一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法
【專利摘要】一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，涉及木二糖。取含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)，加入NaBH4和去離子水，反應(yīng)后加入乙酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生，再加入甲醇，減壓濃縮至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，繼續(xù)反應(yīng)后加入乙酸乙酯萃取衍生化產(chǎn)物，水洗得標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于氣相色譜分析；設(shè)定儀器工作條件：氣相色譜柱的溫度為150～400℃，流動(dòng)相的流速為0.1～10.0mL·min-1，檢測(cè)器的溫度為150～400℃；將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)，開(kāi)始檢測(cè)并記錄色譜圖，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其成分；借助分析軟件，得到木二糖的校準(zhǔn)曲線，用作樣品中木二糖的定量分析，根據(jù)木二糖峰的出峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的面積的比值判斷木二糖的含量。
【專利說(shuō)明】一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及木二糖，尤其是涉及一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]低聚木糖是一種非消化性低聚糖，是由2~7個(gè)D-木糖以β-1，4_木糖苷鍵結(jié)合而成的低聚糖，是新一代功能性低聚糖產(chǎn)品。低聚木糖具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，能在較寬的PH值、溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，能選擇性增殖腸道內(nèi)的雙歧桿菌，具有促進(jìn)雙歧桿菌增長(zhǎng)以及改善腸道功能的作用。它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，僅為蔗糖的40%，具有抗齲齒性。其獨(dú)特的生理活性和良好的理化特性使得低聚木糖被認(rèn)為是目前最有前途、國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛的功能性低聚糖之一。木二糖是低聚木糖的主要有效成分，也是低聚木糖定性和定量的關(guān)鍵成分。因而如何快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)木二糖含量就成了這類研究得以進(jìn)行的關(guān)鍵問(wèn)題之一。[0003]常見(jiàn)的木二糖分析方法有紙層析法、薄層層析法、高效液相色譜法。前2種方法屬定性方法，定量效果不理想，低于mg量級(jí)就難以檢測(cè)。高效液相色譜法是最常見(jiàn)的木二糖定量分析方法，但當(dāng)樣品中糖類組分較多時(shí)，其分離效果往往很差，檢測(cè)靈敏度差，重現(xiàn)性不好，而且分析時(shí)間長(zhǎng)，消耗流動(dòng)相多，天然糖組分往往雜質(zhì)多，對(duì)色譜柱壽命影響很大。采用衍生化法配合氣相色譜是分析單糖的常見(jiàn)方法，具有速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但用于分析木二糖尚未見(jiàn)報(bào)道。采用氣相色譜分析木二糖需要解決兩個(gè)問(wèn)題:一是要有合適的衍生化方法，二是合適的操作控制條件，使之具有較高的理論塔板數(shù)和良好的柱效。
[0004]中國(guó)專利CN102288688A公開(kāi)一種利用高效液相離子交換色譜測(cè)定低聚木糖的方法。該方法包括:高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件的確定、低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)工作方程的測(cè)定、木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間確定和低聚木糖成分的分析與測(cè)定。該發(fā)明利用高效液相離子交換色譜測(cè)定低聚木糖的方法，建立了高效液相離子交換色譜精確定量測(cè)定低聚木糖的方法，采用CarboPacTMPA200 (3X250m)色譜柱，通過(guò)醋酸鈉和氫氧化鈉二元梯度洗脫顯著提高了木糖及各種低聚木糖組分之間的分離度及檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)低聚木糖樣品，尤其是木二糖至木六糖組分的精確定量測(cè)定，及對(duì)木七糖和木八糖類糖組分的定性分析，對(duì)于低聚木糖產(chǎn)品的檢測(cè)評(píng)價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明包括如下步驟:
[0007]I)樣品衍生化:
