一種五加芪口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的五加芪口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，包括對五加芪口服液進(jìn)行定性分析和定量檢測，其中定性分析包括采用薄層色譜法對五加芪口服液中的黃芪甲苷和異嗪皮啶分別進(jìn)行鑒定，定量檢測包括對五加芪口服液中的黃芪甲苷含量和總糖含量分別采用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法進(jìn)行檢測。與靈芪加口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法相比，本發(fā)明的檢驗(yàn)方法專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性良好，可用于對五加芪口服液的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)，從而有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，保證其臨床使用的安全、有效和穩(wěn)定。
【專利說明】-種五加庚口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種五加茂口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，該方法 可用于對五加茂口服液的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著養(yǎng)殖業(yè)向集約化和工廠化發(fā)展，畜禽對病原微生物的易感性不斷增加，病害 頻繁發(fā)生，為了防治疾病，傳統(tǒng)做法是大量使用抗生素類藥物，結(jié)果使耐藥菌株不斷增多， 導(dǎo)致畜禽免疫功能急劇下降、生長受阻，抗生素的濫用還導(dǎo)致疫苗接種反應(yīng)增強(qiáng)，副作用加 大或使免疫接種失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 免疫增強(qiáng)劑是一類單獨(dú)或與抗原同時(shí)使用增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體非特異性和特異性免疫 的物質(zhì)，目前使用的免疫增強(qiáng)劑種類很多，包括生物性免疫增強(qiáng)劑，如干擾素；化學(xué)性免疫 增強(qiáng)劑，如左旋咪哇等，其存在著高劑量產(chǎn)生免疫抑制或?qū)C(jī)體有害等缺點(diǎn)，研制開發(fā)無毒 害、作用強(qiáng)的新型中藥免疫增強(qiáng)劑已成為迫切需要。
[0004] 五加茂口服液由黃茂和刺五加兩味中藥組成，處方來源于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)》中 的靈茂加口服液，靈茂加口服液由靈芝、黃茂和刺五加；味中藥組成，從節(jié)約養(yǎng)殖成本上考 慮去除價(jià)格昂貴的靈芝，并通過小鼠脾臟淋己細(xì)胞增殖試驗(yàn)篩選出黃茂與刺五加的最佳比 例。本處方具有補(bǔ)中益氣、扶正巧邪的功能，臨床用于提高機(jī)體免疫力，配合疫苗使用提高 疫苗免疫效果。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，五加茂口服液W每升水1ml混飲，連用7日，能夠提高 雞非特異性免疫能力、雞新城疫和禽流感（H9)抗體水平W及雞的生產(chǎn)性能。
[0005] 五加茂口服液是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論開發(fā)的中藥免疫增強(qiáng)劑，尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不利 于控制其質(zhì)量，為保證臨床使用安全、有效和穩(wěn)定，有必要建立一個(gè)完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其檢 驗(yàn)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種五加茂口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方 法。通過建立和實(shí)施該檢驗(yàn)方法，可增強(qiáng)該藥的有效性、質(zhì)量可控性和穩(wěn)定性。
[0007] 本發(fā)明提供的五加茂口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，包括對五加茂口服液進(jìn)行定性分析 和定量檢測，其中定性分析包括采用薄層色譜法對五加茂口服液中的黃茂甲巧和異嗦皮巧 的分別鑒定，定量檢測包括對五加茂口服液中的黃茂甲巧含量和總糖含量分別采用高效液 相色譜法和紫外-可見分光光度法進(jìn)行檢測。
[000引本發(fā)明中五加茂口服液的處方為；黃茂800g，刺五加200g。
[0009] 本發(fā)明的五加茂口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法包括如下內(nèi)容：
[0010] 一、黃茂的鑒定
[0011] 由于黃茂甲巧是黃茂的特征化學(xué)成分，因此本發(fā)明中對五加茂口服液中的黃茂進(jìn) 行鑒定主要是鑒定其中的黃茂甲巧。采用的鑒定方法為薄層色譜法，包括如下步驟：
[0012] (1)制備待測樣品溶液
