一種檢測紅色熒光蛋白種子的裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測含紅色熒光蛋白植物種子的光學(xué)系統(tǒng)，包括有散熱器1，發(fā)光套件3，燈具外殼9和分選倉10。發(fā)光套件3位于分選倉10上方部位，由一組共三顆LED燈組成，每顆LED燈珠前加裝有550nm濾波片6，濾出光波為545-555nm，再通過聚光透鏡5聚光，使形成的光斑均勻。散熱器1緊貼發(fā)光組件，維持發(fā)光套件3正常工作條件。分選倉10由觀測窗口12和操作室11組成，觀測窗口12被紅色濾色片覆蓋。本發(fā)明利用合適的光源結(jié)合濾波片，獲得一定波長的光線，激發(fā)農(nóng)作物種子中含有的特定紅色蛋白發(fā)出紅色熒光，再通過紅色濾色片過濾背景光線，分揀出含有特定紅色蛋白的植物種子。
【專利說明】—種檢測紅色熒光蛋白種子的裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到用于檢測含紅色熒光蛋白種子的方法和裝置，具體涉及一種用于檢測紅色熒光蛋白種子的LED燈具及其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠?qū)⒕哂袃?yōu)良性狀的目的基因?qū)胫参锘蚪M中，從而使植物的遺傳性狀得到改良。然而轉(zhuǎn)化過程中只有少數(shù)植物細(xì)胞能夠吸收外源DNA并整合進(jìn)植物基因組中，大多數(shù)細(xì)胞是未轉(zhuǎn)化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于篩選標(biāo)記基因，賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞以特定的選擇性標(biāo)記，以便識別和鑒定轉(zhuǎn)基因植物。
[0003]隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化，轉(zhuǎn)基因的生物安全尤其是篩選標(biāo)記的生物安全受到廣泛關(guān)注。熒光蛋白由于其具有熒光的發(fā)生不需要任何底物和輔助因子，其表達(dá)產(chǎn)物也對細(xì)胞沒有任何毒性，不會影響細(xì)胞的正常生長和功能，且利用熒光的強(qiáng)度可以分辨出轉(zhuǎn)基因植物的純合性以及雜合性等特性被視作一種安全的篩選標(biāo)記。第一個廣泛應(yīng)用的熒光蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)，GFP用于植物轉(zhuǎn)化中的篩選標(biāo)記已經(jīng)申請專利(US6486382，EP0904371B1)。但是綠色蛋白本身還是有很多缺點的，它的發(fā)射波普限制在440?529nm，激發(fā)和發(fā)射波譜太短，能夠激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)發(fā)生熒光，造成細(xì)胞內(nèi)熒光成像背景較高。
[0004]紅色熒光蛋白與綠色熒光蛋白相比，由于其激發(fā)和發(fā)射波長更長，細(xì)胞內(nèi)成像背景低，因此迅速被關(guān)注。不同野生型的紅色熒光蛋白經(jīng)過一系列分子修飾，得到各種不同發(fā)射波長的突變體，極大地豐富了熒光蛋白的光譜多樣性，為細(xì)胞內(nèi)的多色標(biāo)記提供了更多的熒光標(biāo)簽。利用紅色熒光蛋白作為轉(zhuǎn)基因植物篩選標(biāo)記的方法見中國專利“一種利用紅色熒光蛋白用做水稻轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法(201010563552.5)”。
[0005]在轉(zhuǎn)基因植物的研究和生產(chǎn)實踐過程中，經(jīng)常需要將植物種子中的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分開。對于運用紅色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物，其種子中含有紅色熒光蛋白，在特定波長的激發(fā)光下能發(fā)射出紅色熒光，根據(jù)這一特點，能夠區(qū)分轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子。
