾爾、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、貝那普利、纈沙坦、維拉帕米、氯沙坦、地爾硫卓對照品，純度彡97%。乙腈(GR);乙酸銨(GR);甲酸(優(yōu)級純)；去離子水由超純水儀(Millipore純水系統(tǒng))制備。
[0172]L 2.2.1.2 儀器
[0173]液相色譜-高分辨飛行時間-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Bruker Q-TOF MS);可調(diào)移液器(法國吉爾森)；SIGMA3-18K型臺式高速冷凍離心機(德國)；數(shù)控恒溫水浴氮吹儀SE512J型(北京帥恩科技有限責(zé)任公司)；賽多利斯BT25S十萬分之一天平(德國)；漩渦混勻器。
[0174]1.2.2.1.3 質(zhì)譜參數(shù)
[0175]離子源:電噴霧電離-正離子模式(ESI+);檢測方式:全掃描，掃描范圍50amu?100amu ;干燥氣(Dry Gas) 7.0L/min ;干燥溫度(Dry Temp) 200。。;離子能量值:3eV ；CE 值:3?5eV ;二甲雙胍、氨氯地平、厄貝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、吲噠帕胺、依那普利、拉貝諾爾、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、貝那普利、纈沙坦、維拉帕米、氯沙坦、地爾硫卓的監(jiān)測離子m/z分別為130.1087、409.1525,429.2397,347.1138,559.2603,491.2289,453.2719,528.2126,358.1204、408.1241,357.1269,446.1834,324.1377,494.1470,318.2063,369.2372,366.0668、377.2057,329.1862,480.2089,456.2362,361.1396,384.0769,564.3012,611.2618、425.2076,436.2349,455.2910,423.1700,415.1540。
[0176]1.2.2.2樣品預(yù)處理
[0177]復(fù)核檢測時，取篩查陽性血漿樣品200μ L至1.5mL離心管中，加入600 μ L乙腈，潤旋混合lmin, 12000rpm離心1min,取上清氮氣吹干,殘洛加入100 μ L80 %乙腈_5mM乙酸銨水溶液溶解，潤旋混合lmin, 12000rpm離心5min,取上清液備檢。
[0178]1.2.2.3方法學(xué)考察
[0179]1.2.2.3.1 檢出限
[0180]200 μ L空白血漿若干份，分別添加31種化合物對照品溶液，制備成質(zhì)量濃度為100、50、25、10、5、2ng/mL的質(zhì)控樣品(η = 3)，按“ 1.2.2.2”項樣品預(yù)處理方法處理樣品后，作UPLC-MS/MS檢測。按信噪比S/N彡3計(圖10?圖15)，得到31個化合物的檢出限(見表5)。
[0181]1.2.2.3.2 特異性
[0182]各取6個不同來源的人空白血漿樣品200μ L，按“1.2.2.2”項處理后，作HPLC-MS檢測，得到人空白血漿樣品總離子流圖；結(jié)果與“1.2.2.3.1”檢出限項下圖譜比較，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)化合物檢測有干擾(見圖16)。
[0183]由此可見，我們建立了 31種常見降血壓、降血糖藥物的液相色譜質(zhì)譜檢測方法，并考察了方法的特異性、檢出限等，結(jié)果表明所建方法滿足藥典指導(dǎo)原則的要求，簡單易行、科學(xué)穩(wěn)定可靠，可作為開展常見降血壓、降血糖藥物篩查檢測的準則。
[0184]實施例2血液降糖降壓藥物檢測方法的應(yīng)用
[0185]為了檢驗實施例1建立的超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測血液樣本中降糖降壓藥物結(jié)果的準確性，我們收集了 14例民航醫(yī)院臨床病人的血液樣本，采用實施例1的血液中常見降血壓、降血糖藥物UPLC-MS/MS檢測方法對其進行了降糖降壓藥物篩查檢測。結(jié)果見表8。
[0186]表8.臨床病人血液中降糖降壓藥物的檢測表
[0187]
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[0189]從以上結(jié)果可以看出，檢測結(jié)果與醫(yī)囑服藥資料基本相符，表明所建立的檢測降糖降壓藥物的液相色譜-質(zhì)譜方法靈敏可靠。
