測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肉類殘留藥物的方法，特別是涉及同時(shí)測(cè)定肉類中多個(gè)鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法。所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥為唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、鹽酸異丙嗪、硝西泮、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、鹽酸氟奮乃靜、氯硝西泮、鹽酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法從羊肉中測(cè)定15種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量，該方法靈敏度高、回收率高，能滿足獸藥檢測(cè)的要求。
【專利說(shuō)明】測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肉類殘留藥物的方法，特別是涉及同時(shí)測(cè)定肉類中多個(gè)鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鎮(zhèn)靜劑(sedative)是指能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生輕度抑制,減弱機(jī)能活動(dòng),從而起到消除躁動(dòng)不安、恢復(fù)安靜的一類藥物。近年來(lái)，個(gè)別畜牧業(yè)飼養(yǎng)者因經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，擅自在畜禽飼養(yǎng)過(guò)程中添加此類藥物以起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時(shí)間的作用?’另外，在動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中，為減少動(dòng)物死亡和體重下降，防止肉品質(zhì)降低，也常使用此類藥物以減少應(yīng)激帶來(lái)的損失。非法使用此類藥物會(huì)使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動(dòng)物源食品中，人們食用了這些食品后，肝臟負(fù)擔(dān)加重，頭腦長(zhǎng)期昏沉，記憶受影響，同時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和肌肉功能受到抑制，因此許多國(guó)家都將此類藥物列為禁用藥物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告規(guī)定嚴(yán)禁在動(dòng)物飼料和飲用水中使用此類藥物，在動(dòng)物源食品中不得檢出此類藥物。
[0003]目前，檢測(cè)殘留的鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)、液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)等。國(guó)標(biāo)規(guī)定檢測(cè)此類藥物用液-質(zhì)聯(lián)用法，羊肉中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量測(cè)定的方法仍未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明采用快速高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(RRLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定羊肉中15種鎮(zhèn)靜劑類藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的是提供了一種測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法。本發(fā)明人通過(guò)高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法從羊肉中測(cè)定15種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量，該方法靈敏度高、回收率高，能滿足獸藥檢測(cè)的需求。
[0005]本發(fā)明可通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn):一種測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其主要特點(diǎn)在于包括以下步驟:
[0006]所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥為唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、鹽酸異丙嗪、硝西泮、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、鹽酸氟奮乃靜、氯硝西泮、鹽酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌??；
[0007](I)將羊肉絞碎、混合、均質(zhì)，貯存于-18~_40°C備用；
[0008](2)取出備用樣品解凍至室溫，準(zhǔn)確稱取4.5~5.5g羊肉樣品于50mL聚丙烯離心管中，加入15mL10:90v/v的氨水-乙腈和30 μ L β -葡萄糖醛苷酸酶≥100000units/mL,置于黑暗中，35~40°C旋渦、震搖8~12h后，30~40°C超聲萃取10~15min，3500~4500r/min離心5~IOmin,移出上清液,殘洛中加入15mL10:90, v/v氨水-乙腈,30~40°C超聲萃取10~15min, 3500~4500r/min離心5~IOmin ;合并兩次上清液,加入4.0~8.0g NaCl,充分混合，靜置3~lOmin，移出上清液，于30~40°C減壓濃縮至近干，加入ImL0.027molL^1QO:10v/v甲酸水溶液-乙腈渦旋至瓶?jī)?nèi)殘?jiān)咳芙?，過(guò)0.22~0.45 μ m有機(jī)相濾膜后，供分析測(cè)定；[0009](3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè):色譜柱:Acquity UPLC CSH? C18 ;流動(dòng)相:A為乙腈，B 為 0.027mol 1 甲酸水溶液，O ~15min，A10%— 70%，15 ~16min，A70%— 10%，流速0.3~0.5mL miiT1 ;進(jìn)樣量:5~20 μ L ；ESI+電離模式；多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:+3.0~3.5kV ;離子源溫度:100~150°C ;脫溶劑氣溫度:300~380°C ;錐孔氣流速:40~55L IT1 ;脫溶劑氣流速:450~550L IT1 ；
[0010](4)制備不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次進(jìn)行步驟(3)，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)；
[0011](5)將步驟(1)至(3)的樣品色譜峰面積代入鎮(zhèn)靜劑類獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液的線性回歸方程，檢出結(jié)果。