[0006]目前，在實驗室小規(guī)模實驗中通常使用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行紅色熒光蛋白檢測，熒光顯微鏡檢測準(zhǔn)確率高，除紅色熒光外還可檢測多種熒光表達(dá)，可觀察植物種子各部分熒光表達(dá)情況，但同時也存在費用高昂，使用不便，檢測通量低等缺點，不適合較大量的種子篩選和檢測。市面上現(xiàn)有一些以汞燈激發(fā)光為光源，配合合適的濾波片獲得激發(fā)光的產(chǎn)品，可以支持小規(guī)模的種子分揀，但受限于光源系統(tǒng)，這類產(chǎn)品能耗高，檢測光斑小，使用壽命短，費用較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述含紅色熒光蛋白的種子分揀問題，提供一種檢測效率更高、準(zhǔn)確率更高的檢測方法和分揀儀。[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用LED光源技術(shù)具有體積小、使用壽命長、光效高、能耗低、發(fā)光純度高的優(yōu)點，利用合適光波的LED燈具，配合濾波片，作為含紅色熒光蛋白種子的理想檢測光源。
[0009]為了獲得特定波長光源，采用三個IOW的LED燈珠直線排列，燈珠間距26mm，每顆燈珠前安裝一塊波長通過能力為550nm濾波片，濾波片厚度為6mm,面積為506mm2,使濾出的光線波長在545-555nm區(qū)間之內(nèi)。為了使光線集中而且均勻，濾波片前方裝有聚光透鏡，透鏡弧度為2.16，使光源發(fā)出的光線呈120°廣角，在操作倉中形成約300cm2的均勻光斑。
[0010]為了解決LED燈珠7的散熱問題，燈珠底部與散熱器通過導(dǎo)熱硅膠直接連接，散熱器為鋁制太陽花散盤散熱器，直徑為120_，高60_，散熱器效果為溫升< 25°C。
[0011]燈具外殼為梯形立方體,高400mm,下底面為400mm X300mm矩形,上底面為250mmX150mm矩形。燈具外殼頂部切出一個直徑為IOOmm的圓形孔，。LED光源從燈具外殼頂部的內(nèi)側(cè)安裝在圓形孔下方，散熱器部分從燈具外殼頂部的外側(cè)安裝在圓形孔上方，并利用一個圓盤形支架將其固定在燈具外殼外，LED燈珠、濾波片和聚光透鏡部分則卡在燈具外殼內(nèi)部。散熱器和LED光源通過圓形孔連接。
[0012]為了便于種子分選時的觀察，燈具外殼正面中部切出一個200mm X150mm的矩形開口作為觀測窗口，窗口上覆蓋有紅色濾色片，濾除所有的反射光線，僅保留紅色熒光蛋白被激發(fā)后發(fā)射的紅色熒光通過，從而能夠分辨含有紅色熒光蛋白的種子和不含有紅色熒光蛋白的種子。
[0013]為了使分選種子時操作者雙手可自由活動，燈具外殼下半部正面底座以上138mm部分全部切除，燈具外殼兩側(cè)面也切出138mm X150mm矩形開口，便于放入和取出植物種子以及分選操作。
[0014]本發(fā)明提供了一種利用LED光源檢測植物種子中紅色熒光蛋白的方法，篩選出的紅色熒光種子經(jīng)分子檢測，正確率達(dá)100%。因此，本發(fā)明為篩選和檢測含紅色熒光蛋白的植物種子提供了一種快速便捷的方法。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于，(I)所使用的光源為LED光源，光效高，能耗低，使用壽命長，從而降低了檢測成本；(2)利用濾波片濾除雜波，保證了激發(fā)光源的純度，降低了背景噪點；(3)采用紅色濾光片過濾背景光線，分辨出反射的紅色熒光，提高了篩選的準(zhǔn)確性。
[0016]本發(fā)明是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的:當(dāng)紅色熒光蛋白受到特定波長光源激發(fā)時，會激發(fā)出紅色熒光。LED白色光源發(fā)出的光線，通過550nm濾波片后，得到550nm黃綠光，該波長的光線可以激發(fā)紅色熒光蛋白發(fā)出紅色熒光。利用紅色濾色片遮擋反射光線，僅允許紅色熒光蛋白發(fā)出的發(fā)射光線通過，即可通過肉眼可見的紅色熒光分析篩選含有紅色熒光轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的種子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1:實施例1中光源套件及散熱器組件示意圖，其中I為散熱器，2為圓盤形支架，3為LED燈珠，4為光源支架，5為聚光透鏡，6為濾波片，7為發(fā)光光源，8為螺釘。
[0018]圖2:實施例1中LED光源發(fā)光能力與波長的曲線示意圖。
[0019]圖3:實施例1中濾波片波長通過能力曲線示意圖。
[0020]圖4:實施例1中燈具外殼俯視圖，9為燈具外殼。[0021]圖5:實施例1中燈具外殼側(cè)視圖，10為分選倉。
[0022]圖6:實施例1中燈具外殼正視圖，11為操作室，，12為觀測窗口。
[0023]圖7:實施例2中水稻種子分選示意圖，其中13為含紅色熒光蛋白的水稻種子，14為不含紅色熒光蛋白的水稻種子。
[0024]圖8:實施例2中擬南芥種子分選不意圖，其中15為含紅色突光蛋白的擬南芥種子，16為不含紅色熒光蛋白的擬南芥種子。
