基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨sted顯微成像系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)。皮秒脈沖激光器或飛秒脈沖激光器輸出的激光脈沖入射到光子晶體光纖上得到寬帶激光光源；寬帶激光光源輸出的脈沖激光入射到聲光調(diào)制器上得到重復(fù)頻率的激光脈沖；激光脈沖光束的光路上設(shè)有光束分離器和若干個(gè)反射鏡，將激光脈沖光束分離為2束平行的輸出光束；1束輸出光束通過波長選擇器得到STED光束，STED光束的光路上設(shè)有位相板，STED光束經(jīng)過位相板后再依次通過直角棱鏡和二向色性濾光片后入射到光學(xué)顯微鏡；另1束輸出光束通過波長選擇器得到激發(fā)光束，激發(fā)光束的光路上依次設(shè)有二向色性濾光片和帶通濾光片，激發(fā)光束經(jīng)過二向色性濾光片和帶通濾光片后入射到光電探測器。
【專利說明】基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微
成像系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，屬于光學(xué)顯微成像領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]光學(xué)顯微成像以其非侵入式三維成像能力，在生命科學(xué)成像研究中仍然占據(jù)大約80% 的份額(Stefan ff.Hell, et al.，Science, 316，25 (2007))。但是由于光學(xué)衍射原理的限制，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能達(dá)到波長量級的空間分辨率(一般在200nm?500nm)，限制了它在納米尺度對分子結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究中的應(yīng)用。
[0003]近幾年各國研究人員提出了幾種突破衍射極限的方法。其中光活化定位顯微鏡[3] (Photoactivated localization microscopy-PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy-STORM)通過觸發(fā)光活化突光蛋白發(fā)光，然后利用點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)擬合實(shí)現(xiàn)高分辨率單分子定位，獲得了好于30nm的橫向空間分辨率。該超分辨成像技術(shù)中單分子的定位精度受信噪比影響很大，而且要求樣品含有較低濃度的熒光分子。
[0004]受激福射耗盡(Stimulated emission depletion-STED)顯微鏡通過使用一束STED光束形成空殼形狀焦斑，將衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射態(tài)，也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了好于30nm的橫向空間分辨率。由于全部使用光學(xué)設(shè)置，圖像采集時(shí)間大致與普通共聚焦顯微鏡相同，對樣品準(zhǔn)備沒有特殊要求，因此可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)生物分子的實(shí)時(shí)成像和動態(tài)跟蹤。
[0005]與普通熒光顯微鏡不同的是，STED顯微鏡要求激發(fā)和STED兩束光，最早實(shí)現(xiàn)的STED顯微成像是采用兩個(gè)脈沖激光器，其中STED光脈沖比激發(fā)光脈沖延遲幾個(gè)皮秒，以便及時(shí)將激發(fā)光激發(fā)的熒光分子退激發(fā)，其困難之一在于兩列脈沖的同步調(diào)節(jié)。而且脈沖激光器往往只有幾個(gè)固定的輸出波長，只能提供為數(shù)不多的熒光分子所需要的激發(fā)和STED光波長，設(shè)備花費(fèi)也非常昂貴。
[0006]連續(xù)輸出激光器可以提供大多數(shù)熒光分子所需要的激發(fā)和STED波長，而且無需同步調(diào)節(jié)即可實(shí)現(xiàn)STED顯微成像，設(shè)備構(gòu)建較為簡單，但是基于連續(xù)輸出激光的STED顯微鏡需要很強(qiáng)的激光功率實(shí)現(xiàn)所需的STED功率密度，極易造成熒光分子的光漂白，不適合于單分子成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，所述顯微成像系統(tǒng)中，只需一個(gè)光源同時(shí)提供STED顯微鏡所需要的激發(fā)和STED光，不存在兩光束的同步失調(diào)問題，設(shè)備成本也大大降低。同時(shí)，通過激光脈沖重復(fù)頻率調(diào)節(jié)器，可以獲得較低的激光脈沖重復(fù)頻率，降低熒光分子光漂白的影響。使用波長選擇器可以方便地選擇需要的激發(fā)光和STED光波長,適用于大多數(shù)突光標(biāo)記物,擴(kuò)展STED顯微鏡的應(yīng)用范圍。