[0012]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥阿扎哌隆定性離子對(duì)為328.4/121m/z ;定量離子對(duì)為328.4/121m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量25~35V ；
[0013]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥阿扎哌隆在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r 2,為:y = 126.98X+114.03 ；r2 = 0.9974 ；
[0014]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0015]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥甲苯噻嗪定性離子對(duì)為221.1/163.75m/z ;定量離子對(duì)為221.1/163.75m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓25~35V ;碰撞能量30 ~40V ；
[0016]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥甲苯噻嗪在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2 為:y = 41.8489x+97.8894 r2 = 0.9756 ；
[0017]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0018]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥酒石酸唑吡坦定性離子對(duì)為308.3/263.lm/z ；定量離子對(duì)為308.3/235.lm/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓45~55V ;碰撞能量30 ~40/20 ~30V ；
[0019]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥酒石酸唑吡坦在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2，為:y = 853.442x+195.653 r2 = 0.9912 ；
[0020]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0021]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥咔唑心安定性離子對(duì)為299.5/116.2m/z ;定量離子對(duì)為299.5/116.2m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量25~35/25 ~35V ；
[0022]在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥咔唑心安在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2，為:y = 92.67x+53.114 r2 = 0.9978 ；
[0023]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0024]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯氮卓定性離子對(duì)為300.32/227.03m/z ;定量離子對(duì)為300.32/282.07m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓25~35V ;碰撞能量18~30/15 ?30V ；
[0025]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯氮卓在5?50 μ g kg-1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 81.3144x+138.444 r2 = 0.9853 ；
[0026]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0027]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌利多定性離子對(duì)為380.21/165.0 lm/z ;定量離子對(duì)為380.21/194.22m/z ;駐留時(shí)間0.02?0.05ms ;錐孔電壓30?40V ;碰撞能量20 ?30/12 ?20V ；
[0028]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌利多在0.5?50 μ g kg4濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 98.795x+77.9818 r2 = 0.9960 ；
[0029]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0030]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌啶醇定性離子對(duì)為376.4/122.8m/z ;定量離子對(duì)為376.4/165.4m/z ;駐留時(shí)間0.02?0.05ms ;錐孔電壓30?40V ;碰撞能量50?60/30 ?40V ；
[0031]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌啶醇在5?50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 42.0712x+55.6248 r2 = 0.9756 ；
[0032]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0033]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥異丙嗪定性離子對(duì)為285.2/85.8m/z ;定量離子對(duì)為285.2/198m/z ;駐留時(shí)間0.02?0.05ms ;錐孔電壓15?25V ;碰撞能量12?18/25 ?35V ；
[0034]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥異丙嗪在I?50 μ g kg4濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 783.963x+517.991 r2 = 0.9970 ；
[0035]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0036]所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥硝西泮定性離子對(duì)為282.3/179.9m/z ;定量離子對(duì)為285.3/236.2m/z ;駐留時(shí)間0.02?0.05ms ;錐孔電壓30?40V ;碰撞能量30?40/20 ?30V ；
[0037]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥硝西泮在0.5?50 μ g kg-1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 140.141x+213.812，r2 = 0.9860 ；
[0038]其中:X為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0039]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥乙酰丙嗪定性離子對(duì)為327.4/57.9m/z ;定量離子對(duì)為327.4/85.9lm/z ;駐留時(shí)間0.02?