[0025]圖9:實施例3中水稻紅色熒光種子PCR分子檢測示意圖(M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；_:陰性對照；+:陽性對照)。
[0026]圖10:實施例3中水稻非紅色突光種子PCR分子檢測不意圖(M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)陰性對照；+:陽性對照)。
【具體實施方式】
[0027]下文結(jié)合實施例和附圖具體描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0028]實施例1:裝置構(gòu)成
[0029]圖1為光源套件及散熱器組件示意圖。光源套件3是實現(xiàn)燈具功能的主要器件，如圖1所示，主要包括光源支架4，聚光透鏡5，濾波片6，LED燈珠7，螺釘8來組裝而成。LED燈珠7選擇白色光，在本實施例中，3顆IOW的LED燈珠7組成發(fā)光光源，呈直線排列，燈珠間距為26mm，采用高精度恒流驅(qū)動，確保光源套件3在工作過程中亮度均勻一致。LED燈珠7前裝有根據(jù)紅色熒光蛋白激發(fā)光波長選擇的濾波片6，濾波片6厚度為6mm，面積為506mm2,在本實施例中，濾波片6通過波長為550nm,光線通過濾波片6后為波長區(qū)間為545-555nm。光源套件3外部為聚光`透鏡5，聚光透鏡5弧度為2.16，選用透光率大于93%的PMMA材料制作。通過聚光透鏡5對光線進(jìn)行聚光之后，光源套件發(fā)光角度為120度廣角。操作室11距發(fā)光套件3距離為400mm，聚光后的光線在操作室11上的有效光斑面積為300cm2，中心區(qū)域照度為40001UX。聚光透鏡5，濾波片6，LED燈珠7通過螺釘8被固定在了支架4上。光源套件3與散熱器I相連，散熱器I由導(dǎo)熱材料制成，例如可選用直徑為120mm，高為60mm的鋁制太陽花散熱盤，散熱效率為溫升≥25°C。
[0030]由圖2可知，由LED燈珠7發(fā)出的光線，在環(huán)境溫度為25.3Deg，環(huán)境濕度為65%的條件下進(jìn)行測試。其光譜覆蓋390nm- 740nm范圍，CIE1931色品檢測結(jié)果為:相關(guān)色溫Tc=7667K,主波長λ d=479.6nm,色純度Purity=14.0%,峰值波長λ p=440nm,色品坐標(biāo)x=0.2996，y=0.3046。光參數(shù)檢測結(jié)果為:光通量Φ=737.81m，光效為0.011m/W，輻射通量Φθ=2.487W，光量子數(shù)為1.093e+000umol/s，熒光藍(lán)光比為1.812，電流I=2A。本實施例根據(jù)紅色熒光蛋白的激發(fā)光特性選擇濾波片6。由圖3可知，該濾波片6對于波長為550nm的光線透光能力最強(qiáng)，對于波長在550nm以外的光線具有良好的阻擋效果。
[0031]圖4為本發(fā)明燈具外殼俯視圖，圖5為本發(fā)明燈具側(cè)視圖，圖6為本發(fā)明燈具外殼正視圖。燈具外殼9為梯形立方體,高400mm,下底面為400mm X300mm矩形,上底面為250mmX150mm矩形。燈具外殼9由ABS材料制作，燈具外殼頂部切出一個直徑為IOOmm的圓形孔。LED光源套件3從燈具外殼9頂部的內(nèi)側(cè)安裝，散熱器I部分從燈具外殼9頂部的外側(cè)安裝，并利用一個圓盤形支架2將其固定在燈具外殼外，LED燈珠7、濾波片6和聚光透鏡5部分則固定在燈具外殼9頂部內(nèi)側(cè)。散熱器I與光源套件3通過圓形孔連接。光源套件3位于分選倉10的頂部,分選倉10由操作室11和觀測窗口 12組成。
[0032]如圖6所示，為了便于種子分選時的觀察，燈具外殼中部切出一個200mm X150mm的矩形開口作為觀測窗口 12，窗口上覆蓋有紅色濾色片，濾除所有的反射光線，僅保留紅色熒光蛋白被激發(fā)后發(fā)射的紅色熒光通過，從而能夠分辨含有紅色熒光蛋白的種子和不含有紅色熒光蛋白的種子。為了使分選種子時操作者雙手可自由活動，燈具外殼9下半部正面底座以上138mm部分全部切除，燈具外殼兩側(cè)面也切出138mm X150mm矩形開口，形成操作室11便于放入和取出植物種子以及分選操作。
[0033]實施例2:含紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因植物種子檢測
[0034]當(dāng)光源套件3處于工作狀態(tài)時，操作室11底面出現(xiàn)一個面積約300cm2的綠色光斑，中心區(qū)域照度為40001ux。將待檢測的植物種子從燈具外殼正前方開口放入操作室11內(nèi)。在綠色光線的照射下，含有紅色熒光蛋白的植物種子發(fā)射出紅色熒光，而不含紅色熒光蛋白的植物種子則不發(fā)熒光。
