重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及聚乙二醇化重組人促紅素（PEG-EPO）的生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種PEG-EPO反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法以及多個(gè)反應(yīng)液合并前的快速鑒定方法。檢測(cè)體系為磷酸鹽緩沖液和納米金溶膠顯色劑，以及經(jīng)稀釋的PEG-EPO反應(yīng)液；測(cè)定260nm處的吸光度后將吸光度與稀釋倍數(shù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合并計(jì)算吸光度下降系數(shù)（k260）。通過(guò)比較各反應(yīng)液的k260值可快速判斷各反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率是否相同或接近。再結(jié)合高效液相色譜的檢測(cè)結(jié)果，可快速得出具有相同k260值的反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率。因此，本發(fā)明極大地縮短了PEG-EPO反應(yīng)液合并前的檢測(cè)分析時(shí)間，提高了PEG-EPO藥物生產(chǎn)工藝的效率，節(jié)省了人力成本和時(shí)間成本。且本發(fā)明的檢測(cè)方法具有很好的靈敏度、可靠性和重現(xiàn)性，可應(yīng)用于PEG-EPO藥物的實(shí)際生產(chǎn)工藝過(guò)程中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聚乙二醇化重組人促紅素的生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]促紅細(xì)胞生成刺激劑(Erythropoiesis-stimulatingAgents, ESAs)是對(duì)腎性貧血疾病十分有效的治療藥物。ESAs能夠從根本上糾正貧血癥狀，明顯地恢復(fù)患者的體能，提高患者的生活質(zhì)量。此外，消除貧血癥狀可以顯著地減少其它相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率。不過(guò)，由于ESAs的體內(nèi)半衰期相對(duì)較短，因此患者通常需要每周一至三次給藥。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，近年來(lái)，研究人員對(duì)重組人促紅素(recombinant human Erythropoietin,EP0)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了化學(xué)修飾研究，以改善其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，從而允許給藥頻率的減少。與此同時(shí)，能夠與蛋白質(zhì)分子發(fā)生共價(jià)鍵合的水溶性聚乙二醇化合物(PolyethyleneGlycol, PEG)，已經(jīng)被成功地應(yīng)用于改善一些蛋白質(zhì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和降低其免疫原性。經(jīng)過(guò)PEG化修飾的EPO藥物(PEG-EPO)，被稱(chēng)為新一代長(zhǎng)效ΕΡ0，也已經(jīng)被成功制備(其化學(xué)反應(yīng)式如圖1所示)，并在歐洲等地區(qū)成為處方藥物。相關(guān)的動(dòng)物研究數(shù)據(jù)和臨床研究結(jié)果表明，PEG-EPO具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，與常規(guī)EPO相比，能夠允許較低的給藥頻率，可以是兩個(gè)星期給藥一次，甚至是四個(gè)星期給藥一次。這種不太頻繁的給藥方式，給予了患者和醫(yī)療服務(wù)提供者一個(gè)很大的便利。特別地，PEG-EPO藥物可以在整個(gè)治療周期內(nèi)，維持患者血紅蛋白水平的穩(wěn)定性，減少了治療副作用的產(chǎn)生。
[0003]選擇合適的PEG試劑和PEG化反應(yīng)條件，PEG化雖不會(huì)對(duì)生物分子的活性位點(diǎn)或者生物功能產(chǎn)生明顯的影響，但它通常至少會(huì)有一定的影響，尤其是當(dāng)形成多取代PEG化產(chǎn)物時(shí)，很有可能對(duì)蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)產(chǎn)生位阻效應(yīng)，降低其體外活性乃至體內(nèi)活性。而降低PEG化反應(yīng)的多取代率，同時(shí)提高其單取代率，并從所得反應(yīng)液中純化得到單取代產(chǎn)物，則一直都是PEG化蛋白質(zhì)藥物研究過(guò)程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。