血漿中肌苷含量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定人體血漿中肌苷含量的方法，它包括如下步驟：（a）在人體空白血漿250ul中加入肌苷標準品溶液25ul，配制成至少五份不同濃度的肌苷血漿溶液，再分別加入0.1ug/ml拉米夫定標準液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，渦流混合，得混合溶液；將所述混合溶液分別加入經(jīng)活化的HLB固相萃取柱中進行洗脫，棄洗脫液，再用1ml流動相溶液洗脫，收集洗脫液，離心，取上清液；（b）將經(jīng)步驟（a）制得的上清液在特定的質譜和色譜條件下進行LC/MS/MS分析（c）基于步驟（b）的分析結果，用同樣的方法建立當日的標準曲線及定量下限進行計算，得到待測人體血漿中的肌苷含量。
【專利說明】血漿中肌苷含量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測領域，特別是涉及一種人體血漿中肌苷含量的測定方法。
【背景技術】
[0002]肌苷(Inosine)，也稱為次黃苷、次黃嘌呤核苷等。肌苷是人體的正常成分，為腺嘌呤的前體，能直接透過細胞膜進入體細胞，參與體內(nèi)核酸代謝、能量代謝和蛋白質的合成。
[0003]研究證實:肌苷能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，活化肝功能，并使處于低能缺氧狀態(tài)下的組織細胞繼續(xù)進行代謝，有助于受損肝細胞功能的恢復。并參與人體能量代謝與蛋白質合成。肌苷能提高ATP水平并可轉變?yōu)楦鞣N核苷酸?？纱碳んw內(nèi)產(chǎn)生抗體，還可提高腸道對鐵的吸收，活化肝功能，加速肝細胞的修復。有增強白細胞增生的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的旨在提供一種建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定標準曲線及定量下限的方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種測定人體血漿中肌苷含量的方法。
[0006]具體地說，本發(fā)明第一方面是提供了一種建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定標準曲線及定量下限的方法，它包括如下步驟:
[0007](a)在人體空白血漿250ul中加入肌苷標準品溶液25ul，配制成至少五份不同濃度的肌苷血漿溶液，再分別加入0.lug/ml拉米夫定標準液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，渦流混合，得至少五份混合溶液；將所述混合溶液分別加入經(jīng)活化的HLB固相萃取柱中進行洗脫，棄洗脫液，再用Iml流動相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脫，收集洗脫液，離心，取上清液；
[0008](b)將經(jīng)步驟(a)制得的上清液在下述條件下進行LC/MS/MS分析
[0009]質譜條件:
[0010]Compound (化合物參數(shù)):
[0011]肌昔母子離子對:269.1/137.1, time:400msec
[0012]拉米夫定母子離子對:230.2/112.2, time:200msec
[0013]Duration:4min
[0014]Cycles:393
[0015]DP=26
[0016]CE=15
[0017]CXP=4
[0018]CEP=4
[0019]Qlresolution:Unit
[0020]Q2resolution:Unit,
[0021]Source/Gas (離子源 / 氣參數(shù)):[0022]1n Source:Turbo Spray
[0023]Curtain Gas (CUR):10
[0024]Collision Gas (CAD):Medium
[0025]1n Spray Voltage (IS):5000
[0026]Temperature (TEM):700
[0027]1n Source Gasl (Gasl):60
[0028]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0029]Interface Heater (ihe):0N,
[0030]液相色譜條件:
[0031]色譜柱:WatersXBridge? C18，規(guī)格:3.5um，2.1 X 100mm，Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0032]流動相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0033]流速:0.2ml/min
[0034]進樣量:IOul
[0035]進樣時間:4min ；
[0036](c)基于步驟(b)的分析結果，建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定的標準曲線及定量下限。