[0190]檢測方法建立后，本單位配制了 3批盲樣，對實驗室5名檢測人員進行了考核。其中每2名檢測人員檢測同一份盲樣，以便同時進行結(jié)果比對和重現(xiàn)性考察。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第I批盲樣含有二甲雙胍、氯沙坦、貝那普利和氨氯地平；第二批盲樣含有格列喹酮、非洛地平和格列齊特；第3批盲樣含有厄貝沙坦、拉西地平和纈沙坦。每2名檢測人員檢測結(jié)果一致，分別與質(zhì)量業(yè)務(wù)辦公室核對，檢測結(jié)果準確。表明5名檢測人員有能力進行常見降糖降壓藥物檢測，以及不同的檢測人員檢測結(jié)果的重現(xiàn)性良好。(圖17)
[0191]另外，我們應(yīng)用建立的降糖降壓藥物檢測方法對185名飛行員血液樣本進行篩查檢測，實現(xiàn)了小樣本量、簡單前處理、在10分鐘內(nèi)對31種藥物的快速檢測，檢測結(jié)果經(jīng)與《民用航空人員體檢合格證管理系統(tǒng)》比對，與飛行員的患病情況、或服藥情況相符合，表明所建立的檢測方法簡單易行、準確可靠、實用性強，可作為民航醫(yī)學(xué)中心檢驗標(biāo)準執(zhí)行。
[0192]實驗室依據(jù)《中華人民共和國藥典(2010年版)》二部附錄XIX B〈藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則〉中規(guī)定，并參考相關(guān)的藥代動力學(xué)研究文獻，建立了常見的31種降糖降壓藥物液質(zhì)檢測方法，并進行了方法學(xué)驗證研究，包括特異性、檢出限、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，結(jié)果符合《中華人民共和國藥典》(2010年版二部)的相關(guān)要求。經(jīng)查閱文獻，本方法檢出限(η = 3)均低于藥物有效血藥濃度，滿足實際檢測的要求。
【權(quán)利要求】
1.一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測血液中常見降血壓、降血糖藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，針對所選定的降血壓、降血糖藥物進行分時間段初篩檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述方法還包括對上述步驟中初篩檢測陽性樣本進行復(fù)核的步驟，其中，所述復(fù)核步驟針對篩查檢測陽性樣本，進行超高效液相-質(zhì)譜法檢測。 優(yōu)選地，所述復(fù)核步驟中，以保留時間、兩對母離子/子離子對(優(yōu)選還包括以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。更優(yōu)選地，所述復(fù)核步驟中，對于初篩檢測陽性樣本，在樣品預(yù)處理后，進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對(優(yōu)選還包括以豐度比和/或響應(yīng)值)增加進行復(fù)核。 優(yōu)選地，所述方法還包括對上述復(fù)核后的樣本進行復(fù)檢的步驟。更優(yōu)選地，通過采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QTOF)進行復(fù)檢。 更優(yōu)選地，所述復(fù)檢步驟中，采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QT0F)進行復(fù)檢，以保留時間、精確分子量和/或同位素峰豐度比進行確認。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述初篩檢測法步驟中，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。 優(yōu)選的液相條件為:ACQUITY UPLC HSS C18柱(1.8ymX2.1mmX 150mm)，流動相為含0.1 %甲酸的5mM乙酸銨水溶液-含0.1 %甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min ;柱溫300C ;質(zhì)譜條件為:離子源:ESI+，離子源溫度120°C ;去溶劑化溫度350°C ;正離子方式檢測；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);液氮氣體流速650L/hr，毛細管電壓(capillary) 3.0KV。 優(yōu)選地，所述初篩檢測分時間段檢測。更優(yōu)選地，所述步驟中的分段檢測可以分為6個時間段，優(yōu)選可以為5個時間段，或者4個時間段。還更優(yōu)選地，所述步驟中的檢測時間段分為:0-2分鐘，2-4分鐘，4-6分鐘，6-8分鐘，8_10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘?；蛘邫z測時間段分為:0-2.5分鐘，2.5-5分鐘，5-7.5分鐘，7.5-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘?；蛘邫z測時間段分為:0-3分鐘，3-6分鐘，6-9分鐘，9分鐘以后，優(yōu)選只檢測到9分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其特征在于，所述藥物為選自如下的31種藥物: 11種降糖藥物:二甲雙胍、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、那格列奈； 19種降壓藥物:氨氯地平、厄貝沙坦、硝苯地平、培哚普利、吲噠帕胺、依那普利、拉貝諾爾、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、貝那普利、纈沙坦、維拉帕米、氯沙坦、阿替洛爾、地爾硫卓； I種降脂藥:阿托伐他汀。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (I)檢測目標(biāo)化合物的確認 設(shè)定31種藥物作為檢測目標(biāo)化合物，分別是: 11種降糖藥物:二甲雙胍、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、那格列奈； 19種降壓藥物:氨氯地平、厄貝沙坦、硝苯地平、培哚普利、吲噠帕胺、依那普利、拉貝諾爾、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、貝那普利、纈沙坦、維拉帕米、氯沙坦、阿替洛爾、地爾硫卓； I種降脂藥:阿托伐他??； (2)樣品處理:采用有機溶劑沉淀蛋白法處理樣品； (3)初篩檢測:采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分時間段進行初篩檢測； (4)對步驟(3)中初篩檢測陽性樣本進行復(fù)核:對于篩查檢測陽性樣本，處理濃縮后進行UPLC-MS/MS檢測；任選地，和 (5)對步驟(4)中復(fù)核檢測陽性樣本進行復(fù)檢，可以采用高效液相-高分辨飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QTOF)進行復(fù)檢。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述步驟(2)的樣品處理步驟中，所述有機溶劑優(yōu)選為乙腈。 優(yōu)選地，先將待測抗凝血液離心分離后取上清液至離心管中，加入乙腈混合，再離心分離；取上清液備檢。 更優(yōu)選地，所述步驟(2)的樣品處理步驟包括:取待測抗凝血液5000rpm離心3min，取上清200 μ L至1.5mL離心管中，加入600uL乙腈,潤旋混合lmin, 12000rpm離心1min,取上清液備檢。 所述步驟(3)的初篩檢測法步驟中，以保留時間、一對母離子/子離子對進行篩查分析。 優(yōu)選地，步驟(3)中的液相條件為:ACQUITY UPLC HSS C18柱(1.8ymX2.1_X 150mm)，流動相為含0.1 %甲酸的5mM乙酸銨水溶液-含0.1 %甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min ;柱溫30°C;質(zhì)譜條件為:離子源:ESI+，離子源溫度120°C;去溶劑化溫度350°C ;正離子方式檢測；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);液氮氣體流速650L/hr,毛細管電壓(capillary) 3.0KV0 更優(yōu)選地，所述31種藥物的保留時間、一對母離子/子離子對和/或血液中檢出限如下表所示。 31種降壓藥、降糖藥的UPLC-MS/MS初篩定性分析參數(shù)
錐孔電III L母離子/子離子對艮 磁撞総量保留時間 Jtft申檢?
CMS)^ (e￥) (min)限 Cng/mD二甲雙胍129.94/70.923§201.38SJ時替洛爾267.13/144.994226 ~1395J羅._388,08/135,044827IJ?￠,5 福.涵32fJ5/9M8283?2:‘>9SJ......4SSS?p#<1...............................miwojs.............1sη.........1m........? 藝.漏369.26/172J5Si242.68OJ
Jt 酸樣列明357J)WI34.1ft54282J9OJ 地爾魔車415.19/177.99 ^4024?Μθ5
氟氣地平409.18/238.0722143.382.0 SI 那普 H425.23/351.2050223.702.0
維拉帕米455.32/165.0654303.690.5
尼卡地平48β.24/315.124426$.59?