中國(guó)專(zhuān)利《聚合物/重組人促紅素偶聯(lián)物》(200710123683.X)，公開(kāi)了一種PEG-EPO藥物的制備方法，其最終產(chǎn)物中不含多取代PEG-EPO產(chǎn)物(mult1-PEG-EPO)。在該專(zhuān)利的實(shí)施例中，對(duì)所得最終產(chǎn)物進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)證實(shí)了其具有長(zhǎng)效性。相關(guān)的專(zhuān)利《一種單取代PEG-EPO的純化及制備方法》(201010516922.X)，公開(kāi)了一種單取代PEG-EPO產(chǎn)物(mono-PEG-EPO)的純化工藝。在該純化工藝中，需要采用疏水層析方法，分離mult1-PEG-EPO和mono-PEG-EPO。因此，所得PEG-EPO 反應(yīng)液中 mult1-PEG-EPO 的含量，以及 mono-PEG-EPO 與 mult1-PEG-EPO 之間的比例，對(duì)純化工藝的整體難度和成本有很大的影響。在保持mono-PEG-EPO產(chǎn)量的較高水平的同時(shí)，減少mult1-PEG-EPO的產(chǎn)量，可以顯著地節(jié)省純化工藝的處理時(shí)間和物料成本。另一個(gè)專(zhuān)利《回收促紅細(xì)胞生成素的方法》(201210313863.5)，公開(kāi)了一種從PEG-EPO反應(yīng)液中回收未反應(yīng)的EPO蛋白質(zhì)的方法。在該專(zhuān)利的實(shí)施例中，對(duì)回收得到的EPO進(jìn)行了 PEG化反應(yīng)測(cè)試，所得單取代率為35.5 %，多取代率為4.4%，說(shuō)明了回收的EPO仍然具有較強(qiáng)的PEG化反應(yīng)活性。在此反應(yīng)結(jié)果中，雖然mono-PEG-EPO的產(chǎn)量較低，但是mono-PEG-EPO與mult1-PEG-EPO之間的比例很高，對(duì)后續(xù)的純化工藝具有明顯的好處。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，采用專(zhuān)利《重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應(yīng)方法》(201210257542.8)所公開(kāi)的EPO的PEG化方法，可以有效地將所得回收EPO的單取代率提高到40%以上，總反應(yīng)率大于60%。這說(shuō)明了，EPO的PEG化反應(yīng)液中的游離EPO仍然具有一定的PEG化反應(yīng)活性。
[0004]而如果要盡可能地充分利用EPO的反應(yīng)活性，那么就需要建立一種對(duì)EPO的PEG化反應(yīng)液的快速檢測(cè)方法，以對(duì)反應(yīng)條件作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，進(jìn)而把反應(yīng)液中的游離EPO進(jìn)一步PEG化。目前，對(duì)EPO的PEG化反應(yīng)液的檢測(cè)方法主要是色譜方法和電泳方法。例如，郝素娟等人(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2010，31 (11)，2239?2245)在進(jìn)行EPO的PEG化反應(yīng)時(shí)，首先加入過(guò)量甘氨酸終止反應(yīng)，然后取樣進(jìn)行高效凝膠過(guò)濾色譜分析，最后由各產(chǎn)物峰面積經(jīng)軟件計(jì)算所得反應(yīng)液的單取代率和多取代率。A.阿布喬夫斯基等人(中國(guó)專(zhuān)利200780037291.X)在進(jìn)行EPO的PEG化反應(yīng)時(shí)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)，確定最終產(chǎn)物是比例大致相等的mono-PEG-EPO和mult1-PEG-EPO。此外，ApollonPapadimitriou (美國(guó)專(zhuān)利US7169754B2)在進(jìn)行EPO的PEG化反應(yīng)時(shí)，對(duì)所得反應(yīng)液用離子交換色譜等工藝進(jìn)行純化后，用色譜和電泳鑒定所得產(chǎn)物，得出純化前的PEG-EPO反應(yīng)液的單取代率為40%，多取代率為38%，游離EPO含量為20%。黎雄輝等人(中國(guó)專(zhuān)利，201010516922.X)在進(jìn)行EPO的PEG化反應(yīng)時(shí)，在反應(yīng)后馬上取樣作HPLC檢測(cè)，結(jié)果表明所得PEG-EPO反應(yīng)液的單取代率為50%，多取代率為18%，游離EPO含量為32%。以上檢測(cè)方法，雖然可以對(duì)所得PEG-EPO反應(yīng)液進(jìn)行定性檢測(cè)和定量檢測(cè)，但是都存在步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、只能在反應(yīng)結(jié)束后再進(jìn)行檢測(cè)等問(wèn)題。
