一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法及其應(yīng)用，該方法包括以下步驟：（1）將金膜用含有巰基的硅烷溶液處理；（2）將經(jīng)步驟（1）處理后的金膜用酸溶液處理；（3）將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼于經(jīng)步驟（2）處理后的金膜上；（4）將經(jīng)步驟（3）得到的金膜依次的浸漬在四氯化硅（SiCl4）、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中（此過程可循環(huán)多次）；（5）將經(jīng)步驟（4）得到的金基底用酸溶液處理。本發(fā)明提供的方法易于在基底上制備三維結(jié)構(gòu)的納米管（柱）陣列，并且管（柱）的尺寸可控，可用作生物芯片，并可進(jìn)行高靈敏度、非標(biāo)記的生物檢測(cè)。
【專利說明】一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法及其應(yīng)用
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]本申請(qǐng)要求申請(qǐng)?zhí)枮?01310754275X、名稱為《一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法及其應(yīng)用》的中國專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片及其制備方法，具體地，本發(fā)明涉及一種在金膜上合成三維結(jié)構(gòu)二氧化硅納米管陣列生物芯片及其制備方法，以及該生物芯片在生物分子特異性檢測(cè)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0004]高靈敏度的生物傳感在許多領(lǐng)域中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，包括在生物醫(yī)藥研究、環(huán)境監(jiān)控、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、藥劑學(xué)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域，同時(shí)其也獲得了越來越廣泛的認(rèn)可。例如，基于熒光信號(hào)檢測(cè)的生物傳感的靈敏度就可以很高，甚至可以檢測(cè)到單個(gè)的生物分子。然而基于熒光法的生物傳感也有些弊端，如用熒光集團(tuán)標(biāo)記生物分子價(jià)格非常的昂貴并且很耗時(shí)，而且這種方法在某些應(yīng)用中甚至不可能實(shí)現(xiàn)。另外，標(biāo)記熒光集團(tuán)后可能會(huì)影響原有生物分子的某些功能。所以采用非標(biāo)記的方法去直接檢測(cè)生物分子的傳感器相比就顯得比較重要。
[0005]在過去的一二十年中，很多基于不同類型納米結(jié)構(gòu)的非標(biāo)記生物傳感器已經(jīng)得到廣泛的研究，這些傳感器都得益于納米技術(shù)的特點(diǎn)。例如有基于納米線、納米孔、納米管或納米柱類型的生物傳感器等。不同類型的非標(biāo)記的生物傳感器可以簡單和快速的將探針分子和靶分子之間的相互作用的響應(yīng)轉(zhuǎn)化成光信號(hào)、電信號(hào)、熱信號(hào)或是聲信號(hào)等。其中對(duì)于非標(biāo)記的光學(xué)生物傳感器來說，信號(hào)轉(zhuǎn)變方法主要分為兩類:光學(xué)干涉和表面等離子體?；诩{米薄膜結(jié)構(gòu)的光學(xué)波導(dǎo)傳感器就是一種典型的光學(xué)干涉的生物傳感器。它具有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)。首先、入射光的電磁場以增強(qiáng)的光波導(dǎo)模式被限制在納米薄膜層中，并且能夠有效地覆蓋到薄層中所吸附的生物分子。其次、由于納米薄膜具有很大的吸附生物分子表面積的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致生物分子的富集，所以可以進(jìn)一步提高生物傳感器的響應(yīng)。雖然如此，相對(duì)于基于熒光信號(hào)檢測(cè)的生物傳感器，非標(biāo)記的生物傳感器的靈敏度還不是很高。相應(yīng)的，如何提高非標(biāo)記的生物傳感器的響應(yīng)需要進(jìn)一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是提供了 一種基于三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片及其制作方法，以及其在生物分子特異性檢測(cè)方面中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0008]( I)將金膜用含有巰基的硅烷溶液處理；
[0009](2)將經(jīng)步驟(I)處理后的金膜用酸溶液處理；[0010](3)將通孔的陽極氧化鋁薄層膜貼于經(jīng)步驟(2)處理后的金膜上；
[0011](4)將經(jīng)步驟(3)得到的金膜順序的浸潰在四氯化硅(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中(此過程可循環(huán)多次);
[0012](5)將經(jīng)步驟(4)得到的金基底用酸溶液處理。
[0013]本發(fā)明還提供了由上述所述方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片。
