絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動物組織學【技術領域】蛋白定位的輔助研究，具體涉及到在顯微觀察石蠟切片的制備及染色方法。一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其主要特點在于包括有步驟為：取皮樣；樣品的固定：皮膚樣品的軟化；皮膚樣品的脫水：石蠟處理：皮膚樣品常規(guī)包埋；皮膚樣品切片。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結構清晰。適用于實驗室科研工作者對絨山羊皮膚形態(tài)結構的研究。在光鏡下進行觀察，本發(fā)明能夠完整的呈現皮膚的表皮和真皮結構，切片沒有褶皺和破碎，且在切片過程中不容易發(fā)生碎片現象。
【專利說明】絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物組織學【技術領域】蛋白定位的輔助研究，具體涉及到在顯微觀察石蠟切片的制備及染色方法。
【背景技術】
[0002]隴東絨山羊是遼寧絨山羊和內蒙絨山羊與當地山羊雜交培育的一個新類群，正準備申請國家鑒定驗收。據測定統(tǒng)計，成年公羊的平均產絨量為578g ;成年母羊平均產絨量為4518;屠宰率為47.08%。主要分布于甘肅省環(huán)縣、華池縣和慶城縣。絨山羊業(yè)是當地支柱產業(yè)，山羊絨是絨山羊的主要產品。故對絨山羊皮膚的研究一度成為研究的熱點。從結構的角度進行研究，皮膚石蠟切片的制作是必不可少的一步。由于皮膚缺乏實質的組織，角化程度又較高，相對比較脆，這在切片過程中會帶來很大的挑戰(zhàn)。而相關文獻中對皮膚石蠟切片制作過程并無詳細的描述。這使得研究者在實驗過程中屢屢受挫。擁有一套最佳的樣品處理方法，為毛囊組織學的研究提供技術指導和理論依據，對實現人工調控絨生長和加快絨山羊育種進展具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法。以解決切片完整，沒有碎裂，在光鏡下觀察結構清晰，組織結構完整，用于絨山羊皮膚顯微結構的研究。
[0004]為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其主要特點在于包括有步驟為:
[0005](I)取皮樣；選取成年絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮樣；
[0006](2)樣品的固定:剪取的皮樣展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有4%多聚甲醛的固定液的容器內固定，2-4°C，12-24h ；
[0007](3)皮膚樣品的軟化:將固定好的皮樣置入軟化液軟化，室溫，48h ；
[0008](4)皮膚樣品的脫水:在18_22°C下依次進行，70%酒精5_6h，80%酒精12h，第一次95%酒精2h，第二次95%酒精lh50min，第一次100%酒精2h,第二次100%酒精lh50min，1:1的酒精二甲苯IOmin, 二甲苯6min30s ；
[0009](5)石臘處理:在65_70°C的烘箱中依次進行，置入1:1石臘二甲苯IOmin,然后第一次置入石臘2h30min,第二次置入石臘2h,第三次置入石臘lh50min ;皮膚樣品常規(guī)包埋；
[0010](7)皮膚樣品切片=Leica石蠟切片機室溫下切2_5um厚。
[0011]所述的絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，還包括有步驟:
[0012](8)皮膚樣品HE染色:依次進行使用二甲苯脫蠟兩次，每次IOmin ;然后第一次用100%酒精IOmin ;第二次用100%酒精5min ；95%酒精脫水兩次，每次5min ；80%酒精5min ；70%酒精5min;蒸懼水3min ;蘇木素(Delafield) IOmin ;蒸懼水洗Imin ;1%鹽酸酒精5S ；自來水返藍17min;蒸餾水洗Imin ;1%伊紅40s ;蒸餾水洗Imin ;70%酒精5s ;80%酒精5s ；95%酒精兩次，每次5min ；100%酒精2次，每次IOmin ;二甲苯兩次，每次lOmin，最后常規(guī)封片。
[0013]所使用的Delafield蘇木素配制方法:蘇木精4g ;無水乙醇25ml ;10%銨帆水溶液400ml ;甘油 IOOml ;甲醇 100ml。
[0014]所使用的1%水溶性伊紅配制方法(一般一次配制500ml)伊紅Ig ;蒸餾水99ml ;冰醋酸2-3滴。
[0015]所使用的1%鹽酸酒精配制方法(一般一次配制500ml)70%酒精99ml ;濃鹽酸lml。
[0016]所述的絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，所述的軟化液為:
[0017]軟化液的配制:60ml甘油與40ml60%酒精,60%酒精為60ml蒸懼水加入35ml95%酒精。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結構清晰。適用于實驗室科研工作者對絨山羊皮膚形態(tài)結構的研究。