[0005]同時(shí)，在進(jìn)行PEG-EPO藥物的大規(guī)模生產(chǎn)，比如制備1800mg EPO反應(yīng)量的PEG-EPO反應(yīng)液時(shí)，可以采用“少量多次反應(yīng)，再合并得到一個(gè)批次反應(yīng)液”的合成方案，即首先進(jìn)行一個(gè)5mg EPO反應(yīng)量的預(yù)反應(yīng)，然后再進(jìn)行一個(gè)200mg與四個(gè)400mg EPO反應(yīng)量的PEG化反應(yīng)，最后把所得EPO的PEG化反應(yīng)液進(jìn)行合并得到一個(gè)批次的1800mg EPO的PEG化反應(yīng)液。也就是說(shuō)，在整個(gè)PEG-EPO的藥物生產(chǎn)工藝過(guò)程中，將連續(xù)進(jìn)行6個(gè)EPO的PEG化反應(yīng)液；而這些制備得到的EPO的PEG化反應(yīng)液在進(jìn)行合并前，都必需進(jìn)行檢測(cè)，以保證合并后得到的1800mg EPO的PEG化反應(yīng)液符合生產(chǎn)要求，其中最重要的指標(biāo)之一就是PEG化反應(yīng)率。通常采用HPLC方法對(duì)各EPO的PEG化反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)時(shí)間接近lh，鑒于需要檢測(cè)的EPO的PEG化反應(yīng)液的數(shù)量較大，因此產(chǎn)生了一個(gè)檢測(cè)分析耗時(shí)較長(zhǎng)的問(wèn)題，并增加了 PEG-EPO反應(yīng)液在存放過(guò)程中發(fā)生質(zhì)量變化的風(fēng)險(xiǎn)。所以，我們需要開(kāi)發(fā)一種可以對(duì)EPO的PEG化反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率進(jìn)行快速檢測(cè)的分析技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)紫外光譜檢測(cè)由納米金溶膠、磷酸鹽緩沖液及EPO的PEG化反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系，從而提供一種重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，以及應(yīng)用該光譜檢測(cè)法對(duì)多個(gè)重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液合并前進(jìn)行快速鑒定的方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，包括以下步驟:
[0009]SI稀釋:取η份反應(yīng)液樣品，將反應(yīng)液樣品按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)玫溅欠N不同濃度的稀釋液，且n ^ 3。
[0010]優(yōu)選的，所述水為注射用水，所述η = 3，所述稀釋倍數(shù)分別為4倍、8倍和10倍。
[0011]S2配置檢測(cè)體系:將各稀釋液與磷酸鹽緩沖液和納米金溶膠于不同的比色管中混合，并用水定容至刻度得到具有不同濃度的檢測(cè)液，然后將檢測(cè)液顯色5min以上；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10-60mM，pH為5.0-8.0 ;所述納米金溶膠的濃度為1.0X10_n-6.0X10_9mOl/L;所述磷酸鹽緩沖液、納米金溶膠和稀釋反應(yīng)液的體積比為2:1:1。所述水為注射用水。
[0012]優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為40mM，pH為7.0 ;納米金溶膠的濃度為
3.0X l(T9mol/L ;納米金溶膠的粒徑為15_25nm ;檢測(cè)液顯色5_20min。
[0013]S3、檢測(cè):用紫外光譜儀測(cè)各檢測(cè)液在260nm處的吸光度A26(l。
[0014]S4、數(shù)據(jù)處理:將各檢測(cè)液的吸光度A26tl及稀釋倍數(shù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得擬合曲線(xiàn)A260 = ax+b, X為反應(yīng)液的稀釋倍數(shù)；取a的絕對(duì)值得吸光度下降系數(shù)K26(l。也可以將a的絕對(duì)值乘以10000后所得數(shù)值設(shè)為吸光度下降系數(shù)κ26(ι。
[0015]一種應(yīng)用以上光譜檢測(cè)法的多個(gè)重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液合并前的快速鑒定方法，包括以下步驟:
[0016]SI紫外檢測(cè):對(duì)每個(gè)反應(yīng)液分別依次進(jìn)行如權(quán)利要求1所述的稀釋、配置檢測(cè)體系、檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理四個(gè) 步驟，得到每個(gè)反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)κ26(ι。
[0017]S2高效液相色譜檢測(cè):用高效液相色譜儀檢測(cè)其中一個(gè)反應(yīng)液的聚乙二醇化反應(yīng)率；該反應(yīng)液為基準(zhǔn)反應(yīng)液。