吲達 *1 驗3iiJfrt32._31M4.17IJ
Jtlt-fc429.26/207.1042M4.531.0
格列嶢.44C21/321J628164.322.0 格列齊特324_i27.M補215.67CIJ
JflWif.347.15/315.1826$5.220.5 類沙坦436.26/235.M28115.2010.0 氣沙坦423._9/207.亂_M264.18WJ
PT 糕錢他汀S5f.28M40.2544245.9$OJ
那格對奈318.17/166.0530144,541,0
Λ 鮮地平361J WIS-OT21186.392.1)
璃格到奈4S3.3W230.203?31gjOJ
格到美脲491.32/352.22332146340,5
格列本籐49411/168.9532386.25OJ
非洛地平3S4J4/352J1M187.602.1)
格到夤酬S28.3_3.2fJ32127.320.5
福辛普調(diào)564.33/152.1716508.351.0
坡地沙坦曝611.2W423.18MW8.35OJ
拉西地平456.26/3S415Si168.87U
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的分段檢測可以分為6個時間段，優(yōu)選可以為5個時間段，或者4個時間段。優(yōu)選地，所述步驟⑶中的檢測時間段分為:0-2分鐘，2-4分鐘，4-6分鐘，6-8分鐘，8_10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘?；蛘邫z測時間段分為:0-2.5分鐘，2.5-5分鐘，5-7.5分鐘，7.5-10分鐘，10分鐘以后，優(yōu)選只檢測到10分鐘?；蛘邫z測時間段分為:0-3分鐘，3-6分鐘，6-9分鐘，9分鐘以后，優(yōu)選只檢測到9分鐘。 更優(yōu)選地，所述步驟(4)中的復(fù)核步驟中，以保留時間、兩對母離子/子離子對及豐度t匕、響應(yīng)值增加進行復(fù)核。 還更優(yōu)選地，所述步驟(4)復(fù)核步驟中，對于初篩檢測陽性樣本，在樣品預(yù)處理后，進行UPLC-MS/MS檢測，以保留時間、兩對母離子/子離子對，優(yōu)選還以豐度比和/或響應(yīng)值增加進行復(fù)核。 所述步驟(4)復(fù)核步驟的預(yù)處理包括如下步驟:先將待測抗凝血液離心分離后取上清液至離心管中，加入乙腈混合，再離心分離；取上清液氮氣吹干，殘渣用乙腈-乙酸銨水溶液溶解離心，取上清液備檢。優(yōu)選地，所述復(fù)核步驟的預(yù)處理包括:篩查陽性抗凝血液5000rpm離心3min,取上清200 μ L至1.5mL離心管中，加入600 μ L乙腈,潤旋混合lmin,12000rpm離心lOmin，取上清于60°C水浴中氮氣吹干，殘渣加入100 μ L80%乙腈_5mM乙酸銨水溶液溶解，渦旋混合lmin，12000rpm離心lOmin，取上清液備檢。 最優(yōu)選地，所述兩對母離子對/子離子對、保留時間和/或血液中檢出限如下表所示。 優(yōu)選地，所述復(fù)核方法包括，將同一質(zhì)譜掃描時間段內(nèi)的化合物、結(jié)構(gòu)類似的化合物以及保留時間接近的化合物分在不同的復(fù)核組內(nèi)。優(yōu)選地，所述復(fù)核方法分為如下五組: 第一組的藥物包括:二甲雙胍、羅格列酮、氨氯地平、吲噠帕胺、硝苯地平、尼群地平、福辛普利； 第二組的藥物包括:阿替洛爾、依那普利、貝那普利、厄貝沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酷； 第三組的藥物包括:培哚普利、維拉帕米、格列吡嗪、纈沙坦、格列本脲、拉西地平； 第四組的藥物包括:拉貝洛爾、地爾硫卓、氯沙坦、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平； 第五組的藥物包括:西他列汀、比格列酮、格列齊特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮。 血液中常見降壓藥、降糖藥的UPLC-MS/MS復(fù)核定性分析參數(shù)I 镎乳電血液中檢 復(fù)核方 母離子/號離子碰撞ft 保留時 名稱 壓由限 I潘 對量(eV)聞(niln>