0.05ms ;錐孔電壓25?33V ;碰撞能量30?40/15?25V ；
[0040]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥乙酰丙嗪在0.5?50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 926.957x+336.5，r2 = 0.9898 ；
[0041]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0042]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥奮乃靜定性離子對(duì)為404.38/143m/z ;定量離子對(duì)為404.38/171.14m/z ;駐留時(shí)間0.02~
0.05ms ;錐孔電壓40~50V ;碰撞能量25~35/30~40V ；
[0043]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥奮乃靜在I~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 577.043x+860.76 r2 = 0.9864 ；
[0044]其中:X為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0045]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯丙嗪定性 離子對(duì)為319.11/57.99m/z ;定量離子對(duì)為319.11/86.06m/z ;駐留時(shí)間
0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~35/15~25V ；
[0046]在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯丙嗪在5~50 μ g k^1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 97.5618x+120.861，r2 = 0.9821 ；
[0047]其中:X為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0048]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥丙酰丙嗪定性離子對(duì)為341.2/57.7m/z ;定量離子對(duì)為341.2/85.7m/z ;駐留時(shí)間0.02~
0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~40/15~25V ；
[0049]在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥丙酰丙嗪在5~50 μ g kg-1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2，為:y = 49.1929x+9.7867 r2 = 0.9984 ；
[0050]其中:X為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0051]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟奮乃靜定性離子對(duì)為438.33/143.04m/z ;定量離子對(duì)為438.33/171.lm/z ;駐留時(shí)間
0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量22~35/15~30V ；
[0052]在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟奮乃靜在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 1584.83x+623.487，r2 = 0.9639 ；
[0053]其中:X為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積；
[0054]或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯硝西泮定性離子對(duì)為316.1/214.03m/z ;定量離子對(duì)為316.1/214.03m/z ;駐留時(shí)間
0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~45/20~30V ；
[0055]在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯硝西泮在2~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 62.047x+25.631 r2 = 0.9976 ；
[0056]其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度；y為:MRM色譜峰面積。
[0057]本發(fā)明的有益效果:建立了采用RRLC-MS/MS測(cè)定羊肉中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量的方法。阿扎哌隆、甲苯噻嗪、咔唑心安、丙酰丙嗪、氯丙嗪的檢出限為2.5 μ g kg_S酒石酸唑吡坦、氟哌利多、奮乃靜、氟奮乃靜、異丙嗪的檢出限為0.5yg kg—1，氯氮卓、氟哌丁醇、氯硝西泮的檢出限為2yg kg4,乙酰丙嗪和硝西泮的檢出限為0.25 μ g kg'方法的回收率為74.1~112.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1~11.4%。RRLC-MS/MS能夠?yàn)檠蛉鈽悠返臋z測(cè)提供足夠的分析靈敏度和精度。該方法回收率高、精密度好能夠滿足獸藥殘留分析的要求，為檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鎮(zhèn)靜劑提供有利工具。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0058]圖1空白樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；[0059]圖2阿扎哌隆基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0060]圖3甲苯噻嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0061]圖4唑吡坦基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0062]圖5咔唑心安基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0063]圖6氯氮卓基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0064]圖7氟哌利多基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0065]圖8氟哌丁醇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0066]圖9異丙嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0067]圖10乙酰丙嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0068]圖11奮乃靜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0069]圖12丙酰丙嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0070]圖13氯丙嗪基質(zhì) 匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0071]圖14氟奮乃靜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg-1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0072]圖15硝西泮基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0073]圖16氯硝西泮基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；
[0074]圖1715種鎮(zhèn)靜劑類藥物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g kg—1)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0075]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述:
[0076]實(shí)施例1:一種測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其主要特點(diǎn)在于包括以下步驟:
[0077]所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥為唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、鹽酸異丙嗪、硝西泮、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、鹽酸氟奮乃靜、氯硝西泮、鹽酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌??；
[0078](I)將羊肉絞碎、混合、均質(zhì)，貯存于_40°C備用。
[0079](2)取出備用樣品解凍至室溫；準(zhǔn)確稱取5.5g羊肉樣品于50mL聚丙烯離心管中，加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)和30 μ L β -葡萄糖醛苷酸酶，置于黑暗中，40°C旋渦、震搖12h后，40°C超聲萃取15min，4500r/min離心10min，移出上清液，殘?jiān)屑尤?5mL氨水-乙腈(10:90, v/v)，40°C超聲萃取15min,4500r/min離心10min ;合并兩次上清液,加入
8.0g NaCl，充分混合，靜置lOmin，移出上清液，于40°C減壓濃縮至近干，加入ImL0.027molL-1甲酸水溶液-乙腈(90:10，v/v)渦旋至瓶?jī)?nèi)殘?jiān)咳芙?，過(guò)0.22μπι有機(jī)相濾膜后，供分析測(cè)定；
[0080](3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)?？焖俑叻直嬉合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜儀(RRLC-MS/MS):Agilentl290series 液相色譜儀(配有 G1322A 脫氣裝置、G1312B 二元泵、G1357D 自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent公司，美國(guó))；6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配有G1948B離子源，Agilent公司，美國(guó));色譜柱=Acquity UPLC CSH? C18 ;流動(dòng)相:A為乙腈，B為0.027mol L-1甲酸水溶液，O ~15min，AlO % — 70%，15 ~16min，A70%— 10%，流速:0.5mL mirT1 ;進(jìn)樣量:20 μ L ；ESI+電離模式；多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)；毛細(xì)管電壓:+3.5kV ;離子源溫度:150°C ;脫溶劑氣溫度:380°C ;錐孔氣流速:55L h-1 ;脫溶劑氣流速:550L h-1。其他參數(shù)見(jiàn)表1、表2。
[0081]表1.MRM監(jiān)測(cè)模式下各鎮(zhèn)靜劑類藥物質(zhì)譜條件
[0082]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于包括以下步驟: 所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥為唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、鹽酸異丙嗪、硝西泮、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、鹽酸氟奮乃靜、氯硝西泮、鹽酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌??； (1)將羊肉絞碎、混合、均質(zhì)，貯存于-18~-40°c備用； (2)取出備用樣品解凍至室溫,準(zhǔn)確稱取4.5~5.5g羊肉樣品于50mL聚丙烯離心管中，加入15mL10:90v/v的氨水-乙腈和30 μ LP -葡萄糖醒苷酸酶≥100000units/mL,置于黑暗中，35~40°C旋渦、震搖8~12h后，30~40°C超聲萃取10~15min，3500~4500r/min離心5~IOmin,移出上清液,殘洛中加入15mL10:90, v/v氨水-乙腈,30~40°C超聲萃取10~15min, 3500~4500r/min離心5~IOmin ;合并兩次上清液,加入4.0~8.0g NaCl,充分混合，靜置3~lOmin，移出上清液，于30~40°C減壓濃縮至近干，加入ImL0.027molL^1QO:10v/v甲酸水溶液-乙腈渦旋至瓶?jī)?nèi)殘?jiān)咳芙?，過(guò)0.22~0.45 μ m有機(jī)相濾膜后，供分析測(cè)定； (3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè):色譜柱=AcquityUPLC CSH? C18 ;流動(dòng)相:A為乙腈，B 為 0.027mol L-1 甲酸水溶液，O ~15min，AlO% — 70%，15 ~16min，A70%— 10%，流速`0.3~0.5mL rnirT1 ;進(jìn)樣量:5~20 μ L ；ESI+電離模式；多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:+3.0~3.5kV ;離子源溫度:100~150°C ;脫溶劑氣溫度:300~380°C ;錐孔氣流速:40~`55L IT1 ;脫溶劑氣流速:450~550L IT1 ； (4)制備不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次進(jìn)行步驟(3)，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)； (5)將步驟(1)至(3)的樣品色譜峰面積代入鎮(zhèn)靜劑類獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液的線性回歸方程，檢出結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟⑶液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥阿扎哌隆定性離子對(duì)為328.4/121m/z ;定量離子對(duì)為328.4/121m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~`40V ;碰撞能量25~35V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥阿扎哌隆在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 126.98X+114.03 ；r2 = 0.9974 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
3.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥甲苯噻嗪定性離子對(duì)為`221.1/163.75m/z ;定量離子對(duì)為221.1/163.75m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓`25~35V ;碰撞能量30~40V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥甲苯噻嗪在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2 為:y = 41.8489x+97.8894 r2 = 0.9756 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
4.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥酒石酸唑吡坦定性離子對(duì)為308.3/263.lm/z ;定量離子對(duì)為308.3/235.lm/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓`45~55V ;碰撞能量30~40/20~30V ； 在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥酒石酸唑吡坦在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r2,為:y = 853.442x+195.653 r2 = 0.9912 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
5.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥咔唑心安定性離子對(duì)為`299.5/116.2m/z ;定量離子對(duì)為299.5/116.2m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~`40V ;碰撞能量25~35/25~35V ； 在步驟⑷所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥咔唑心安在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 92.67x+53.114 r2 = 0.9978 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