[0018]S3、比較:將其它反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)K26tl與基準(zhǔn)反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)1(26(|比較，具有相同吸光度下降系數(shù)k26(l的反應(yīng)液的聚乙二醇化反應(yīng)率相等或相差±1.5%。
[0019]S4合并-驗(yàn)證:根據(jù)各反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)K26tl的比較情況，將可混合到一起的各反應(yīng)液合并得到合并液，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)合并液的聚乙二醇化反應(yīng)率。
[0020]以上所述高效液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)條件為:流動(dòng)相是濃度為50mM，pH為6.8的磷酸鹽緩沖液；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;流速為0.5mL/min。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過(guò)使用納米金溶膠為顯色劑，可顯著地提高反應(yīng)液的紫外吸光度，明顯提高了檢測(cè)的靈敏度。并將反應(yīng)液進(jìn)行多級(jí)稀釋?zhuān)山档头磻?yīng)液中PEG對(duì)紫外檢測(cè)的影響，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算吸光度下降系數(shù)，可快速比較各反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率；再結(jié)合其中一個(gè)反應(yīng)液的HPLC的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，可快速鑒定各反應(yīng)液的PEG化反應(yīng)率，從而可快速判斷是否可合并相應(yīng)的反應(yīng)液。通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)方法可減少PEG-EPO藥物生產(chǎn)過(guò)程中的HPLC檢測(cè)次數(shù)，因此可極大縮短反應(yīng)液合并前的檢測(cè)分析時(shí)間，提高了 PEG-EPO藥物生產(chǎn)工藝的效率，節(jié)省了人力成本和時(shí)間成本。且本發(fā)明的檢測(cè)方法具有很好的靈敏度、可靠性和重現(xiàn)性，可應(yīng)用于PEG-EPO藥物的生產(chǎn)中。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為EPO的PEG化反應(yīng)式(使用帶有甲基端基的PEG試劑)；
[0023]圖2為實(shí)驗(yàn)一所得EPO的PEG化反應(yīng)液的HPLC檢測(cè)結(jié)果；[0024]圖3為由實(shí)驗(yàn)一的EPO的PEG化反應(yīng)液分離出的EPO的MS檢測(cè)結(jié)果；
[0025]圖4為由實(shí)驗(yàn)一的EPO的PEG化反應(yīng)液分離出的單取代PEG-EP0產(chǎn)物的MS檢測(cè)
結(jié)果;
[0026]圖5為實(shí)驗(yàn)一的EPO的PEG化反應(yīng)液的電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0027]圖6為實(shí)驗(yàn)一的EPO的PEG化反應(yīng)液的圓二色譜檢測(cè)結(jié)果；
[0028]圖7為實(shí)驗(yàn)一的EPO的PEG化反應(yīng)液的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0029]圖8為NGP的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0030]圖9為NGP的TEM檢測(cè)結(jié)果(標(biāo)尺為IOOnm)；
[0031]圖10為NGP的TEM檢測(cè)結(jié)果(標(biāo)尺為20nm)；
[0032]圖11為NGP在pH7.0PBS中的TEM檢測(cè)結(jié)果；
[0033]圖12為NGP與EPO的PEG化反應(yīng)液的混合物在pH7.0PBS中的TEM檢測(cè)結(jié)果；
[0034]圖13為NGP與EPO的PEG化反應(yīng)液在pH7.0PBS中的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0035]圖14為NGP與EPO的PEG化反應(yīng)液在pH7.0PBS中的⑶檢測(cè)結(jié)果；
[0036]圖15為NGP與EPO原液在pH7.0PBS中的CD檢測(cè)結(jié)果；
