基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該方法的檢測溶液包括DNA1-抗體1偶聯(lián)物、DNA2-抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶。目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時，DNA1-抗體1與DNA2-抗體2形成夾心免疫復(fù)合物，使得分別與DNA1、DNA2雜交的DNA3、DNA4相互靠近，形成鄰位觸擊復(fù)合物，與DNA5雜交打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，染料Cy5遠(yuǎn)離猝滅劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。復(fù)合物與DNA5形成的雙鏈還能被內(nèi)切酶識別，將DNA5剪切后打開新的DNA5，如此循環(huán)可在位放大發(fā)光，實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的高靈敏定量分析。該發(fā)明實現(xiàn)了蛋白質(zhì)快速、一步化檢測，操作簡單、普適性高。
【專利說明】基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明為一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。利用免疫反應(yīng)誘導(dǎo)核酸雜交，產(chǎn)生鄰位觸擊效應(yīng)，生成與發(fā)卡式分子信標(biāo)開關(guān)互補(bǔ)的序列，打開分子信標(biāo)，同時引入內(nèi)切酶循環(huán)策略，產(chǎn)生游離的化學(xué)發(fā)光染料，在位放大化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的簡單、快速、高靈敏測定。

二、【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)標(biāo)志物的測定在癌癥的研究和診斷中扮演著重要的角色，其床旁檢測可以直接用作早期篩選、監(jiān)測治療和復(fù)發(fā)診斷，意義重大。酶聯(lián)免疫分析法為最常見的免疫檢測方法之一，雖然其已推廣應(yīng)用，但由于需要專業(yè)人員操作、步驟復(fù)雜、所需時間長、試劑消耗多、工作量大、成本昂貴，不適于床旁檢測。所以發(fā)展簡單、快速、準(zhǔn)確的免疫分析方法，是床旁檢測一直以來所追求的目標(biāo)。
[0003]鄰位觸擊免疫分析是近年來發(fā)展起來的一種新型免疫分析方法，其基本分析原理為:用兩個或多個連有單鏈核苷酸的抗體檢測目標(biāo)抗原，一旦抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合，抗體連接的單鏈核苷酸就會被充分拉近，進(jìn)行雜交反應(yīng)生成雙鏈DNA，進(jìn)一步作為模板進(jìn)行實時PCR放大檢測，其后根據(jù)DNA的含量間接求得待測抗原的含量。鄰位觸擊效應(yīng)因采用雙識別機(jī)制，大大降低了交叉反應(yīng)，特異性高。此外，與其它免疫分析方法相比，可一步完成檢測，無需清洗、分離。但已建立的鄰位觸擊免疫分析方法主要采用實時PCR檢測，大大限制了應(yīng)用。DNA檢測的放大手段很多，不必局限于PCR檢測，本發(fā)明將發(fā)卡式分子信標(biāo)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與鄰位觸擊效應(yīng)結(jié)合，設(shè)計了一種新的檢測方法。這里，化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)是以化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光為信號進(jìn)行檢測的方法。該方法敏感性高、簡便、快速、重復(fù)性好，無放射性污染，在常規(guī)臨床分析和臨床研究中都有廣泛的應(yīng)用。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的內(nèi)容是:結(jié)合鄰位觸擊效應(yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，通過設(shè)計發(fā)卡式分子信標(biāo)開關(guān)，引入內(nèi)切酶循環(huán)放大策略，提出一種簡單、快速、靈敏的一步式均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]本發(fā)明涉及一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，如圖1所示。其原理在于該方法的檢測溶液包含DNAl-抗體I偶聯(lián)物、DNA2-抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶。在目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時，DNAl-抗體I偶聯(lián)物與DNA2-抗體2偶聯(lián)物通過夾心免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，同時DNAl與輔助DNA3、DNA2與輔助DNA4互補(bǔ)雜交，使輔助DNA3與輔助DNA4相互靠近，產(chǎn)生鄰位觸擊效應(yīng)，形成鄰位觸擊復(fù)合物，該復(fù)合物具有與分子信標(biāo)DNA5互補(bǔ)的序列，因而與分子信標(biāo)DNA5雜交，打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)。鄰位觸擊復(fù)合物與DNA5形成的雙鏈結(jié)構(gòu)能被限制性內(nèi)切酶識別，將DNA5剪切成超短鏈DNA，并從復(fù)合物上脫落，產(chǎn)生游離的化學(xué)發(fā)光染料(Cy5)，而該復(fù)合物可與另一 DNA5進(jìn)行雜交，打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行第二輪剪切，如此循環(huán)，可產(chǎn)生大量游離Cy5。在檢測溶液中加入化學(xué)發(fā)光底物，可獲得靈敏的Cy5化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的高靈敏定量分析。