[0008]本發(fā)明所提供的一種基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，皮秒脈沖激光器或飛秒脈沖激光器輸出的激光脈沖入射到光子晶體光纖上得到寬帶激光光源；所述寬帶激光光源輸出的脈沖激光入射到聲光調(diào)制器上得到重復(fù)頻率的激光脈沖；所述激光脈沖光束的光路上設(shè)有光束分離器和若干個(gè)反射鏡，將所述激光脈沖光束分離為2束平行的輸出光束；
[0009]I束所述輸出光束通過波長選擇器得到STED光束，所述STED光束的光路上設(shè)有位相板，所述STED光束經(jīng)過所述位相板后再依次通過直角棱鏡和二向色性濾光片后入射到光學(xué)顯微鏡；
[0010]另I束所述輸出光束通過波長選擇器得到激發(fā)光束，所述激發(fā)光束的光路上依次設(shè)有二向色性濾光片和帶通濾光片，所述激發(fā)光束經(jīng)過所述二向色性濾光片和所述帶通濾光片后入射到光電探測器。
[0011]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，應(yīng)用所述光子晶體光纖的超連續(xù)產(chǎn)生可以提供高亮度超寬帶光譜，由同一臺寬帶脈沖激光器同時(shí)提供熒光激發(fā)和STED的波長。
[0012]熒光分子光漂白的主要原因之一是由于熒光分子躍遷到三重態(tài)所致，由于三重態(tài)為亞穩(wěn)態(tài)，平均壽命大約在微秒量級，不能及時(shí)躍遷到分子的基態(tài)，導(dǎo)致熒光分子漂白。適當(dāng)調(diào)節(jié)選擇激發(fā)光脈沖重復(fù)頻率，使得處于三重態(tài)的分子有充分的時(shí)間躍遷到基態(tài)，就可以有效地降低光漂白效應(yīng)。
[0013]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，所述STED光束的光路上，所述波長選擇器與所述位相板之間可設(shè)有光纖耦合器。
[0014]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中,所述光纖稱合器可為單模光纖稱合器,輸出高質(zhì)量的單模光束。
[0015]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，所述激發(fā)光束的光路上，所述波長選擇器與所述反射鏡之間設(shè)有光纖耦合器。
[0016]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中,所述光纖稱合器可為單模光纖稱合器,輸出高質(zhì)量的單模光束。
[0017]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，所述帶通濾光片與所述光電探測器之間設(shè)有光纖稱合器。
[0018]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，所述光纖稱合器可為多模光纖稱合器,輸出高質(zhì)量的多模光束。
[0019]上述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)中，所述直角棱鏡由兩只垂直放置的反射鏡組成。
[0020]為了獲得最佳的STED顯微成像效果，激發(fā)脈沖和STED脈沖的同步延遲時(shí)間應(yīng)該小于分子振動弛豫時(shí)間，以有效耗盡熒光態(tài)分子。STED光路中設(shè)有直角棱鏡或者兩只垂直放置的反射鏡組成的光學(xué)延遲線，通過調(diào)節(jié)其中的直角棱鏡實(shí)現(xiàn)激發(fā)脈沖和STED脈沖的同步時(shí)間調(diào)節(jié)。
[0021]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)由所述寬帶激光光源提供照明，可以提供從近紫外到中紅外的寬廣波帶范圍內(nèi)的激光波長，而且可以達(dá)到InJAim以上的光譜能量密度，可以適用于絕大多數(shù)熒光樣品的激發(fā)；(2)由同一臺所述脈沖激光器同時(shí)提供具有多個(gè)激發(fā)波長的激光光源，克服了多臺脈沖激光器同步失調(diào)和波長數(shù)有限的缺點(diǎn)，同時(shí)降低了設(shè)備的成本；(3)由同一臺所述脈沖激光器輸出的所述激光光源提供照明，克服了連續(xù)輸出激光器連續(xù)激發(fā)樣品導(dǎo)致的樣品變性甚至損壞的缺點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中的STED激光脈沖再經(jīng)過位相板進(jìn)行波前調(diào)制后在物鏡焦平面上獲得空殼型焦斑。
[0024]圖3為使用實(shí)施例1的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)對熒光標(biāo)記的納米微球的共聚焦和STED顯微圖像。
[0025]圖中各標(biāo)記如下:1皮秒脈沖激光器、2非線性光子晶體光纖、3聲光調(diào)制器、4光束分離器、5波長選擇器、6單模光纖稱合器、7位相板、8直角棱鏡、9,10 二向色性過濾片、11光學(xué)顯微鏡、12帶通濾波片、13多模光纖耦合器、14光電探測器。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0027]實(shí)施例1、基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)