[0037]圖16為NGP與PEG在pH7.0PBS中的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0038]圖17為以NGP為顯色劑定量檢測(cè)PEG溶液濃度的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0039]圖18為NGP與EPO在pH7.0PBS中的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0040]圖19為以NGP為顯色劑定量檢測(cè)EPO溶液濃度的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0041 ]圖 20 為 NGP 與 mono-PEG-EPO 在 pH7.0PBS 中的 UV-Vis 檢測(cè)結(jié)果；
[0042]圖21為外加EPO溶液對(duì)PEG檢測(cè)的干擾效應(yīng)的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0043]圖22為EPO與PEG相互之間的干擾效應(yīng)的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果；
[0044]圖23為EPO的PEG化反應(yīng)液多級(jí)稀釋實(shí)驗(yàn)的UV-Vis檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045]為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步介紹和說(shuō)明。
[0046]本發(fā)明使用的主要化學(xué)試劑包括:磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2Η20,藥用級(jí))；磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2Η20，藥用級(jí))；氫氧化鈉(NaOH，藥用級(jí))；鹽酸(HC1，分析純)；氯金酸(HAuCl4, CAS 號(hào)為:16903-35-8，分子量為:339.79g/mol,);檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7.2H20，分析純)。
[0047]EPO原液來(lái)自深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司；PEG試劑(GLUC-PEG-NHS，平均分子量為36097Da)，來(lái)自北京鍵凱科技有限公司。
[0048]實(shí)驗(yàn)一:ΕΡ0的PEG化反應(yīng)
[0049]用50mL塑料離心管，加入4.89mLEP0原液(蛋白質(zhì)含量為3.07mg/mL,共15mg),以及10.llmLpH7.0的40mM磷酸緩沖液，EPO的終濃度為lmg/mL。準(zhǔn)確稱(chēng)量300mgGLUC-PEG-NHS,加入3.0mL2mM且pH3.0的磷酸緩沖液溶解。溶解后，將GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，迅速混勻。所得混合液被放置于振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)I小時(shí)。由此，得到無(wú)色、透明、澄清的PEG-EPO反應(yīng)液。備用。
[0050]實(shí)驗(yàn)二:ΕΡ0的PEG化反應(yīng)液的HPLC檢測(cè)[0051]以實(shí)驗(yàn)一所得的EPO的PEG化反應(yīng)液為樣品，取樣作HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件為:GEsuperpose6分析柱；島津HPLC, PDA檢測(cè)器，LC Solution工作站；PBS緩沖液作流動(dòng)相,濃度為50mM，pH為6.8 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;上樣量為20 μ L ;流速為0.5mL/min。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，在所得的PEG-EPO反應(yīng)液中，除了游離EPO(保留時(shí)間為:34.043min)以外，還有至少三種不同的PEG-EPO產(chǎn)物(保留時(shí)間分別為:25.318min(單取代)、21.416min (二取代)和14.876min (三取代))，而且其分子極性比較接近。以圖2的峰面積進(jìn)行積分計(jì)算，結(jié)果表明，所得EPO的PEG化反應(yīng)液中的游離EPO含量約為25%，單取代率約為50%，多取代率約為25%。也就是說(shuō)，在該反應(yīng)中，EPO的PEG化反應(yīng)率約為75%。
[0052]實(shí)驗(yàn)三:游離EPO和單取代PEG-EPO產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)