[0007]DNAl含有40個堿基，5’端修飾巰基，通過偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺_4_環(huán)已烷_1_碳酸酯，與抗體I上的氨基共價結(jié)合，形成DNAl-抗體I偶聯(lián)物。DNA2含有40個堿基，3’端修飾巰基，通過偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-環(huán)己烷-1-碳酸酯，與抗體2上的氨基共價結(jié)合，形成DNA2-抗體2偶聯(lián)物。
[0008]輔助DNA3含有51個堿基，從3’端開始的1-20堿基位點(diǎn)與DNAl的5’端開始的21-40堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ)，從3’端開始的33-40堿基位點(diǎn)與輔助DNA4的5’端開始的33-40堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ)，如圖2所示。
[0009]輔助DNA4含有49個堿基，從5’端開始的1-20堿基位點(diǎn)與DNA2的3’端開始的21-40堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ),如圖2所示。
[0010]分子信標(biāo)DNA5為發(fā)卡結(jié)構(gòu)，含有24個堿基，3’端修飾猝滅劑(BHQ)，5’端修飾Cy5 ;從5’端開始的6-12及14-20堿基位點(diǎn)的堿基序列都為CCTCAGC，可被限制性內(nèi)切酶Nt.BbvCI識別，從而剪切其形成的雙鏈；從3’端開始的1-4堿基位點(diǎn)與從5’端開始的1_4堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ)，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如圖3所示。DNA5從5’端開始的4-12堿基位點(diǎn)與輔助DNA4的3’端開始的1-9堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ)，從3’端開始的4_12堿基位點(diǎn)與輔助DNA3的5’端開始的1-9堿基位點(diǎn)的堿基完全互補(bǔ)，如圖2所示。
[0011]上述發(fā)卡型分子信標(biāo)DNA5上的Cy5與BHQ非常接近，化學(xué)發(fā)光底物激發(fā)Cy5產(chǎn)生的光會立即被BHQ猝滅。
[0012]上述檢測溶液與含有待測目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品溶液混合，在37°C恒溫箱進(jìn)行反應(yīng)后產(chǎn)生大量游離的Cy5，加入化學(xué)發(fā)光底物過氧化氫和雙(2，4，6-三氯苯基)草酰酯的混合物后，與游離的Cy5產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。
[0013]上述免疫分析方法的檢測步驟如下:
[0014]①將樣品溶液和檢測溶液混合，并在37°C條件下溫育30分鐘；
[0015]②加入化學(xué)發(fā)光底物，通過化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行光信號采集；
[0016]③從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。
[0017]上述步驟①中的樣品溶液與檢測溶液的體積可以分別是I μ L和29 μ L。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn):
[0019]本發(fā)明結(jié)合鄰位觸擊效應(yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，通過設(shè)計發(fā)卡式分子信標(biāo)，同時引入內(nèi)切酶循環(huán)放大策略，提出一種簡單、快速、靈敏的一步式均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。相比于現(xiàn)有的免疫分析方法，具有以下特點(diǎn):
[0020](I)本方法為均相免疫分析方法，可通過樣品與檢測溶液的直接混合完成蛋白質(zhì)的一步式檢測，無需固體生物識別載體，操作簡單，成本低廉，同時大大縮短了分析時間，可在30分鐘內(nèi)完成單個樣品的測定。
[0021 ] (2)結(jié)合鄰位觸擊效應(yīng)和化學(xué)發(fā)光分子信標(biāo)，通過免疫反應(yīng)直接誘發(fā)分子信標(biāo)釋放信號，無需洗滌及分離純化步驟。
[0022](3)結(jié)合限制性內(nèi)切酶循環(huán)策略，在位進(jìn)行信號放大，提高檢測靈敏度，使其更適于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。
[0023](4)利用化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)進(jìn)行分析，不需要外加光源，設(shè)備簡單。