[0037]在一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中還包括將所述混合溶液_70°C凍存的步驟。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述不同濃度的肌苷血漿溶液為六份，其濃度分別為18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和 594.5ug/ml。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)活化的HLB固相萃取柱的活化步驟包括:使用VARIAN?VAC ELUT SPS24固相萃取裝置，將HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水進行洗脫活化。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)包括:以待測人體血漿肌苷濃度(X，ug/ml)為橫坐標，以待測人體血漿肌苷色譜峰面積(As)與內(nèi)標色譜峰面積(Ai )的比值(Y=As/Ai )為縱坐標，進行線性回歸運算，求得人體血漿肌苷LC/MS/MS測定的標準曲線及定量下限。
[0041]本發(fā)明的第二方面是提供了一種測定人體血漿中肌苷含量的方法，它包括如下步驟:
[0042](a)在待測人體血漿250ul中加入0.lug/ml拉米夫定標準液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，渦流混合，得混合溶液；將所述混合溶液加入經(jīng)活化的HLB固相萃取柱中進行洗脫，棄洗脫液，再用Iml流動相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脫，收集洗脫液，離心，取上清液；
[0043](b)將經(jīng)步驟(a)制得的上清液在下述條件下進行LC/MS/MS分析
[0044]質譜條件:
[0045]Compound (化合物參數(shù)):
[0046]肌昔母子離子對:269.1/137.1, time:400msec
[0047]拉米夫定母子離子對:230.2/112.2, time:200msec
[0048]Duration:4min
[0049]Cycles:393[0050]DP=26
[0051]CE=15
[0052]CXP=4
[0053]CEP=4
[0054]Qlresolution:Unit
[0055]Q2resolution:Unit,
[0056]Source/Gas (離子源 / 氣參數(shù)):
[0057]1n Source:Turbo Spray
[0058]Curtain Gas (CUR):10
[0059]Collision Gas (CAD):Medium
[0060]1n Spray Voltage (IS):5000
[0061]Temperature (TEM):700
[0062]1n Source Gasl (Gasl):60
[0063]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0064]Interface Heater (ihe):0N,
[0065]液相色譜條件:
[0066]色譜柱:ffatersXBridge? C18，規(guī)格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0067]流動相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0068]流速:0.2ml/min
[0069]進樣量:IOul
[0070]進樣時間:4min ；
[0071](c)基于步驟(b)的分析結果，用所述的建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定標準曲線及定量下限的方法建立當日的標準曲線及定量下限進行計算，得到待測人體血漿中的肌
苷含量。
[0072]在一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中還包括將所述混合溶液_70°C凍存的步驟。
[0073]在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)活化的HLB固相萃取柱的活化步驟包括:使用VARIAN?VAC ELUT SPS24固相萃取裝置，將HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水進行洗脫活化。
[0074]本發(fā)明各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【具體實施方式】
[0075]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例、或份數(shù)按
重量計。
[0076]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0077]本發(fā)明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0078]實施例1:建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定的標準曲線及定量下限
[0079]一、儀器與試藥
[0080]1.儀器:
[0081]I)液質聯(lián)用儀:AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM(SER.No:AF22091001)，ABSCIEX公司