[0035]通過觀測窗口 12觀察，在經(jīng)過紅色濾色片的過濾后，紅色熒光與背景光線區(qū)分開來，含紅色熒光蛋白的水稻種子13呈現(xiàn)出亮紅色，而不含紅色熒光蛋白的水稻種子14不發(fā)熒光，如圖7所示。
[0036]通過觀測窗口 12觀察，在經(jīng)過紅色濾色片的過濾后，紅色熒光與背景光線區(qū)分開來，含紅色熒光蛋白的擬南芥種子15呈現(xiàn)出亮紅色，而不含紅色熒光蛋白的擬南芥種子16不發(fā)熒光，如圖8所示。
[0037]在本實施例中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的含有紅色熒光蛋白的種子與不含紅色熒光蛋白的種子，在理論上是1:1分離的。利用本發(fā)明的裝置對于混雜的種子進(jìn)行檢測，兩種種子的分離比例與理論值相符，為1:1分離。
[0038]實施例3:篩選后種子PCR分子檢測
[0039]在實際生產(chǎn)過程中，紅色熒光種子要與非紅色熒光種子完全區(qū)分開，檢測準(zhǔn)確性需達(dá)到99.95%以上。因此，需要對本發(fā)明的檢測準(zhǔn)確性用分子生物學(xué)的方法做進(jìn)一步的驗證。以實施例2中檢測出來的紅色熒光水稻種子和非紅色熒光水稻種子作為樣本進(jìn)行PCR分子檢測，驗證本發(fā)明的準(zhǔn)確性。
[0040]取實施例2中的紅色熒光水稻種子，抽取總DNA，提取方法按按中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T674操作。以紅色熒光蛋白基因序列為模板設(shè)計引物，對紅色熒光蛋白水稻種子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物片段為526bp。擴(kuò)增程序為:94°C 5min ；94°C lmin,60°C Imin, 72°C lmin,重復(fù) 30 個循環(huán)；72°C IOmin0 正向引物序列為 5’ -GGACTTGAACTCCACCAGG-3’ ；反向引物序列為:5’ -CGAGAACGTCATCACCGAGT-3’。附圖9為部分紅色熒光水稻種子PCR擴(kuò)增結(jié)果，所有樣品均擴(kuò)增出了目的條帶，大小與陽性對照一致，說明這些紅色熒光種子中含有紅色熒光蛋白基因，檢測正確率達(dá)到100%。
[0041]取實施例2中的非紅色熒光水稻種子，抽取總DNA，提取方法按按中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T674操作。PCR分子檢測步驟同紅色熒光種子檢測，附圖10為部分非紅色熒光水稻種子PCR擴(kuò)增結(jié)果，所有樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，說明這些非紅色熒光種子中不含有紅色熒光蛋白基因，檢測正確率達(dá)到100%。
【權(quán)利要求】
1.一種種子分揀裝置，其特征在于所述裝置含有一個梯形立方體的燈具外殼9，在燈具外殼(9)的頂部有一個圓形孔，所述圓形孔中嵌有一套30W的散熱器1，在散熱器的下方連有一個LED光源套件(3)，LED光源套件(3)的下面直到燈具外殼的底部為操作倉(11 )。
2.權(quán)利要求1所述的分揀裝置，其中所述的LED光源套件(3)含有3顆10W的LED燈珠(7)，呈直線排列，燈珠間距為26 mm。
3.權(quán)利要求2所述的分揀裝置，其中所述的LED光源套件(3)的發(fā)光角度是120度廣角。
4.權(quán)利要求2所述的分揀裝置，其中所述的LED燈珠(7)下面還安裝有一塊波長通過能力為550nm的濾波片(6)。
5.權(quán)利要求4所述的分揀裝置,其中所述的濾波片(6)厚度為6mm,面積為506mm2。
6.權(quán)利要求5所述的分揀裝置，其中所述的濾波片(6)的下面還裝有一個聚光透鏡(5)。
7.權(quán)利要求6所述的分揀裝置，其中所述的聚光透鏡(5)的透鏡弧度為2.16，使光源發(fā)出的光線呈120°廣角。
8.權(quán)利要求2所述的分揀裝 置，其中所述LED燈珠(7)的底部與散熱器(I)通過導(dǎo)熱硅膠直接連接。
9.權(quán)利要求1或8所述的分揀裝置，其中所述的散熱器(I)為鋁制太陽花散盤散熱器，直徑為120 mm，高60 mm，散熱器效果為溫升≤25°C。
10.權(quán)利要求1所述的分揀裝置，其中所述的燈具外殼(9)中部切有一個200mm X 150mm的矩形開口作為觀測窗口(12),窗口上覆蓋有紅色濾色片。
【文檔編號】G01N21/64GK103558192SQ201310350128
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】李早霞, 曹春雷, 蒲鵬鵬 申請人:未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計前沿實驗室（北京）有限公司, 彩虹集團(tuán)公司