[0019]在光鏡下進行觀察，本發(fā)明能夠完整的呈現皮膚的表皮和真皮結構，切片沒有褶皺和破碎，且在切片過程中不容易發(fā)生碎片現象。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1:為本發(fā)明制備的絨山羊皮膚石蠟切片顯微圖；
[0021]圖2:為絨山羊皮膚毛囊的橫切石蠟切片顯微圖；
[0022]圖3:為絨山羊皮膚毛囊的縱切石蠟切片顯微圖。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0024]實施例1:一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其主要特點在于包括有步驟為:
[0025](I)取皮樣；選取成年絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8cm2的皮樣；
[0026](2)樣品的固定:剪取的皮樣展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有4%多聚甲醛的固定液的容器內固定，2°C，12h;
[0027](3)皮膚樣品的軟化:將固定好的皮樣置入軟化液軟化，室溫，48h ；
[0028](4)皮膚樣品的脫水:在18°C下依次進行，70%酒精5h，80%酒精12h，第一次95%酒精2h，第二次95%酒精lh50min，第一次100%酒精2h，第二次100%酒精lh50min，1:1的酒精二甲苯IOmin, 二甲苯6min30s ；
[0029](5)石蠟處理:在65_70°C的烘箱中依次進行，置入1:1石蠟二甲苯lOmin，然后第一次置入石蠟2h30min，第二次置入石蠟2h，第三次置入石蠟lh50min ；
[0030]( 6 )皮膚樣品常規(guī)包埋；
[0031](7)皮膚樣品切片=Leica石蠟切片機室溫下切5um厚。
[0032]所述的軟化液為:軟化液的配制:60ml甘油與40ml60%酒精，60%酒精為60ml蒸餾水加入35ml95%酒精。[0033]實施例2:—種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，包括有步驟為:
[0034](I)取皮樣；選取成年絨山羊，從體側部用剪刀剪取1.2cm2的皮樣；
[0035](2)樣品的固定:剪取的皮樣展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有4%多聚甲醛的固定液的容器內固定，4°C，24h ；
[0036](3)皮膚樣品的軟化:將固定好的皮樣置入軟化液軟化，室溫，48h ；
[0037](4)皮膚樣品的脫水:在22°C下依次進行，70%酒精6h，80%酒精12h，第一次95%酒精2h，第二次95%酒精lh50min，第一次100%酒精2h，第二次100%酒精lh50min，1:1的酒精二甲苯IOmin, 二甲苯6min30s ；
[0038](5)石蠟處理:在70°C的烘箱中依次進行，置入1:1石蠟二甲苯lOmin，然后第一次置入石蠟2h30min，第二次置入石蠟2h，第三次置入石蠟lh50min ；
[0039](6)皮膚樣品常規(guī)包埋；
[0040](7)皮膚樣品切片=Leica石蠟切片機室溫下切5um厚。
[0041]所述的軟化液為:軟化液的配制:60ml甘油與40ml60%酒精，60%酒精為60ml蒸餾水加入35ml95%酒精。
[0042]實施例3:—種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，包括有步驟為:
[0043]步驟(I)至步驟(7 )與實施例1或實施例2相同。
[0044](8)皮膚樣品HE染色:依次進行使用二甲苯脫蠟兩次，每次IOmin ;然后第一次用100%酒精IOmin ;第二次用100%酒精5min ；95%酒精脫水兩次，每次5min ；80%酒精5min ；70%酒精5min;蒸懼水3min ;蘇木素(Delafield) IOmin ;蒸懼水洗Imin ;1%鹽酸酒精5S ；自來水返藍17min;蒸餾水洗Imin ;1%伊紅40s ;蒸餾水洗Imin ;70%酒精5s ;80%酒精5s ；95%酒精兩次，每次5min ；100%酒精2次，每次IOmin ;二甲苯兩次，每次lOmin，最后常規(guī)封片。
[0045]所使用的Delafield蘇木素配制方法:蘇木精4g ;無水乙醇25ml ; 10%銨帆水溶液400ml ;甘油 IOOml ;甲醇 100ml。
[0046]所使用的1%水溶性伊紅配制方法(一般一次配制500ml)伊紅Ig ;蒸餾水99ml ;冰醋酸2-3滴。
[0047]所使用的1%鹽酸酒精配制方法(一般一次配制500ml >70%酒精99ml ;濃鹽酸Iml。實驗例:一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法:
[0048]材料和方法
[0049]1.皮膚樣品的固定:剪取皮樣展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有4%多聚甲醛的固定液的容器內固定，2-4°C，12-24h ；