[0082]2)固相萃取裝置:VARIAN? VAC ELUT SPS24，WATERS 公司
[0083]3)離心機:BECKMAN Avanti?30 Centrifuge (SER.No:GEY95G02)，美國 BECKMAN公司
[0084]4)電子天平:Mettler — AE240雙量程分析天平，Mettler公司
[0085]5)漩渦混合器:XW_80，上海醫(yī)科大學儀器廠
[0086]2.試藥、試劑及耗材:
[0087]I)空白血漿(O型Rh陽性，上海市血液中心，批號:20130100000031825)
[0088]2)肌苷標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:140669-201104)
[0089]3)拉米夫定(葛蘭素史克，批號:12040022)
[0090]4)甲醇(色譜純，Tedia公司，批號:1205441)
[0091]5)氨水(江蘇昆山金城實際有限公司，批號:040608)
[0092]6)磷酸(色譜純，Tedia公司，批號:101026)
[0093]7)乙酸(蘇州振亞化工廠，批號:010517)
[0094]8)重蒸水(仁濟醫(yī)院自制)
[0095]9)色譜柱(Waters XBridge? C18,規(guī)格:3.5um, 2.1 X 100mm), WATERS 公司
[0096]10)HLB 固相萃取柱:0ASIS? HLB Cartridge (Part N0.WAT094225)，WATERS 公司
[0097]二、HLB固相萃取柱的活化
[0098]使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取裝置，將HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水進行洗脫活化，備用。
[0099]三、將空白血漿置于常溫水浴5分鐘，分別取出250ul放于6個不同的試管中，每個試管分別加入肌苷標準液25ul，依次配成相當于肌苷血漿濃度為18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和 594.5ug/ml 的樣品，并加入 0.lug/ml 拉米夫定標準液25ul，渦旋30秒，再加入4.25%磷酸溶液250ul并渦旋30秒。將6管混合液分別加入之前已完成活化的HLB小柱中，洗脫，洗脫液棄之，再用Iml流動相溶液(50mMCH3COONH2 = CH3OH=1:1)洗脫，此時收集洗脫液。將收集液在4°C下20000rpm高速離心10分鐘，取上清液，樣品即得。
[0100]以下述質譜、色譜條件進行LC/MS/MS分析
[0101]質譜條件:
[0102]Compound (化合物參數(shù)):[0103]肌苷母子離子對:269.1/137.1，time:400msec
[0104]拉米夫定母子離子對:230.2/112.2，time:200msec
[0105]Duration:4min
[0106]Cycles:393
[0107]DP=26
[0108]CE=15
[0109]CXP=4
[0110]CEP=4
[0111]Qlresolution:Unit
[0112]Q2resolution:Unit,
[0113]Source/Gas (離子源 / 氣參數(shù)):
[0114]1n Source:Turbo Spray
[0115]Curtain Gas (CUR):10
[0116]Collision Gas (CAD):Medium
[0117]1n Spray Voltage (IS):5000
[0118]Temperature (TEM):700
[0119]1n Source Gasl (Gasl):60
[0120]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0121]Interface Heater (ihe):0N,
[0122]液相色譜條件:
[0123]色譜柱:ffatersXBridge? C18，規(guī)格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0124]流動相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0125]流速:0.2ml/min
[0126]進樣量:IOul
[0127]進樣時間:4min ；
[0128]基于LC/MS/MS分析結果，建立肌苷的標準曲線，即分別以待測物肌苷的濃度(X，ug/ml)為橫坐標，以待測物肌苷的色譜峰面積(As)與內(nèi)標拉米夫定色譜峰面積(Ai)的比值(Y=As/Ai)為縱坐標，進行線性回歸運算，求得標準曲線Y=0.0480X-0.0649。肌苷在18.58?594.5ug/ml范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9998)。肌苷的定量下限為18.58ug/ml。
[0129]實施例2:測定人體血漿中的肌苷含量
[0130]一、儀器與試藥
[0131]1.儀器:
[0132]I)液質聯(lián)用儀:AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM (SER.No: AF22091001)，ABSCIEX公司
[0133]2)固相萃取裝置:VARIAN? VAC ELUT SPS24，WATERS 公司
[0134]3)離心機:BECKMAN Avanti?30Centrifuge (SER.No:GEY95G02)，美國 BECKMAN 公司