[0008]取含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)，加入NaBH4和去離子水，反應(yīng)后，加入乙酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生，再加入甲醇，減壓濃縮至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，繼續(xù)反應(yīng)后加入乙酸乙酯萃取衍生化產(chǎn)物，水洗，得標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于氣相色譜分析；
[0009]2)設(shè)定儀器工作條件:[0010]氣相色譜柱的溫度為150?400°C，流動(dòng)相的流速為0.1?10.0mL miiT1,檢測(cè)器的溫度為150?400°C ；
[0011]3)進(jìn)樣:
[0012]將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)，開(kāi)始檢測(cè)并記錄色譜圖，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其成分；
[0013]4)結(jié)果表征:
[0014]借助分析軟件，得到木二糖的校準(zhǔn)曲線，用作樣品中木二糖的定量分析，根據(jù)木二糖峰的出峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的面積的比值判斷木二糖的含量。
[0015]在步驟I)中，所述含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)、NaBH4、去離子水、甲醇、乙酸酐、批唳、乙酸乙酯的配比可為0.1?IOOmg: 0.1?IOOmg:1?500mg: 0.1?IOmL: 0.1?20.0mL: 0.1?5.0mL: 0.1?5.0mL: lmL，其中，含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)、NaBH4以質(zhì)量計(jì)算，去離子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯以體積計(jì)算；所述反應(yīng)的時(shí)間可為0.5?5h ;所述減壓濃縮的溫度可為40?90°C;所述繼續(xù)反應(yīng)的溫度可為70?120°C，繼續(xù)反應(yīng)的時(shí)間可為0.1?3.0h。
[0016]在步驟2)中，所述氣相色譜柱可采用非極性氣相色譜柱、弱極性氣相色譜柱、中極性氣相色譜柱等中的一種；所述流動(dòng)相可采用氮?dú)饣蚝獾?；所述檢測(cè)器可采用TCD檢測(cè)器或FID檢測(cè)器等。
[0017]在步驟3)中，所述將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)的進(jìn)樣量可為0.1?200 μ L。
[0018]本發(fā)明建立了以吡啶為溶劑和催化劑，以乙酸酐為乙?；噭瑢?duì)酶解獲得的木二糖進(jìn)行衍生化，以核糖醇為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)毛細(xì)管氣相色譜法，對(duì)樣品中木二糖衍生化產(chǎn)物進(jìn)行分離定量檢測(cè)和氣質(zhì)聯(lián)用定性。以吡啶為溶劑和催化劑對(duì)糖醇類物質(zhì)進(jìn)行乙酰化具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、對(duì)糖類物質(zhì)分析專一性較好、干擾較小、速度快、衍生化產(chǎn)物單一等優(yōu)點(diǎn)，適用于低聚木糖樣品中木二糖的定性、定量分析。在合適的分析條件下，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能對(duì)其快速定性，用氣相色譜能得到糖醇乙酰化衍生物理想的分離和定量結(jié)果。對(duì)于柱效好的色譜分析來(lái)說(shuō)，這樣做可以得到理想的分離結(jié)果。本發(fā)明應(yīng)用氣相色譜分析軟件得到木二糖校準(zhǔn)曲線，也可通過(guò)這一分析系統(tǒng)直接得到木二糖的定量結(jié)果。如果這些條件不具備，根據(jù)內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)峰面積、木二糖的梯度濃度和不同濃度木二糖對(duì)應(yīng)的峰面積，通過(guò)常用的分析軟件也一樣可以得到理想的校準(zhǔn)曲線和定量結(jié)果?？傊?，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，衍生化反應(yīng)迅速，最低檢測(cè)量達(dá)到了 ng量級(jí)，適用于食品營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)中木二糖的定性、定量分析。
[0019]本發(fā)明采用硼氫化鹽為還原劑、吡啶為溶劑和催化劑、乙酸酐為乙?；噭瑢?duì)木二糖進(jìn)行乙?；苌蟮臍庀嗌V分離、質(zhì)譜鑒定的分析方法。以核糖醇為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)校準(zhǔn)曲線對(duì)木二糖進(jìn)行定量分析。此法測(cè)定木二糖的最低量可達(dá)io_ng，適于樣品中微量木二糖的分析測(cè)定。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為總離子流圖。