[0014]本發(fā)明還提供了由上述所述方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片在生物分子特異性檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0015]在本發(fā)明中，將金膜用含有巰基的硅烷溶液處理，再用酸溶液處理，可以得到親水性的表面，然后將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼于金膜上，這樣金膜的親水性可以增強(qiáng)薄膜與金膜的連接，再通過交替浸入在四氯化硅(SiCl4)、正己烷、正己烷和甲醇的混合液、乙醇和水中一定次數(shù)得到二氧化硅管(柱)，最后將得到的金基底浸泡于酸溶液中得到三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片。本發(fā)明提供的方法易于在基底上制備三維結(jié)構(gòu)的納米管(柱)陣列，并且管(柱)的尺寸可控，可用作于生物芯片進(jìn)行高靈敏度、非標(biāo)記的生物檢測(cè)。
[0016]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實(shí)施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0018]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片界面的掃描電子顯微鏡圖(SEM)；
[0019]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中使用的通孔的陽極氧化鋁薄膜的表面掃描電子顯微鏡圖(SEM)；
[0020]圖3是本發(fā)明按照應(yīng)用例I的方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片特異性檢測(cè)鏈酶親和素(streptavidin)的反射率角度譜圖；
[0021]圖4是按照應(yīng)用例I和對(duì)比例I的方法制備的利用三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片檢測(cè)鏈酶親和素(streptavidin)的動(dòng)力學(xué)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0023]本發(fā)明提供了一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0024]( I)將金膜用含有巰基的硅烷溶液處理；
[0025](2)將經(jīng)步驟(I)處理后的金膜用酸溶液處理；
[0026](3)將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼于經(jīng)步驟(2)處理后的金膜上；
[0027](4)將經(jīng)步驟(3)得到的金膜使用溶膠凝膠法，依次順序的浸潰在四氯化硅(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中(此過程可循環(huán)多次)；
[0028](5)將經(jīng)步驟(4)得到的金基底用酸溶液處理，除去氧化鋁薄膜。[0029]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(I)中，所述金膜為表面具有金層的玻璃基底材料。在本發(fā)明，可以使用磁控濺射蒸鍍法或熱蒸鍍法在該基底材料上鍍上一層具有35-50nm厚度的金，優(yōu)選為 40_45nm。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(I)中，所述的巰基硅烷溶液為(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷溶液，所述溶液濃度為l_30mM，優(yōu)選為18-22mM。溶液中浸泡時(shí)間為3_12小時(shí)，優(yōu)選為3小時(shí)。本發(fā)明中，可將巰基硅烷溶解于有機(jī)溶劑中配成巰基硅烷有機(jī)溶液，其中對(duì)溶解所述巰基硅烷的有機(jī)溶劑沒有特殊要求，可以為本領(lǐng)域所熟知的有機(jī)溶劑，例如，可以為甲醇、乙醇或丙酮中的一種或多種，優(yōu)選地，可以為甲醇。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(2)中，所述酸溶液可以為鹽酸水溶液，濃度為0.05-0.2mol,優(yōu)選為0.1mol0溶液中處理時(shí)間為1-20小時(shí)，優(yōu)選為10-12小時(shí)，溫度為室溫。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(3)中，通孔的陽極氧化鋁薄膜和經(jīng)步驟(2)所得金膜基底可浸潰于丙酮或丙酮與水的混合溶液中。當(dāng)所述溶液為丙酮與水的混合液時(shí)，丙酮與水用量體積比可為1-3:1，優(yōu)選為1:1。氧化鋁薄膜覆蓋到金膜基底上，然后干燥箱中常溫放置24-48小時(shí)，優(yōu)選為24-30小時(shí)。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(4)中，經(jīng)步驟(3)處理的金膜基底依次順序的浸潰于四氯化硅(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中。其中在四氯化硅中浸潰時(shí)間為1-2分鐘，其他溶液中為3-5分鐘，優(yōu)選為5分鐘。正己烷與甲醇用量的體積比為1:1。步驟(4)為表面溶膠凝膠法的一次循環(huán)。
[0034]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(5)中，所用的酸溶液為磷酸溶液，濃度為5-15質(zhì)量％，優(yōu)選為10-12質(zhì)量％。溫度為20-40°C。
[0035]本發(fā)明還提供了由上述所述方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片。