[0135]4)電子天平:Mettler — AE240雙量程分析天平，Mettler公司[0136]5)漩渦混合器:XW_80，上海醫(yī)科大學儀器廠
[0137]2.試藥、試劑及耗材:
[0138]I)空白血漿(O型Rh陽性，上海市血液中心，批號:20130100000031825)
[0139]2)肌苷標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:140669-201104)
[0140]3)拉米夫定(葛蘭素史克，批號:12040022)
[0141]4)甲醇(色譜純，Tedia公司，批號:1205441)
[0142]5)氨水(江蘇昆山金城實際有限公司，批號:040608)
[0143]6)磷酸(色譜純，Tedia公司，批號:101026)
[0144]7)乙酸(蘇州振亞化工廠，批號:010517)
[0145]8)重蒸水(仁濟醫(yī)院自制)
[0146]9)色譜柱(Waters XBridge? C18，規(guī)格:3.5um, 2.1 X 100mm), WATERS 公司
[0147]10)HLB 固相萃取柱:0ASIS? HLB Cartridge (Part N0.WAT094225)，WATERS 公司
[0148]二、收集待測人體血漿
[0149]從待測者上臂靜脈抽取新鮮血液5ml，將存有新鮮血液的試管插入碎冰中，待所有血液收集完畢，4°C、20000rpm高速離心10分鐘，取上清液，得受試者血漿。
[0150]三、待測人體血漿的預處理
[0151]取受試者血漿250ul于1.5mlEP管內(nèi)，加入0.lug/ml拉米夫定標準液25ul，渦旋30秒，再迅速加入4.25%磷酸溶液250ul，渦旋30秒，得預處理樣品。將EP管置于試管架上，放于低溫冰箱_70°C凍存。若取血現(xiàn)場沒有低溫冰箱，可將存有預處理樣品的EP管放于試管架上，緩慢放入存有適當容量液氮的泡沫容器內(nèi)(液氮的液面不宜超過EP管的高度)速凍，存放至少2min。操作過程必須做好防護措施，注意安全。(在相對密閉的操作室內(nèi)，并帶好防凍手套，緩慢放入。)待混合液完全凍干后，將EP管放于充滿干冰的泡沫容器中，迅速運至擁有低溫冰箱的實驗室中_70°C凍存，預處理樣品放于干冰的時間不宜超過I天。
[0152]將存于低溫冰箱的上述預處理的樣品取出，置于室溫下水浴溶解lOmin。待完全溶解后將混合液加入之前已完成活化的HLB小柱(同實施例1)中，洗脫，洗脫液棄之，再用Iml流動相溶液(50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1)洗脫，并收集。將收集液在4°C下20000rpm高速離心10分鐘，取上清液，即得。
[0153]四、檢測待測人體血漿中的肌苷含量
[0154]以上述質譜、色譜條件(同實施例1)進行LC/MS/MS分析，按實施例1的方法建立當日的標準曲線及定量下限進行計算，得到待測人體血漿中的肌苷含量。
[0155]實施例3:本發(fā)明的肌苷測定方法的方法學驗證
[0156]3.1.專屬性
[0157]分別取6份不同健康人的空白血漿各250ul，除不加內(nèi)標拉米夫定溶液25ul而改用甲醇水溶液25ul以外，其余按實施例2的方法操作；取一定濃度的肌苷標準液25ul替代加入空白血漿，其余按實施例2的方法操作；取受試者給藥后的血漿樣品，按實施例2的方法處理。結果表明，在選用條件下，血漿中內(nèi)源性物質不干擾被測物和內(nèi)標的測定，專屬性良好。
[0158]3.2.精密度和準確度
[0159]按實施例1的方法制備血衆(zhòng)濃度為28.5ug/ml、57ug/ml、228ug/ml的質控樣品，每個濃度進行6份樣本分析，連續(xù)測定3d，根據(jù)當日標準曲線，計算QC樣品測得的濃度。根據(jù)QC樣品結果計算本法的精密度和準確度，結果表明，日間、日內(nèi)相對標準差(RSD)〈15%，準確度均在85%?115%范圍內(nèi)。表明血漿樣品分析的精密度和準確度良好。詳見表I。
[0160]表1.肌苷測定方法的精密度與準確度(n=6)
[0161]
【權利要求】
1.一種建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定標準曲線及定量下限的方法，其特征在于，它包括如下步驟: (a)在人體空白血漿250ul中加入肌苷標準品溶液25ul，配制成至少五份不同濃度的肌苷血漿溶液，再分別加入0.lug/ml拉米夫定標準液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，渦流混合，得至少五份混合溶液；將所述混合溶液分別加入經(jīng)活化的HLB固相萃取柱中進行洗脫，棄洗脫液，再用Iml流動相溶液50mM CH3COONH2:CH3OH=1:1洗脫，收集洗脫液，離心，取上清液； (b)將經(jīng)步驟(a)制得的上清液在下述條件下進行LC/MS/MS分析 質譜條件: Compound (化合物參數(shù)): 肌音母子離子對:269.1/137.1，time:400msec 拉米夫定母子離子對:230.2/112.2，time:200msec
Duration:4min
Cycles:393
DP=26
CE=15`
CXP=4
CEP=4
Qlresolution:Unit
Q2resolution:Unit， Source/Gas (離子源/氣參數(shù)):
1n Source:Turbo Spray