6.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯氮卓定性離子對(duì)為`300.32/227.03m/z ;定量離子對(duì)為300.32/282.07m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓`25~35V ;碰撞能量 18~30/15~30V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯氮卓在5~50 μ g kg<濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 81.3144x+138.444 r2 = 0.9853 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
7.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌利多定性離子對(duì)為`380.21/165.0 lm/z ;定量離子對(duì)為380.21/194.22m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓`30~40V ;碰撞能量20~30/12~20V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌利多在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2，為:y = 98.795x+77.9818 r2 = 0.9960 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
8.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌啶醇定性離子對(duì)為`376.4/122.8m/z ;定量離子對(duì)為376.4/165.4m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~`40V ;碰撞能量50~60/30~40V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟哌啶醇在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 42.0712x+55.6248 r2 = 0.9756 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
9.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟⑶液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥異丙嗪定性離子對(duì)為.285.2/85.8m/z ;定量離子對(duì)為285.2/198m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓15~`25V ;碰撞能量12~18/25~35V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥異丙嗪在I~50 yg kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 783.963x+517.991 r2 = 0.9970 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
10.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定羊肉中殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥的方法，其特征在于還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥硝西泮定性離子對(duì)為285.3/179.9m/z ;定量離子對(duì)為282.3/236.2m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~40/20~30V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥硝西泮在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 140.141x+213.812 , r2 = 0.9860 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥乙酰丙嗪定性離子對(duì)為327.4/57.9m/z ;定量離子對(duì)為327.4/85.9lm/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓25~33V ;碰撞能量30~40/15~25V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥乙酰丙嗪在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 926.957x+336.5，r2 = 0.9898 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥奮乃靜定性離子對(duì)為404.38/143m/z ;定量離子對(duì)為404.38/171.14m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓40~50V ;碰撞能量25~35/30~40V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥奮乃靜在I~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 577.043x+860.76 r2 = 0.9864 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯丙嗪定性離子對(duì)為319.11/57.99m/z ;定量離子對(duì)為319.11/86.06m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~35/15~25V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯丙嗪在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 97.5618x+120.861，r2 = 0.9821 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥丙酰丙嗪定性離子對(duì)為341.2/57.7m/z ;定量離子對(duì)為341.2/85.7m/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~40/15~25V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥丙酰丙嗪在5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 49.1929x+9.7867 r2 = 0.9984 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟奮乃靜定性離子對(duì)為438.33/143.04m/z ;定量離子對(duì)為438.33/171.lm/z ;駐留時(shí)間0.02~0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量22~35/15~30V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氟奮乃靜在0.5~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 1584.83x+623.487，r2 = 0.9639 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積； 或還包括有在步驟(3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)中:所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯硝西泮定性離子對(duì)為316.1/214.03m/z ;定量離子對(duì)為316.1/214.03m/z ;駐留時(shí)間0.02~`0.05ms ;錐孔電壓30~40V ;碰撞能量30~45/20~30V ； 在步驟(4)所述的殘留鎮(zhèn)靜劑類獸藥氯硝西泮在2~50 μ g kg—1濃度范圍的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù) r2,為:y = 62.047x+25.631 r2 = 0.9976 ； 其中:x為:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為:MRM色譜峰面積。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103954721SQ201410197253
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月11日
【發(fā)明者】魏晉梅, 羅玉柱, 周圍, 解迎雙, 劉秀, 張麗 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)