[0053]依照實(shí)驗(yàn)二的檢測(cè)結(jié)果(圖2)，將實(shí)驗(yàn)一所得的EPO的PEG化反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，得到純凈的游離EPO (HPLC保留時(shí)間為:34.043min)和單取代PEG-EPO產(chǎn)物(HPLC保留時(shí)間為:25.318min)，然后分別取樣作質(zhì)譜(MS)檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是中國(guó)藥典(2010版)二部附錄IX J質(zhì)譜法，檢測(cè)儀器是MALD1-T0F-MS。檢測(cè)結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖3、圖4可以發(fā)現(xiàn)，純化得到的游離EPO和單取代PEG-EPO產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果分別是:29673和65131。同時(shí)，考慮到實(shí)驗(yàn)一中的PEG試劑的平均分子量為36097，因此證明了 EPO的PEG化反應(yīng)是成功的，并且單取代PEG-EPO產(chǎn)物是反應(yīng)的主要產(chǎn)物。
[0054]實(shí)驗(yàn)四:ΕΡ0的PEG化反應(yīng)液的電泳檢測(cè)
[0055]以實(shí)驗(yàn)一所得的EPO的PEG化反應(yīng)液為樣品，取樣作電泳檢測(cè)。按中國(guó)藥典方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖5的結(jié)果表明，在EPO的PEG化反應(yīng)液中，除了游離EPO (分子量為30KD?45KD)以外，還有至少兩種不同的PEG-EPO產(chǎn)物(分子量為66KD?106KD (單取代)、大于106KD ( 二取代))。由于PEG在溶液中會(huì)發(fā)生膨脹，從而導(dǎo)致PEG-EPO分子在電泳圖上的分子量會(huì)比實(shí)際上的分子量要大，因此圖5的電泳結(jié)果與圖2的HPLC檢測(cè)結(jié)果基本一致。
[0056]實(shí)驗(yàn)五:ΕΡ0的PEG化反應(yīng)液的圓二色譜檢測(cè)
[0057]以實(shí)驗(yàn)一的EPO原液，以及所得的EPO的PEG化反應(yīng)液為樣品，取樣作圓二色譜(CD)檢測(cè)。按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)儀器是Chirascan型圓二色譜儀，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。從圖6可以發(fā)現(xiàn)，PEG-EPO反應(yīng)液與EPO原液的圓二色譜非常相似，即兩個(gè)樣品的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)很接近。這說(shuō)明了 EPO的PEG化反應(yīng)，并沒(méi)有明顯地改變EPO的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0058]實(shí)驗(yàn)六:ΕΡ0的PEG化反應(yīng)液的紫外_可見(jiàn)光吸收光譜檢測(cè)
[0059]以實(shí)驗(yàn)一所得的EPO的PEG化反應(yīng)液為樣品，取樣作紫外-可見(jiàn)光吸收光譜(UV)檢測(cè)。按照中國(guó)藥典方法檢測(cè)，掃描范圍為200?700nm，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。從圖7可以發(fā)現(xiàn)，EPO的PEG化反應(yīng)液在可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)沒(méi)有明顯的吸收峰，同時(shí)在紫外光區(qū)260 土 Inm處有一顯著的吸收峰。參考文獻(xiàn)(楊瑞娥等，聚乙二醇化學(xué)修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子技術(shù)研究)，這一紫外吸收峰是由PEG基團(tuán)產(chǎn)生的，包括未與EPO結(jié)合的PEG分子以及PEG-EPO產(chǎn)物中的PEG部分。
[0060]實(shí)驗(yàn)七:制備及檢測(cè)不同PEG化反應(yīng)率的EPO的PEG化反應(yīng)液
[0061]為了研究應(yīng)用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜(UV-Vis)檢測(cè)EPO的PEG化反應(yīng)率的可行性，首先制備了 5種經(jīng)HPLC檢測(cè)證明具有不同的PEG化反應(yīng)率的EPO的PEG化反應(yīng)液，然后取樣作UV-Vis檢測(cè)。
[0062]制備具有不同的PEG化反應(yīng)率的EPO的PEG化反應(yīng)液的方法如下:與實(shí)驗(yàn)一基本一致，不同之處在于分別往反應(yīng)前的lmg/mLEPO溶液中加入0.00,0.05,0.10,0.15和
0.20mL的40mM碳酸氫銨溶液，混勻。反應(yīng)完畢后，分別取樣作HPLC測(cè)試(按實(shí)驗(yàn)二的方法)和UV-Vis測(cè)試(按實(shí)驗(yàn)六的方法)，結(jié)果列于表1。
[0063]表1不同PEG化反應(yīng)率的EPO的PEG化反應(yīng)液的HPLC和UV-Vis檢測(cè)結(jié)果