[0036]本發(fā)明還提供了由上述所述方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片在生物分子特異性檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0037]以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于這些實(shí)施例。
[0038]在以下實(shí)施例和對(duì)比例中:
[0039]3_ 氨丙基三乙氧基娃燒(3-aminopropyltriethoxysilane)購自于 Alfa Aesar公司；生物素(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；鏈酶親和素(streptavidin)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
[0040]實(shí)施例1
[0041]本實(shí)施例用于說明采用本發(fā)明的方法制備三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物
-H-* I I
心/T O
[0042](I)金膜的制備:將K9玻璃片置于體積比為7:3的H2SO4 (98重量%)和H2O2 (30重量％)混合溶液中，清洗I小時(shí)，然后用去離子水沖洗干凈。將清潔后的K9玻璃片用磁控濺射法蒸鍍一層40nm厚的金，即本實(shí)施例使用的金基底；
[0043](2)金基底的巰基硅烷溶液處理:用甲醇配置20mmol的(3_巰基丙基)三甲氧基硅烷溶液。將經(jīng)步驟(I)得到的金基底浸入上述溶液中溶液3小時(shí)。
[0044](3)金基底的酸溶液處理:使用0.1mol的鹽酸溶液處理經(jīng)步驟(2)后的金基底，處理時(shí)間為10小時(shí)，常溫；
[0045](4)通孔氧化鋁薄膜貼于金基底上:通孔的陽極氧化鋁薄膜和經(jīng)步驟(3)所得金基底可浸入于丙酮與水的混合溶液，其中丙酮與水的用量體積比為1:1。讓氧化鋁薄膜貼于金基底上，然后干燥箱中常溫放置24小時(shí)。其中陽極氧化鋁薄膜的表面掃描電子顯微鏡圖(SEM)如圖2所不，圖中S4800表不掃描電子顯微鏡的型號(hào),5.0kV表不觀測(cè)樣品時(shí)所加的電壓，9.1mmX 50.0k分別表示電子槍與樣品的距離以及放大的倍數(shù)，2013-3-13表示拍照的日期，1.00 μ m表示標(biāo)尺。
[0046](5) 二氧化硅納米管的制備:將經(jīng)步驟(4)得到的金基底浸入四氯化硅中2分鐘，然后再依次浸入正己烷、1:1體積比的正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中各5分鐘。這樣一組是一次表面溶膠凝膠循環(huán)。對(duì)于本實(shí)施例，使用了 6次表面溶膠凝膠循環(huán)。
[0047]測(cè)得實(shí)施例1制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片如圖1所示。圖1中10為金膜,20為二氧化娃納米管陣列，S4800表不掃描電子顯微鏡的型號(hào),5.0kV表示觀測(cè)樣品時(shí)所加的電壓，9.9mmX50.0k分別表示電子槍與樣品的距離以及放大的倍數(shù)，2013-7-3表示拍照的日期，1.00 μ m表示標(biāo)尺。
[0048]應(yīng)用例I
[0049]特異性檢測(cè)鏈酶親和素
[0050]本應(yīng)用例使用按照實(shí)施例1方法制備的三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片。檢測(cè)裝置是基于Kretchmann結(jié)構(gòu)。當(dāng)滿足入射光與在納米管陣列層中的波導(dǎo)模式耦合時(shí)，經(jīng)過生物芯片反射光將在反射率角度譜上以一個(gè)共振凹槽的形式出現(xiàn)。這個(gè)共振凹槽的角度位置與納米管陣列層的有效折射率有關(guān)。任何通過吸附生物分子到納米管陣列層中或者由于待測(cè)溶液折射率的微小改變而導(dǎo)致納米管陣列層的有效折射率改變都將被波導(dǎo)模式放大，最終體現(xiàn)在反射率角度譜中共振凹槽的移動(dòng)。另外，如果把入射光角度固定在共振凹槽的角度附近去測(cè)量反射率，這種納米管陣列層的有效折射率的改變也可以通過折射的變化來量化。
[0051]生物芯片連接探測(cè)生物分子的方法如下:將生物芯片置于5重量％的3-氨丙基三乙氧基娃燒(3-aminopropyltriethoxysilane)溶液中24小時(shí)。3-氨丙基三乙氧基娃燒一端可以連接二氧化硅表面的羥基，另一端可以與含-NHS的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。此后，同一樣品上利用PDMS流道流入NHS修飾的生物素(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)溶液I小時(shí)后換成IOmmol磷酸緩沖液(buffer) —定時(shí)間，然后測(cè)量反射光的強(qiáng)度隨入射角度的變化，如圖3所示。圖3中，縱軸為反射率(Reflectivity),橫軸為光入射角度(Incident Angle),單位為度(degree)，數(shù)據(jù)點(diǎn)為菱形的曲線為使用該芯片檢測(cè)緩沖溶液(buffer)所得到的反射率角度譜圖，數(shù)據(jù)點(diǎn)為圓形的曲線為通入500 μ mol的生物素溶液(500 μ mol biotin)達(dá)到吸附飽和以后所測(cè)量的反射率角度譜圖，數(shù)據(jù)點(diǎn)為方形的曲線是通入IOOnmol鏈酶親和素(IOOnmol streptavidin)達(dá)到吸附飽和后所測(cè)的反射率角度譜圖。對(duì)于特異性檢測(cè)鏈酶親和素分子，IOOnmol的鏈酶親和素通過PDMS流道流入樣品表面90分鐘，然后用IOmmol磷酸緩沖溶液(buffer)沖洗一段時(shí)間，此過程中將入射角度固定在共振角度處(62.08° )，然后記錄反射率隨著時(shí)間的變化，如圖4所示。圖4中，縱軸為反射率(Reflectivity)，橫軸為時(shí)間(time)，單位為秒(s)，l表示應(yīng)用例I的結(jié)果曲線，2表示對(duì)比例I的結(jié)果曲線，