四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1.基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法示意圖
[0025]圖2.鄰位觸擊效應(yīng)誘導(dǎo)分子信標(biāo)DNA5打開不意圖
[0026]圖3.分子信標(biāo)DNA5的結(jié)構(gòu)示意圖

五、【具體實施方式】
[0027]實施例1:結(jié)合附圖1，說明基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法對目標(biāo)蛋白質(zhì)(癌胚抗原)的檢測
[0028](I)配制檢測溶液:將DNAl-抗體I偶聯(lián)物、DNA2-抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶混合，使它們的最終濃度分別為0.01mg/mL、0.0lmg/mL、80nM、80nM、I μ M 和 70U/mL。
[0029](2)將IyL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液或者含有目標(biāo)蛋白質(zhì)(癌胚抗原)的待測溶液與29 μ L檢測溶液混合，37°C條件下溫育30分鐘。
[0030](3)在溫育后的溶液中加入20 μ L化學(xué)發(fā)光底物，并立即檢測該溶液的化學(xué)發(fā)光信號，檢測參數(shù):增益2，電壓950V。根據(jù)記錄的化學(xué)發(fā)光值，獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)檢測的工作曲線和待測溶液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明涉及一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。其特征在于該方法的檢測溶液包含DNAl-抗體I偶聯(lián)物、DNA2-抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶。在目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時，DNAl-抗體I偶聯(lián)物與DNA2-抗體2偶聯(lián)物通過夾心免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，同時DNAl與輔助DNA3、DNA2與輔助DNA4互補(bǔ)雜交，使輔助DNA3與輔助DNA4相互靠近，產(chǎn)生鄰位觸擊效應(yīng)，形成鄰位觸擊復(fù)合物，該復(fù)合物具有與分子信標(biāo)DNA5互補(bǔ)的序列，因而與分子信標(biāo)DNA5雜交,打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)。鄰位觸擊復(fù)合物與DNA5形成的雙鏈結(jié)構(gòu)能被限制性內(nèi)切酶識別，將DNA5剪切成超短鏈DNA，并從復(fù)合物上脫落，產(chǎn)生游離的化學(xué)發(fā)光染料(Cy5)，而該復(fù)合物可與另一 DNA5進(jìn)行雜交，打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行第二輪剪切，如此循環(huán)，可產(chǎn)生大量游離Cy5。在檢測溶液中加入化學(xué)發(fā)光底物，可獲得靈敏的Cy5化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的高靈敏定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的輔助DNA3含有51個堿基，從3’端開始的1-20堿基位點(diǎn)與DNAl的5’端開始的21-40堿基位點(diǎn)完全堿基互補(bǔ)；輔助DNA4含有49個堿基，從5’端開始的1-20堿基位點(diǎn)與DNA2的3’端開始的21-40堿基位點(diǎn)完全堿基互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的輔助DNA3從3’端開始的33-40堿基位點(diǎn)與輔助DNA4的5’端開始的33-40堿基位點(diǎn)完全堿基互補(bǔ)；分子信標(biāo)DNA5含有24個堿基，3’端修飾猝滅劑BHQ，5’端修飾Cy5。DNA5從3’端開始的1_4堿基位點(diǎn)與從5’端開始的1-4堿基位點(diǎn)完全互補(bǔ),形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的分子信標(biāo)DNA5從5’端開始的4-12堿基位點(diǎn)與輔助DNA4的3’端開始的1_9堿基位點(diǎn)完全堿基互補(bǔ)；從3’端開始的4-12堿基位點(diǎn)與輔助DNA3的5’端開始的1_9堿基位點(diǎn)完全堿基互補(bǔ)；而且5’端開始的6-12及14-20堿基位點(diǎn)的堿基序列均為可被限制性內(nèi)切酶識別的CCTCAGC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的檢測溶液與含有待測目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品溶液混合，在37°C下溫育30分鐘后，加入化學(xué)發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行光信號采集，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK104165999SQ201410190726
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】鞠熀先, 嚴(yán)楓, 宗晨, 吳潔 申請人:南京大學(xué), 江蘇省腫瘤醫(yī)院