[0013] 取五加茂口服液3ml，加水27ml，用水飽和的正下醇振搖提取2次，每次20ml，合并 正下醇液，用水洗涂2次，每次20ml，棄去水液，正下醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使之溶解，作 為待測樣品溶液。
[0014] (2)制備對照樣品溶液
[0015] 取黃茂甲巧對照樣品，加甲醇制成每1ml甲醇含0. 5mg黃茂甲巧的溶液，作為對照 樣品溶液。
[0016] (3 )采用薄層色譜法鑒定五加茂口服液中的黃茂
[0017] 吸取上述步驟（1)和（2)中的兩種溶液各4ul，分別點(diǎn)于同一娃膠G薄層板上，W H氯甲焼-甲醇-水（體積比為13:7:2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，瞭干，噴W 10% (v/v)硫酸己醇溶液，在105C條件下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。如果待測樣品色譜中，在與對 照樣品色譜相應(yīng)的位置上，顯示與對照樣品相同顏色的斑點(diǎn)，則說明待測樣品中含有黃茂 甲巧，即含有黃茂。
[0018] 二、刺五加的鑒定
[0019] 由于異嗦皮巧是刺五加的特征化學(xué)成分，因此本發(fā)明中對五加茂口服液中的刺五 加進(jìn)行鑒定主要是鑒定其中的異嗦皮巧。采用的鑒定方法為薄層色譜法，包括如下步驟：
[0020] (1)制備待測樣品
[0021] 取五加茂口服液30ml，用H氯甲焼振搖提取2次，每次15ml，合并H氯甲焼液，蒸 干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為待測樣品溶液。
[0022] (2)制備對照樣品溶液
[0023] 取異嗦皮巧對照樣品，加甲醇制成每1ml甲醇含0. 5mg異嗦皮巧的溶液，作為對照 樣品溶液。
[0024] (3)采用薄層色譜法鑒定五加茂口服液中的刺五加
[0025] 吸取上述步驟（1)和（2)中的兩種溶液各5y 1，分別點(diǎn)于同一娃膠G薄層板上， 氯甲焼-甲醇-水（體積比為19:1:0. 1)為展開劑，展開，取出，瞭干，置于紫外光燈 (365nm)下進(jìn)行檢視。如果待測樣品色譜中，在與對照樣品色譜相應(yīng)的位置上，顯示與對照 樣品相同的藍(lán)色英光斑點(diǎn)，則說明待測樣品中含有異嗦皮巧，即含有刺五加。
[0026] H、黃茂甲巧含量的檢測
[0027] 由于黃茂是五加茂口服液中的君藥，黃茂甲巧是其特征有效成份，藥理研究表明 黃茂甲巧具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。因此，檢測五加茂口服液中黃茂甲巧的含量可W用 于評價(jià)五加茂口服液的質(zhì)量。采用的檢測方法為高效液相色譜法，包括如下步驟：
[0028] ( 1)進(jìn)行色譜條件選擇與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
[0029] W十八焼基娃焼鍵合娃膠為填充劑，W己膳-水(體積比為35:65)為流動(dòng)相，采用 蒸發(fā)光散射檢測器檢測，理論培板數(shù)按黃茂甲巧峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。
[0030] (2)制備對照樣品溶液
[0031] 取黃茂甲巧對照樣品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg黃茂甲巧的 溶液，即得。
[0032] (3)制備待測樣品溶液
[0033] 精密量取五加茂口服液5ml，加水5ml，用水飽和的正下醇振搖提取4次，每次 40ml，合并正下醇液，用氨試液充分洗涂2次，每次約40ml，棄去氨液，將正下醇液蒸干，殘 渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0034] (4)檢測待測樣品中的黃茂甲巧含量
[00巧]分別精密吸取對照樣品溶液5 y 1、15 y 1，待測樣品溶液10 y 1，注入液相色譜儀， 測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得到待測樣品中的黃茂甲巧含量。
[003引四、總糖含量的檢測
[0037] 五加茂口服液中總糖含量為刺五加所含糖類成分和黃茂所含糖類成分的總和。由 于刺五加和黃茂都含有多糖和寡糖等糖類成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該些多糖類和寡糖類 成分均有增強(qiáng)免疫功能的作用。因此，檢測五加茂口服液中刺五加和黃茂的總含糖量可W 用于評價(jià)五加茂口服液的質(zhì)量。采用的檢測方法為紫外-可見分光光度法，包括如下步驟：
[0038] (1)制備對照樣品溶液
[0039] 取無水葡萄糖對照樣品適量，精密稱定，加水制成每1ml水含無水葡萄糖0. 6mg的 溶液，即得。
[0040] (2)制備待測樣品溶液
[0041] 精密量取本品5ml，置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置于 50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0042] (3)檢測待測樣品中的總糖含量
[0043] 精密量取對照樣品溶液與待測樣品溶液各2ml，置于25ml量瓶中，精密加入5%苯 酷溶液1ml，搖勻，迅速精密加入硫酸5ml，搖勻，置于水浴中保溫15min，取出，置于冰水浴 中冷卻3min，加水稀釋至近刻度，再置于冰水浴中冷卻3min，取出，加水至刻度，搖勻；另量 取水2ml，同上平行操作作為空白對照，采用紫外-可見分光光度法，在490nm波長處測定吸 光度，按外標(biāo)法W吸光度值計(jì)算待測樣品中的總糖含量。