[0050]2.皮膚樣品的軟化:將固定好的皮樣置入軟化液軟化，室溫，48h ;軟化液的配制:60ml甘油+40ml60%酒精(60ml蒸餾水+35ml95%酒精)
[0051]3.皮膚樣品的脫水:在18_22°C下進行:
[0052]70% 酒精 5-6h，80% 酒精 12h，第一次 95% 酒精 2h，第二次 95% 酒精 lh50min，第一次 100% 酒精 2h,第二次 100% 酒精 lh50min，酒精二甲苯(1:1) lOmin，二甲苯 6min30s ；
[0053]4.石蠟處理:在65_70°C的烘箱中進行:石蠟二甲苯(l:l)10min，第一次蠟2h30min，第二次蠟2h，第三次蠟lh50min。
[0054]5.皮膚樣品常規(guī)包埋[0055]6.皮膚樣品切片=Leica石蠟切片機室溫下切2_5um厚。
[0056]7.皮膚樣品HE染色:第一次使用二甲苯脫蠟兩次，每次IOmin (此處不能為范圍，時間要求很嚴格)；再100%酒精IlOmin ；100%酒精II5min ；95%酒精脫水兩次，每次5min ；80% 酒精 5min ;70% 酒精 5min;蒸懼水 3min ;蘇木素(Delafield)IOmin ;蒸懼水洗 Imin ；1%鹽酸酒精5S ;自來水返藍17min;蒸餾水洗Imin ;1%伊紅40s ;蒸餾水洗Imin ;70%酒精5s ；80%酒精5s ;95%酒精兩次，每次5min ; 100%酒精2次，每次IOmin ;二甲苯兩次，每次lOmin，最后常規(guī)封片。
[0057]所使用的Delafield蘇木素配制方法:蘇木精4g ;無水乙醇25ml ; 10%銨帆水溶液400ml ;甘油 IOOml ;甲醇 100ml。
[0058]所使用的1%水溶性伊紅配制方法(一般一次配制500ml)伊紅Ig ;蒸餾水99ml ;冰醋酸2-3滴。
[0059]所使用的1%鹽酸酒精配制方法(一般一次配制500ml)70%酒精99ml ;濃鹽酸lml。
[0060]見圖1，為使用本發(fā)明制備的絨山羊皮膚石蠟切片顯微圖，圖中能夠完整的呈現皮膚的表皮和真皮結構，切片沒有褶皺，破碎。
[0061]見圖2，為使用本發(fā)明制備的絨山羊皮膚毛囊的橫切石蠟切片顯微圖，能夠清晰的看到毛囊所處的時期，汗腺結構清晰。
[0062]見圖3，為使用本發(fā)明制備的絨山羊皮膚毛囊的縱切石蠟切片顯微圖，能夠清晰的反應毛囊的結締組織鞘、外根鞘和內根鞘。
[0063]上述三個切片均符合實驗要求。
[0064]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其特征在于包括有步驟為: (1)取皮樣；選取成年絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮樣； (2)樣品的固定:剪取的皮樣展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有4%多聚甲醛的固定液的容器內固定，2-4°C，12-24h ； (3)皮膚樣品的軟化:將固定好的皮樣置入軟化液軟化，室溫，48h； (4)皮膚樣品的脫水:在18-22°C下依次進行，70%酒精5-6h，80%酒精12h，第一次95%酒精2h，第二次95%酒精lh50min，第一次100%酒精2h，第二次100%酒精lh50min，1:1的酒精二甲苯IOmin, 二甲苯6min30s ； (5)石蠟處理:在65-70°C的烘箱中依次進行，置入1:1石蠟二甲苯lOmin，然后第一次置入石蠟2h30min，第二次置入石蠟2h，第三次置入石蠟lh50min ； (6)皮膚樣品常規(guī)包埋； (7)皮膚樣品切片=Leica石蠟切片機室溫下切2_5um厚。
2.如權利要求1所述的絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其特征在于還包括有步驟: (8)皮膚樣品HE染色:依次進行使用二甲苯脫蠟兩次，每次IOmin;然后第一次用100%酒精IOmin ;第二次用100%酒精5min ;95%酒精脫水兩次，每次5min ;80%酒精5min ;70%酒精5min;蒸懼水3min ;蘇木素(Delafield)IOmin ;蒸懼水洗Imin ；1%鹽酸酒精5S ；自來水返藍17min;蒸懼水洗Imin ；1%伊紅40s ;蒸懼水洗Imin ；70%酒精5s ；80%酒精5s ；95%酒精兩次，每次5min ; 100%酒精2次,每次IOmin ；二甲苯兩次，每次IOmin,最后常規(guī)封片。
3.如權利要求1所述的絨山羊皮膚用于顯微觀察石蠟切片的制備方法，其特征在于所述的軟化液為: 軟化液的配制:60ml甘油與40ml60%酒精，60%酒精為60ml蒸餾水加入35ml95%酒精。
【文檔編號】G01N1/28GK103900885SQ201410146816
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權日:2014年4月10日
【發(fā)明者】賀延玉, 劉秀, 孟云 申請人:甘肅農業(yè)大學