Cv)CngML)
二甲藏ΛΙ 129.94/59.93 3014
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Metfermin 129.94/70.92 3020 第一 fc I 格列 _ 358J8/llf.§6 4858I1.97 f.5
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Labetalol 329.1M62.12 2832
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^鉻列鑛^ 324.1/110.M4?24
GIIclazide 324.10/127.04 ^4020
^尼卡辦^ 480.24/166.08 ^4416^
Nicardipine 480.24/315.12 —^4426
^那綱奈^-318.17/125.04— ^?i^
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Glurenor 一 528.30/403.20— 32?優(yōu)選地，所述分組還包括如下方式:第一組的藥物包括:阿替洛爾、羅格列酮、貝那普利、厄貝沙坦、硝苯地平、尼群地平、福辛普利； 第二組的藥物包括:二甲雙胍、依那普利、氨氯地平、Π引咕帕胺、瑞格列奈、坎地沙坦酷； 第三組的藥物包括:培哚普利、地爾硫卓、氯沙坦、纈沙坦、格列本脲、拉西地平； 第四組的藥物包括:拉貝洛爾、維拉帕米、格列吡嗪、阿托伐他汀、那格列奈、格列喹酮； 第五組的藥物包括:西他列汀、比格列酮、格列齊特、尼卡地平、格列美脲、非洛地平。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述復(fù)檢條件如下:色譜柱:XBridge TM C18 (2.1 X 150mm, 5 μ m)等;柱溫:30°C ;進樣量:5 μ L，離子源:電噴霧電離-正離子模式(ESI+);檢測方式:全掃描。 流動相為5mmol/mL乙酸銨+0.1%甲酸緩沖液與乙腈+0.1%甲酸的兩相。 優(yōu)選步驟(5)中，根據(jù)保留時間和精確分子量的同時匹配初步確定所檢測藥物，從而顯示為陽性。更優(yōu)選地，在復(fù)檢步驟中，所述31種藥物的保留時間、精確分子量和/或檢測限如下表所示。 表、血液中常見降壓藥、降糖藥的HPLC-QTOF分析參數(shù)^ + 離子能量Rt栓測隊 覉標(biāo)物名稱 量丨M+H|+撞靝量)# %I

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9.一種權(quán)利要求1-8任一項的檢測血液中31種常見降血壓、降血糖藥物的方法的確認方法，其特征在于包括如下步驟: (1)專屬性考察 特異性:(a)選擇多個(優(yōu)選6個)不同來源的人空白血漿樣品，確定內(nèi)源性物質(zhì)是否對目標(biāo)化合物檢測有干擾；(b)確定不同化合物間是否存在相互干擾； (2)檢出限:依據(jù)信噪比S/N彡3判定(η= 3)； (3)樣品穩(wěn)定性:2倍檢出限濃度的質(zhì)控樣本(η= 5);分別考察進樣室溫(10°C;15h)、冷藏(4°C ;7天)、冷凍(_18°C ;15天)后的穩(wěn)定性。
10.一種超高效液相-質(zhì)譜法檢測飛行員血液中常見降糖降壓藥物的方法，包括如下步驟: (1)收集臨床服藥患者血液樣本，應(yīng)用權(quán)利要求1-8任一項的方法進行檢測，并與實際服藥情況進行對比； (2)對飛行員血液樣本采用本發(fā)明的降糖降壓藥物篩查檢測，并與《民用航空人員體檢合格證管理系統(tǒng)》中記錄的飛行員患病情況、服藥情況進行對比，以確認是否存在不符合服藥要求的情形。
【文檔編號】G01N30/02GK104133006SQ201410273501
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】李清艷, 喬湜, 李松林, 許海山, 王偉, 徐先發(fā), 劉國如, 于紅燕, 丁仁奎, 劉永鎖 申請人:中國民用航空局民用航空醫(yī)學(xué)中心