3表示通入IOOnmol鏈酶親和素(IOOnmol streptavidin)的時(shí)間點(diǎn),4表示通入緩沖溶液(buffer)的時(shí)間點(diǎn)。最后測(cè)量反射光的強(qiáng)度隨入射角度的變化，如圖3所示，共振凹槽的角度從修飾生物素后的62.08°移動(dòng)到結(jié)合鏈酶親和素的62.72°。
[0052]對(duì)比例I
[0053]檢測(cè)鏈酶親和素
[0054]生物芯片連接探測(cè)生物分子的方法如下:對(duì)于檢測(cè)鏈酶親和素分子，先用IOmmol的磷酸緩沖液通過PDMS流道流入樣品表面建立背景基線，然后通入IOOnmol的鏈酶親和素溶液到樣品表面，此過程中在通入磷酸緩沖溶液后測(cè)得的共振凹槽角度處測(cè)量反射率的變化，從圖4中看出，反射率的變化相對(duì)于應(yīng)用例I中幾乎可忽略。
[0055]本發(fā)明應(yīng)用例I和對(duì)比例I可充分說明鏈酶親和素分子與生物素分子特異性的結(jié)合在一起。另外，也可說明此三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片可以應(yīng)用于生物分子的特異性檢測(cè)。
[0056]本發(fā)明涉及在生物分子修飾方面在生物分子特異性檢測(cè)中的應(yīng)用并不受限于上述方法，可以使用其他末端訂制的烷基連接于二氧化硅管上，并使用相應(yīng)的生物分子連接方法。連接的生物分子也不受限于此實(shí)施例。
[0057]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0058]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。
[0059]此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片的制備方法，其特征是: A、將金膜用含有巰基的硅烷溶液處理； B、將經(jīng)步驟A處理后的金膜用酸溶液處理； C、將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼于經(jīng)步驟B處理后的金膜上； D、將經(jīng)步驟C得到的金膜順序地浸潰在四氯化硅、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水這五種溶液中，浸潰一次或循環(huán)多次； E、將經(jīng)步驟D得到的金基底用酸溶液處理，除去氧化鋁薄膜，得到三維二氧化硅納米管陣列結(jié)構(gòu)的生物芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟A中，所述的含有巰基的硅烷溶液為(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷溶液，且所述溶液濃度為l-30mM ;溶液中浸泡時(shí)間為3-12小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟A中，所述含有巰基的硅烷溶液是將巰基硅烷溶解于有機(jī)溶劑中配成的巰基硅烷有機(jī)溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟B中，所述酸溶液為鹽酸溶液，濃度為0.05-0.2mol ;溶液中處理時(shí)間為1-20小時(shí)，常溫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟C中，通孔的陽極氧化鋁薄膜和經(jīng)步驟B所得金膜基底浸潰于丙酮或丙酮與水的混合溶液中；當(dāng)所述溶液為丙酮與水的混合液時(shí)，丙酮與水用量體積比為1-3:1 ;氧化鋁薄膜覆蓋到金膜基底上，然后干燥箱中常溫放置24-48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟D中，在四氯化硅中浸潰時(shí)間為1-2分鐘，其他溶液中為3-5分鐘；正己烷與甲醇用量的體積比為1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟E中，所用的酸溶液為磷酸溶液，濃度為5-15質(zhì)量％ ;溫度為20-40°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:在步驟A中，所述金膜附著于玻璃基底材料的表面，金膜的厚度為40-45nm。
9.一種基于三維結(jié)構(gòu)納米陣列生物芯片，其特征是:按照權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求中所述的方法制備。
10.一種非標(biāo)記的直接檢測(cè)生物分子的生物芯片，其特征是:使按照權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求中所述的方法制備的生物芯片，用于生物分子的特異性檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/41GK103712951SQ201410004328
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】孫樹清, 凡勇, 丁宇, 何永紅, 馬輝 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院