Curtain Gas (CUR):10
Collision Gas (CAD):Medium
1n Spray Voltage (IS):5000
Temperature (TEM):700
1n Source Gasl (Gasl):60
1n Source Gas2 (Gas2):10
Interface Heater (ihe):0N， 液相色譜條件:
色譜柱:Waters XBridge? C18，規(guī)格:3.5um，2.1 X 100mm，Part N0.: 186003022，S/N:01453030814045
流動相:50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1
流速:0.2ml/min
進樣量:10ul
進樣時間:4min ； (c)基于步驟(b)的分析結果，建立人體血漿肌苷LC/MS/MS測定的標準曲線及定量下限。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中還包括將所述混合溶液-70°C凍存的步驟。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不同濃度的肌苷血漿溶液為六份，其濃度分別為 18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和594.5ug/ml。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)活化的HLB固相萃取柱的活化步驟包括:使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取裝置，將HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水進行洗脫活化。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)包括:以待測人體血漿肌苷濃度(X，ug/ml)為橫坐標，以待測人體血漿肌苷色譜峰面積(As)與內(nèi)標色譜峰面積(Ai )的比值(Y=As/Ai)為縱坐標，進行線性回歸運算，求得人體血漿肌苷LC/MS/MS測定的標準曲線及定量下限。
6.一種測定人體血漿中肌苷含量的方法，其特征在于，它包括如下步驟: Ca)在待測人體血漿250ul中加入0.lug/ml拉米夫定標準液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，渦流混合，得混合溶液；將所述混合溶液加入經(jīng)活化的HLB固相萃取柱中進行洗脫，棄洗脫液，再用Iml流動相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脫，收集洗脫液，離心，取上清液； (b)將經(jīng)步驟(a)制得的上清液在下述條件下進行LC/MS/MS分析 質譜條件: Compound (化合物參數(shù))·: 肌昔母子離子對:269.1/137.1, time:400msec 拉米夫定母子離子對:230.2/112.2，time:200msec
Duration:4min
Cycles:393
DP=26
CE=15
CXP=4
CEP=4
Qlresolution:Unit
Q2resolution:Unit, Source/Gas (離子源/氣參數(shù)):
1n Source:Turbo Spray
Curtain Gas (CUR):10
Collision Gas (CAD):Medium
1n Spray Voltage (IS):5000
Temperature (TEM):700
1n Source Gasl (Gasl):60
1n Source Gas2 (Gas2):10
Interface Heater (ihe):0N, 液相色譜條件:色譜柱:ffaters XBridge? C18,規(guī)格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022, S/N:01453030814045
流動相:50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1
流速:0.2ml/min
進樣量:10ul
進樣時間:4min ； (c)基于步驟(b)的分析結果，用如權利要求1所述的方法建立當日的標準曲線及定量下限進行計算，得到待測人體血漿中的肌苷含量。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中還包括將所述混合溶液-70°C凍存的步驟。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)活化的HLB固相萃取柱的活化步驟包括:使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取裝置，將HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml 水進行洗脫活化。
【文檔編號】G01N30/88GK103439442SQ201310365873
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權日:2013年8月21日
【發(fā)明者】孫黎, 金冠欽 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院