一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法，是先將待篩選的若干種中藥材分別粉碎，再分別用有機(jī)溶劑提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；此上清液即作為待測樣本溶液；再在微孔板中加入反應(yīng)體系；將空白對照樣品和待測樣品一起置于酶標(biāo)儀中震蕩孵育30min后，迅速在每孔中加入0.04～0.2mmol/L的乙醛溶液15μL，搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值；利用酶標(biāo)儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對應(yīng)樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；得出樣品曲線凈面積NetAUC值；本發(fā)明方法一次可篩選上百種甚至幾百種中藥材,快速、準(zhǔn)確率高，操作方便。
【專利說明】—種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高通量篩選活性物質(zhì)的方法，具體是一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國是一個具有深厚酒文化底蘊的國家，大小喜事、聚會以及各種節(jié)日都離不開酒。但過量飲酒給人類健康和社會治安造成危害的報道已屢見不鮮。傳統(tǒng)中藥用于解酒有悠久的歷史，目前，我國常用中藥材達(dá)幾百種，如何從常用中藥材中尋找具有一定解酒功效的中藥，并將其開發(fā)成具有解酒功效，安全方便的藥物或保健品，使醉酒者服用后可快速起效，已成為相關(guān)行業(yè)開發(fā)解酒產(chǎn)品的主要途徑。現(xiàn)在常規(guī)的篩選方法一次只能篩選一種中藥，耗時長，試劑用量大，不能滿足企業(yè)產(chǎn)品開發(fā)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是提供一種高效、快捷、簡便的具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括下述步驟:
a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至20~100目，分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；或?qū)⒋Y選的若干活性因子分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；此上清液即作為待測樣本溶液；
b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應(yīng)體系:50_200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸鉀緩沖液75-90 μ L，0.1~0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10-15 μ L，0.1~2mg/ml乙醛脫氫酶20-25 μ L, 0.0625 ~20mmol/L NAD+ 溶液 30 μ L ;
c.再在上述其中一個微孔中加入90mmol/L、ρΗ8.5的磷酸鉀緩沖溶液25 μ L作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25 μ L作為待測樣品并編號；然后一起置于酶標(biāo)儀中震蕩孵育30min后，迅速在每孔中加入0.04~0.2 mmol/L的乙醛溶液15 u L,搖勾后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值；
d.利用酶標(biāo)儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值，此值即為激活率；激活率為正數(shù)時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負(fù)數(shù)時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
[0005]本發(fā)明的優(yōu)選方法包括下述步驟: a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至100目，分別用70%乙醇提取60分鐘，離心分離，得若干上清液；或?qū)⒋Y選的若干活性因子分別用70%乙醇溶解，離心分離，得若干上清液；上述所得的上清液即作為待測樣本溶液；
b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應(yīng)體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90 μ L, 0.5mmol/L 的二硫蘇糖醇 10 μ L, lmg/ml 乙醒脫氫酶 25 μ L, IOmmoI/LNAD+ 溶液30 μ L ；
c.再在上述其中一個微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25 μ L作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25 μ L作為待測樣品并編號；然后一起直于酶標(biāo)僅中震湯鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.lmmol/L的乙溶液15 μ L,搖勾后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值；
d.利用酶標(biāo)儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值，此值即為激活率；激活率為正數(shù)時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負(fù)數(shù)時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
[0006]本發(fā)明中所述的活性因子是單體化合物或復(fù)合物。
[0007]本發(fā)明的方法是基于以下原理來實現(xiàn)的:乙醇(酒精)通過胃和腸道吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)，然后再進(jìn)行代謝分解，乙醇氧化成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶和NAD+ (氧化態(tài)輔酶I)作用下，氧化成乙酸，同時NAD+還原成NADH (還原態(tài)輔酶I)，而NADH在340nm處有吸收而其他反應(yīng)物在此波長下均無吸收。利用酶標(biāo)儀測定此波長下生成物吸光度的大小及變化，即可以預(yù)測加入物質(zhì)對乙醛脫氫酶(ALDH)的作用，從而篩選得到具有解酒功效的中藥材及活性因子。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點:
1.本發(fā)明首次利用高通量方法對具有解酒功效的中藥材或活性因子進(jìn)行篩選，根據(jù)需要選擇不同規(guī)格的微孔板，一次最多可篩選上百種或幾百種中藥材或活性因子，耗時短，精確率高，試劑用量少；
2.選用的反應(yīng)體系更簡單，操作方便；
3.本發(fā)明選用96孔微孔板作為反應(yīng)容器，根據(jù)輔酶I變化吸收值來篩選乙醛脫氫酶活性，進(jìn)而篩選具有解酒功效的中藥材或活性因子活性因子，為開發(fā)解酒產(chǎn)品提供一定依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是空白對照樣品及加入百合樣品后在一定時間內(nèi)的吸光度值變化曲線。
[0010]圖中:1一空白對照樣品曲線，2—百合樣品曲線。
【具體實施方式】
[0011]為了進(jìn)一步說明本發(fā)明專利內(nèi)容，以具體實施例說明。
[0012]實施例1
1.將待篩選的95種中藥材(見表I待篩選藥材清單)分別粉碎過100目藥典篩后，分別用70%乙醇提取60分鐘，離心分離(6000rpm，15min)，得各藥材的上清液；此上清液即為待測樣本溶液(為操作方便，可先將此上清液轉(zhuǎn)入微孔板中，并根據(jù)檢測需要作適當(dāng)稀釋，也可不經(jīng)過此步驟);
表1待篩選藥材清單
【權(quán)利要求】
1.一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法，其特征在于包括下述步驟: a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至20?100目，分別用30%?90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種，提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；或?qū)⒋Y選的若干活性因子分別用30%?90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種，提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；此上清液即作為待測樣本溶液； b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應(yīng)體系:50-200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸鉀緩沖液75-90 μ L, 0.1?0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10-15 μ L, 0.1?2mg/ml乙醒脫氫酶20-25 μ L, 0.0625 ?20mmol/L NAD+ 溶液 30 μ L ; c.再在上述其中一個微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25 μ L作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入步驟a.所制備的待測樣本溶液25 μ L，作為待測樣品并編號；然后一起直于酶標(biāo)僅中震湯鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.04?0.2 mmol/L的乙醛溶液15 μ L，搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值； d.利用酶標(biāo)儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值，此值即為激活率；激活率為正數(shù)時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負(fù)數(shù)時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法，其特征在于包括下述步驟: a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至100目，分別用70%乙醇提取60分鐘，離心分離，得若干上清液；或?qū)⒋Y選的若干活性因子分別用70%乙醇溶解，離心分離，得若干上清液；上述所得的上清液即作為待測樣本溶液； b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應(yīng)體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90 μ L, 0.5mmol/L 的二硫蘇糖醇 10 μ L, lmg/ml 乙醒脫氫酶 25 μ L, 10mmol/L NAD+ 溶液30 μ L ； c.再在上述其中一個微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25 μ L作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入步驟a.所制得的待測樣本溶液25 μ L，作為待測樣品并編號；然后一起直于酶標(biāo)僅中震湯鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.lmmol/L的乙溶液15 u L,搖勾后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值； d.利用酶標(biāo)儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值，此值即為激活率；激活率為正數(shù)時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負(fù)數(shù)時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法，其特征在于:所述的活性因子是單體化合物或復(fù)合物。
【文檔編號】G01N21/33GK103983598SQ201410255847
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】劉源才, 賴富麗, 熊瑜, 馮聲寶 申請人:勁牌有限公司