[0021]圖2為木二糖乙酯質(zhì)譜鑒定圖譜。
[0022]圖3為核糖醇衍生化產(chǎn)物圖譜。[0023]圖4為內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025]1.材料和儀器
[0026]試劑:硼氫化鈉、吡啶、乙酸酐、核糖醇、木二糖、甲醇、乙酸乙酯，以上藥品均為分析純。
[0027]儀器:島津GCMS-QP2010型氣相色譜儀、真空濃縮儀等。
[0028]2.檢測(cè)步驟
[0029](I)樣品衍生化
[0030]①取含木二糖的低聚木糖樣品0.1?lOOmg，核糖醇內(nèi)標(biāo)0.1?lOOmg，加入I?500mgNaBH4和0.1?IOmL去離子水，充分混勻反應(yīng)0.5?5h，滴入乙酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生；
[0031]②加入0.1?20.0mL甲醇，40?90°C減壓濃縮至干燥，；
[0032]③加入0.1?5.0mL乙酸酐和0.1?5.0mL吡啶混勻，70?120°C反應(yīng)0.1?3.0h后加入ImL乙酸乙酯萃取衍生化產(chǎn)物，以ImL水洗。
[0033]④將制備好的標(biāo)準(zhǔn)樣品用于氣相色譜分析。
[0034](2)設(shè)定儀器工作條件
[0035]①氣相色譜柱采用非極性、弱極性或者中極性柱，可恒定溫度，也可程序升溫，最終柱溫控制在150?400°C ；
[0036]②流動(dòng)相為高純氮或高純氦,流速0.1?10.0mL.mirT1 ；
[0037]③采用T⑶或者FID檢測(cè)器，溫度150?400°C。
[0038](3)進(jìn)樣
[0039]以0.1?200 μ L進(jìn)樣量將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)，開(kāi)始檢測(cè)并記錄色譜圖，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其成分。
[0040](4)結(jié)果表征
[0041]借助分析軟件，得到木二糖的校準(zhǔn)曲線，用作樣品中木二糖的定量分析，根據(jù)木二糖峰的出峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的面積的比值判斷木二糖的含量。
[0042]以下給出具體實(shí)施例。
[0043]實(shí)施例1未知樣品中木二糖的分析
[0044]取含木二糖的低聚木糖樣品IOmg,核糖醇內(nèi)標(biāo)IOmg,加入50mg NaBH4和2mL去離子水，充分混勻反應(yīng)2h，滴入乙酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生，加入5mL甲醇，60°C減壓濃縮至干燥，加入ImL乙酸酐和ImL吡啶混勻，100°C反應(yīng)Ih后加入ImL乙酸乙酯萃取衍生化產(chǎn)物，以ImL水洗。將制備好的標(biāo)準(zhǔn)樣品用于氣相色譜分析，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其成分。最后借助分析軟件，得到木二糖的校準(zhǔn)曲線，用作樣品中木二糖的定量分析。設(shè)備島津GCMS-QP2010型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，TCD檢測(cè)器溫度為270°C，進(jìn)樣器溫度為280°C，BP-15柱(30mX0.25mmX0.25mm),載氣He0.8mL.mirT1,進(jìn)樣分流比200:1。柱箱溫度條件:初始溫度 50。。，20。。.mirT1 升溫到 270°C，保留 50min。
[0045]圖1給出總離子流圖。依據(jù)木二糖醇乙?；苌镌贕C-MS總離子流中的出峰順序，可以確定核糖醇和木二糖乙酰衍生化產(chǎn)物在氣相色譜分離結(jié)果中的保留時(shí)間。從各標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖及其結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果可知，圖1中兩峰分別為核糖醇和木二糖的乙?；a(chǎn)物，核糖醇的保留時(shí)間是21.875min，木二糖保留時(shí)間為40.415min。
[0046]圖2給出木二糖乙酯質(zhì)譜鑒定圖譜，圖3給出核糖醇衍生化產(chǎn)物圖譜。分析結(jié)果表明，木二糖等糖類物質(zhì)的乙?；a(chǎn)物能很好地得到分離，應(yīng)用此法對(duì)木二糖進(jìn)行定性分析是準(zhǔn)確可靠的。
[0047]將5個(gè)梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物用于氣相色譜分析，調(diào)出5個(gè)氣相色譜圖，獲取內(nèi)標(biāo)物曲線(圖4)。所得內(nèi)標(biāo)物曲線相關(guān)系數(shù)為0.9798，可借助下述分析方法和相應(yīng)的分析軟件，依據(jù)該曲線對(duì)樣品中的木二糖進(jìn)行定量分析。
[0048]f= (As/ms) / (Ar/ mr)