[0044] 與靈茂加口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法相比，本發(fā)明的檢驗(yàn)方法使用了高效液相色譜法 檢測黃茂甲巧含量，并增加了總糖含量的檢測方法，同時(shí)采用薄層色譜法分別鑒定五加茂 口服液中的黃茂甲巧和異嗦皮巧。該檢驗(yàn)方法專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性良好，可用于對五加 茂口服液的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)，從而有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，保證其臨床使用安全、有效和 穩(wěn)定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1是實(shí)施例2中黃茂鑒定薄層色譜圖；
[0046] 圖中附圖標(biāo)記如下；1黃茂甲巧；2?4待測樣品；5陰性對照。
[0047] 圖2是實(shí)施例2中刺五加鑒定薄層色譜圖；
[0048] 圖中附圖標(biāo)記如下；1異嗦皮巧；2?4待測樣品；5陰性對照。
[0049] 圖3是實(shí)施例3中采用高效液相色譜法檢測黃茂甲巧含量的專屬性試驗(yàn)色譜圖。
[0050] 圖中附圖標(biāo)記如下；1黃茂甲巧對照樣品色譜圖；2待測樣品色譜圖；5陰性對照 色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0052] 實(shí)施例1制備五加茂口服液
[0053] 五加茂口服液；處方包括黃茂800g和刺五加200g。
[0054] 制法；將W上2味中藥粉碎成最粗粉，加8倍量水，浸泡比，煎煮回流提取化，過 濾，濾渣再加水提取2次，每次加8倍量水并回流提取化，分次過濾，合并濾液，趁熱（50? 6(TC )離也，上清液濃縮至相對密度1. 05?1. 08 (《7(TC )，冷藏12?2化，離也，上清液 減壓濃縮至相對密度1. 15?1. 23 (《7(TC )，再冷藏12?2化，離也，上清液加純化水至 1000ml，攬勻，濾過，分裝，即得。
[00巧]實(shí)施例2五加茂口服液鑒定方法專屬性考察 [005引 （1)試劑與樣品
[0057] 對照樣品：黃茂甲巧，批號；110781-200613,購自中國食品藥品檢定研究院；異嗦 皮口產(chǎn)，批號；110837-200304,購自中國食品藥品檢定研究院。
[005引五加茂口服液讀施例1制備。
[0059] 陰性對照樣品：按照實(shí)施例1方法制備各鑒定項(xiàng)陰性對照樣品。
[0060] (2)黃茂的鑒定
[0061] 取實(shí)施例1制備的樣品3ml，加水27ml，用水飽和的正下醇振搖提取2次，每次 20ml，合并正下醇液，用水洗涂2次，每次20ml，棄去水液，正下醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml 使之溶解，作為待測樣品溶液；另取黃茂甲巧對照樣品，加甲醇制成每ImL甲醇含0. 5mg黃 茂甲巧的溶液，作為對照樣品溶液；按處方配比稱取刺五加并按實(shí)施例1制備工藝制備樣 品作為陰性對照樣品，取陰性對照樣品同法操作制備陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸 取上述H種溶液各4 y 1，分別點(diǎn)于同一娃膠G薄層板上，氯甲焼-甲醇-水(體積比為 13:7:2)的下層溶液作為展開劑，展開，取出，瞭干，噴W 10% (v/v)硫酸己醇溶液，105C加 熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果如圖1所示。
[006引從圖1可見；在與對照樣品色譜相應(yīng)的位置上，待測樣品顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰 性對照不顯示斑點(diǎn)，表明方法專屬性良好。
[006引 （3)刺五加的鑒定
[0064] 取實(shí)施例1制備的樣品30ml，用H氯甲焼振搖提取2次，每次15ml，合并H氯甲焼 液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為待測樣品溶液；另取異嗦皮巧對照樣品，加甲醇制成 每1ml甲醇含0. 5mg異嗦皮巧的溶液，作為對照樣品溶液；按處方配比稱取黃茂并按實(shí)施例 1制備工藝制備樣品作為陰性對照樣品，取陰性對照樣品同法操作制備陰性對照溶液。照薄 層色譜法試驗(yàn)，吸取上述H種溶液各5 y 1，分別點(diǎn)于同一娃膠G薄層板上，氯甲焼-甲 醇-水(體積比為19:1:0. 1)為展開劑，展開，取出，瞭干，置于紫外光燈（365nm)下檢視，結(jié) 果如圖2所示。
[0065] 從圖2可見；在與對照樣品色譜相應(yīng)的位置上，待測樣品顯示相同的藍(lán)色英光斑 點(diǎn)，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。
[0066] 實(shí)施例3黃茂甲巧含量檢測方法學(xué)考察
[0067] (1)儀器與試劑、樣品 [006引儀器：
[0069] 高效液相色譜儀，e2695型，美國沃特世公司；蒸發(fā)光散射檢測器，2424型，美國沃 特世公司；電子分析天平，AB135-S型，梅特勒巧利多公司。
[0070] 試劑；己膳為色譜純冰為二次重蒸水；其他試劑均為分析純。