[0028]本發(fā)明提供的基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，在皮秒脈沖激光器I輸出的激光光源入射到非線性光子晶體光纖2上，得到了寬帶激光光源；該寬帶激光光源輸出的脈沖激光入射到聲光調(diào)制器3上,通過控制聲光調(diào)制器3的射頻脈沖重復(fù)頻率即可控制輸出激光脈沖的重復(fù)頻率，得到了合適的重復(fù)頻率的激光脈沖光束；該激光光束通過光束分離器4，得到兩束平行的輸出光束；每路輸出光束通過波長選擇器5獲得合適的激發(fā)和STED波長，波長選擇后的輸出激光脈沖經(jīng)過單模光纖耦合器6輸出高質(zhì)量的單模激光脈沖；其中STED激光脈沖再經(jīng)過位相板7進(jìn)行波前調(diào)制，在物鏡焦平面上獲得空殼型焦斑，如圖2所示，再經(jīng)過由直角棱鏡組成的光學(xué)延遲線，通過調(diào)節(jié)其中的直角棱鏡實(shí)現(xiàn)激發(fā)脈沖和STED脈沖的同步時(shí)間調(diào)節(jié)，再通過二向色性濾光片10后入射到光學(xué)顯微鏡11上。另I束激發(fā)光束得到的單模激光脈沖依次經(jīng)過反射鏡、二向色性過濾片9、帶通濾波片12和多模光纖耦合器13后入射到光電探測器14上。
[0029]上述的基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，激光光源還可為飛秒激光器。
[0030]使用上述基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)對熒光標(biāo)記的直徑為40納米的熒光納米微球進(jìn)行了共聚焦和受激輻射耗盡顯微(STED)成像試驗(yàn)，通過波長選擇器選擇合適的激發(fā)和受激輻射耗盡波長，通過光學(xué)延遲線調(diào)節(jié)合適的同步延遲時(shí)間，獲得了圖2右圖所示受激輻射耗盡顯微圖像(IOumX 10um，1024像素X 1024像素)。其中左圖為其對應(yīng)的共聚焦顯微圖像，可以看到在受激輻射耗盡顯微圖像中箭頭所指納米微球亮度的半高全寬為42納米，而對應(yīng)的共聚焦圖像中亮斑的半高全寬為540納米，實(shí)現(xiàn)了光學(xué)超分辨成像。
【權(quán)利要求】
1.基于超連續(xù)產(chǎn)生的寬帶激光光源激發(fā)的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于: 皮秒脈沖激光器或飛秒脈沖激光器輸出的激光脈沖入射到光子晶體光纖上得到寬帶激光光源；所述寬帶激光光源輸出的脈沖激光入射到聲光調(diào)制器上得到重復(fù)頻率的激光脈沖；所述激光脈沖光束的光路上設(shè)有光束分離器和若干個(gè)反射鏡，將所述激光脈沖光束分離為2束平行的輸出光束； I束所述輸出光束通過波長選擇器得到STED光束，所述STED光束的光路上設(shè)有位相板，所述STED光束經(jīng)過所述位相板后再依次通過直角棱鏡和二向色性濾光片后入射到光學(xué)顯微鏡； 另I束所述輸出光束通過波長選擇器得到激發(fā)光束，所述激發(fā)光束的光路上依次設(shè)有二向色性濾光片和帶通濾光片，所述激發(fā)光束經(jīng)過所述二向色性濾光片和所述帶通濾光片后入射到光電探測器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述STED光束的光路上，所述波長選擇器與所述位相板之間設(shè)有光纖耦合器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述光纖耦合器為單模光纖稱合器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述激發(fā)光束的光路上，所述波長選擇器與所述反射鏡之間設(shè)有光纖耦合器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述光纖耦合器為單模光纖稱合器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述帶通濾光片與所述光電探測器之間設(shè)有光纖耦合器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述光纖耦合器為多模光纖稱合器。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的超分辨STED顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述直角棱鏡由兩只垂直放置的反射鏡組成。
【文檔編號】G01N21/01GK103616330SQ201310576406
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】袁景和, 于建強(qiáng), 方曉紅 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所