[0049]其中f為校正因子，As和A,分別為內(nèi)標(biāo)物和木二糖的峰面積，ms和m,分別為加入內(nèi)標(biāo)物和木二糖的量。再根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)組分溶液色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算含量(Hli):
[0050]m^f XAi/ (As/ms)
[0051]其中Ai和As分別為木二糖和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，ms為加入內(nèi)標(biāo)物的量。再根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量折算成百分含量。
[0052]實(shí)驗(yàn)所用的氣相色譜噪音峰高為14mV，系統(tǒng)確認(rèn)3倍峰高為各物質(zhì)最小檢測(cè)量。根據(jù)最佳衍生化條件下木二糖所出峰高和樣品濃度、進(jìn)樣量和分流比計(jì)算出木二糖的最低檢測(cè)量約為5.0X lQJg。因此，此法可對(duì)微量木二糖準(zhǔn)確定量。
【權(quán)利要求】
1.一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟: 1)樣品衍生化: 取含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)，加入NaBH4和去離子水，反應(yīng)后，加入乙酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生，再加入甲醇，減壓濃縮至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，繼續(xù)反應(yīng)后加入乙酸乙酯萃取衍生化產(chǎn)物，水洗，得標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于氣相色譜分析； 2)設(shè)定儀器工作條件: 氣相色譜柱的溫度為150~400°C，流動(dòng)相的流速為0.1~10.0mL.min-1檢測(cè)器的溫度為150~400°C ； 3)進(jìn)樣: 將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)，開(kāi)始檢測(cè)并記錄色譜圖，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其成分； 4)結(jié)果表征: 借助分析軟件，得到木二糖的校準(zhǔn)曲線，用作樣品中木二糖的定量分析，根據(jù)木二糖峰的出峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的面積的比值判斷木二糖的含量。
2.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟I)中，所述含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)、NaBH4、去離子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯的配比為 0.1 ~IOOmg: 0.1 ~IOOmg: I ~500mg: 0.1 ~IOmL: 0.1 ~20.0mL: 0.1 ~5.0mL: 0.1~5.0mL: lmL，其中，含木二糖的低聚木糖樣品、核糖醇內(nèi)標(biāo)、NaBH4以質(zhì)量計(jì)算，去離子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯以體積計(jì)算。
3.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟I)中，所述反應(yīng)的時(shí)間為0.5~5h。
4.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟I)中，所述減壓濃縮的溫度為40~90°C。
5.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟I)中，所述繼續(xù)反應(yīng)的溫度為70~120°C，繼續(xù)反應(yīng)的時(shí)間為0.1~3.0h。
6.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述氣相色譜柱采用非極性氣相色譜柱、弱極性氣相色譜柱、中極性氣相色譜柱中的一種。
7.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述流動(dòng)相采用氮?dú)饣蚝狻?br> 8.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述檢測(cè)器采用TCD檢測(cè)器或FID檢測(cè)器。
9.如權(quán)利要求1所述一種木二糖的氣相色譜檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，在步驟3)中，所述將待測(cè)液進(jìn)樣至進(jìn)樣口內(nèi)的進(jìn)樣量為0.1~200 μ L。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103901150SQ201410156499
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】劉健, 龍敏南, 甘禮惠 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)