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，包括以下步驟: SI稀釋:取η份反應(yīng)液樣品，用水將反應(yīng)液樣品按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)玫溅欠N不同濃度的稀釋液，n ^ 3 ； S2配置檢測(cè)體系:將各稀釋液與磷酸鹽緩沖液和納米金溶膠于不同的比色管中混合，并用水定容至刻度得到具有不同濃度的檢測(cè)液，然后將檢測(cè)液顯色5min以上；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10-60mM，pH為5.0 — 8.0 ;所述納米金溶膠的濃度為1.0X 10—11 —6.0X 10_9mol/L ;所述磷酸鹽緩沖液、納米金溶膠和稀釋反應(yīng)液的體積比為2:1:1; 53、檢測(cè):用紫外光譜儀測(cè)各檢測(cè)液在260nm處的吸光度A26tl； 54、數(shù)據(jù)處理:將各檢測(cè)液的吸光度A26tl及稀釋倍數(shù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得擬合曲線(xiàn)A260=ax+b, X為稀釋倍數(shù)；取a的絕對(duì)值得吸光度下降系數(shù)k26(l。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，步驟SI和步驟S2中所述水為注射用水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，步驟SI中所述稀釋倍數(shù)分別為4倍、8倍和10倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，步驟S2中所述磷酸鹽緩沖液的濃度為40mM，pH為7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，步驟S2中所述納米金溶膠的濃度為3.0X 10_9mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，驟S2中所述納米金溶膠的粒徑為15-25nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液的光譜檢測(cè)法，其特征在于，步驟S2中所述檢測(cè)液顯色5-20min。
8.—種多個(gè)重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液合并前的快速鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: SI紫外檢測(cè):對(duì)每個(gè)反應(yīng)液分別依次進(jìn)行如權(quán)利要求1所述的稀釋、配置檢測(cè)體系、檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理四個(gè)步驟，得到每個(gè)反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)k26(l ； S2高效液相色譜檢測(cè):用高效液相色譜儀檢測(cè)其中一個(gè)反應(yīng)液的聚乙二醇化反應(yīng)率；該反應(yīng)液為基準(zhǔn)反應(yīng)液； S3、比較:將其它反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)k26(l與基準(zhǔn)反應(yīng)液的吸光度下降系數(shù)k26(l比較，具有相同吸光度下降系數(shù)k26(l的反應(yīng)液的聚乙二醇化反應(yīng)率相等或相差±1.5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種多個(gè)重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液合并前的快速鑒定方法，其特征在于，還包括合并-驗(yàn)證步驟，即將不同的反應(yīng)液合并得到合并液，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)合并液的聚乙二醇化反應(yīng)率。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種多個(gè)重組人促紅素聚乙二醇化反應(yīng)液合并前的快速鑒定方法，其特征在于，所述高效液相色譜的檢測(cè)條件為:流動(dòng)相是濃度為50mM，pH為6.8的磷酸鹽緩沖液；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;流速為0.5mL/min。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK104007079SQ201410159182
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】張滌平, 陳賢光, 張向榮, 吳園園, 王康, 黃俊龍, 黃健, 盛光陽(yáng) 申請(qǐng)人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司