[0071] 對照樣品：黃茂甲巧，批號；110781-200613,購自中國食品藥品檢定研究院。
[0072] 五加茂口服液讀施例1制備。
[0073] (2)色譜條件
[0074] 色譜柱為 Kromasill00-5C18 柱（150X4. 6mm，5y m);流動(dòng)相為己膳-水（35:65); 蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度為6(TC，噴霧器溫度為36C ;柱溫為3(TC ;流速為 1. Oml/min。
[00巧](3)溶液的制備
[0076] 對照樣品溶液的制備精密稱取黃茂甲巧對照樣品25. 4mg，置于50ml量瓶中，加甲 醇溶解并稀釋至刻度，即得。
[0077] 待測樣品溶液的制備精密量取實(shí)施例1制備的樣品5ml，加水5ml，用水飽和的正 下醇振搖提取4次，每次40ml，合并正下醇液，用氨試液充分洗涂2次，每次約40ml，棄去氨 液，正下醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0078] 陰性對照溶液的制備：按照實(shí)施例1的制備方法制備缺黃茂的陰性對照樣品，取 陰性對照樣品，再按照待測樣品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，即得。
[0079] (4)專屬性試驗(yàn)
[0080] 分別精密吸取對照樣品溶液15U 1、待測樣品溶液lOy 1、陰性對照溶液lOy 1，注 入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見；待測 樣品色譜中黃茂甲巧的保留時(shí)間與對照樣品一致，而陰性對照在對照樣品、待測樣品色譜 峰相應(yīng)的位置上無干擾，方法專屬性良好。
[0081] (5)線性范圍考察
[008引精密稱取黃茂甲巧對照樣品25. 4mg，加甲醇制成0. 508mg/ml的溶液，按上述色譜 條件分別進(jìn)樣3y l、5y l、l0y l、15y l、20y 1測定。W峰面積對數(shù)（y)為縱坐標(biāo)，W進(jìn)樣 量對數(shù)（X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=l. 4828X+5. 312，r=0. 9991，結(jié)果表明， 在1. 524 y g?10. 16 y g范圍內(nèi)，黃茂甲巧峰面積對數(shù)與進(jìn)樣量對數(shù)有良好的線性關(guān)系，數(shù) 據(jù)見表1。
[0083] 表1線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種五加芪口服液的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，包括對五加芪口服液進(jìn)行定性分析和定量檢 測，所述定量檢測包括檢測五加芪口服液中的黃芪甲苷含量以及五加芪口服液中的總糖含 量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述五加芪口服液中總糖含量為五加芪 口服液中的刺五加所含糖類成分和黃芪所含糖類成分的總和。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢測總糖含量以無水葡萄糖為對照 樣品，采用紫外-可見分光光度法，在490nm波長處測定對照樣品和五加芪口服液待測樣品 的吸光度，并按外標(biāo)法以吸光度值計(jì)算而得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測黃芪甲苷含量以黃芪甲苷為對 照樣品，采用高效液相色譜法測定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對五加芪口服液進(jìn)行定 性分析包括對刺五加進(jìn)行鑒定和對黃芪進(jìn)行鑒定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述對刺五加進(jìn)行鑒定和對黃芪進(jìn)行鑒 定通過采用薄層色譜法分別鑒定五加芪口服液中的異嗪皮啶和黃芪甲苷。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用薄層色譜法鑒定五加芪口服液 中的異嗪皮啶包括以異嗪皮啶為對照樣品，以甲醇為溶劑，以三氯甲烷-甲醇-水為展開 齊U，將對照樣品溶液和五加芪口服液待測樣品溶液在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣展開，并置 于紫外光燈下進(jìn)行檢視。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述展開劑中三氯甲烷-甲醇-水的體積 比為 19:1:0. 1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用薄層色譜法鑒定五加芪口服液 中的黃芪甲苷包括以黃芪甲苷為對照樣品，以甲醇為溶劑，以三氯甲烷-甲醇-水為展開 齊U，將對照樣品溶液和五加芪口服液待測樣品溶液在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣展開，并噴 以硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于1所述展開劑中三氯甲烷-甲醇-水的體 積比為13:7:2。
【文檔編號】G01N21/31GK104422663SQ201310384903
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 劉興金, 張曉會(huì) 申請人:洛陽惠中獸藥有限公司