一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法。本方法基于能量轉(zhuǎn)移均相時(shí)間分辨熒光共振的高通量檢測(cè)技術(shù)，用于快速尋找化合物靶蛋白。本方法無需質(zhì)譜分析及蛋白純化檢測(cè)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合的測(cè)量，達(dá)到了與高通量篩選兼容。與傳統(tǒng)的利用親和柱的藥物蛋白靶檢測(cè)技術(shù)比較，本方法中加入藥物無需裂解細(xì)胞，不需經(jīng)過洗滌過程，從而降低傳統(tǒng)生化方法產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作相對(duì)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可用于化合物的體外蛋白靶點(diǎn)的高通量篩選，以及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界篩選疾病蛋白結(jié)合的化合物，及學(xué)術(shù)界對(duì)與待定蛋白功能結(jié)構(gòu)域的化合物篩選等。
【專利說明】一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)，特別涉及一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法。本方法基于能量轉(zhuǎn)移均相時(shí)間分辨熒光共振的高通量檢測(cè)技術(shù)，用于快速尋找化合物靶蛋白。

【背景技術(shù)】
[0002]生物信息學(xué)與制造科學(xué)相結(jié)合，是二十一世紀(jì)推動(dòng)生命科學(xué)發(fā)展的最重要?jiǎng)恿Α，F(xiàn)有技術(shù)公開了藥物祀標(biāo)(drug target)是指細(xì)胞內(nèi)與藥物相互作用，并產(chǎn)生藥物效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)特定分子。98%以上的藥物靶標(biāo)屬于蛋白質(zhì)。研究顯示，只要找到了藥物作用的靶標(biāo)分子就能根據(jù)其特點(diǎn)開發(fā)和設(shè)計(jì)藥物，以及進(jìn)行靶向治療。近年來大量分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是基因組學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及生物大分子相互作用分析技術(shù)(BIA)等推動(dòng)了從紛繁復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)生物大分子中發(fā)現(xiàn)特異性的藥物作用靶標(biāo)分子的進(jìn)程。本領(lǐng)域研究中，通過發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)進(jìn)行開發(fā)和設(shè)計(jì)特異性藥物是創(chuàng)新性藥物研發(fā)的重要途徑。據(jù)了解，目前已發(fā)現(xiàn)藥物中有接近一半并不清楚其藥靶。在中國(guó)，絕大多數(shù)的有效中藥的活性分子的藥靶也未知。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，明確藥物藥靶對(duì)明確其治療機(jī)理、發(fā)現(xiàn)其新的適應(yīng)癥有著至關(guān)重要的作用。
[0003]均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)是用于檢測(cè)均相體系中待測(cè)物的一種最常用的技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和時(shí)間分辨技術(shù)(TR)，其基本原理是，當(dāng)供體和受體相離很近時(shí)(小于10nm)，在供體和受體之間會(huì)有熒光共振能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生信號(hào)。采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)能夠顯著減小緩沖液和培養(yǎng)基的干擾，最終得到的信號(hào)跟產(chǎn)物形成的量成比例。TR-FRET技術(shù)的應(yīng)用加快了很多基于抗體的研究，包括GPCR (配體結(jié)合，受體二聚化，cAMP和IP-1的檢測(cè)，以及磷酸化ERK的定量)，激酶，細(xì)胞因子和生物標(biāo)志物，生物過程(抗體和蛋白生產(chǎn))，以及蛋白和蛋白，蛋白和多肽，蛋白和DNA/RNA相互作用的實(shí)驗(yàn)。HTRF也是基于TR-FRET的化學(xué)技術(shù)，但它的許多特點(diǎn)把它與其他TR-FRET產(chǎn)品區(qū)分開來。其中一個(gè)特點(diǎn)就是由于使用了鑭系元素，從而具有非常長(zhǎng)的半衰期(銪和鋱)，鑭系元素與絡(luò)合的穴相結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物與其他所有TR-FRET產(chǎn)品使用的螯合技術(shù)相比能增加實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，另外使用專利化的比值測(cè)量能矯正干擾因素。此外，HTRF技術(shù)還有以下優(yōu)勢(shì):均質(zhì)性(不需要洗板)、低背景、實(shí)驗(yàn)體積小型化和實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)捷化、培養(yǎng)基的干擾小、與大部分酶標(biāo)儀相兼容。
[0004]本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種為化合物的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供新型快速、準(zhǔn)確高效的高通量篩選手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法。本方法基于能量轉(zhuǎn)移均相時(shí)間分辨熒光共振的高通量檢測(cè)技術(shù)，用于快速尋找化合物靶蛋白。
[0006]本發(fā)明方法基于:將蛋白和化合物標(biāo)記后，利用HTRF技術(shù)高通量檢測(cè)其相互作用，篩選藥靶；其中，當(dāng)特定蛋白和化合物想結(jié)合，通過HTRF產(chǎn)生熒光共振信號(hào)，被高通量識(shí)別，否則無信號(hào)；本發(fā)明方法采用與HTRF熒光標(biāo)記結(jié)合的高通量篩選技術(shù)，在人類全基因表達(dá)庫(kù)的基礎(chǔ)上，能為化合物的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供新型快速、準(zhǔn)確高效的高通量篩選手段。
[0007]本發(fā)明方法主要步驟包括:(I)構(gòu)建成加蛋白標(biāo)簽的文庫(kù)(library)，即先給單個(gè)基因表達(dá)序列加上標(biāo)簽A,之后構(gòu)建全基因組的基因過表達(dá)質(zhì)粒,形成library ;(2)將目的化合物加可被識(shí)別的標(biāo)簽B ；(3)將library中的基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)高通量介質(zhì)的細(xì)胞中，用加標(biāo)簽B的化合物進(jìn)行處理，最后用HTRF進(jìn)行篩選細(xì)胞中與之結(jié)合的化合物靶蛋白。
[0008]具體的，本發(fā)明的一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法，其特征在于，其包括步驟:
(1)構(gòu)建攜帶熒光標(biāo)簽的蛋白文庫(kù)；
(2)為待檢測(cè)化合物增添可識(shí)別的標(biāo)簽；
(3)將構(gòu)建的待測(cè)化合物與蛋白文庫(kù)進(jìn)行共孵育，使化合物與文庫(kù)蛋白進(jìn)行充分的結(jié)合；
(4)利用均相時(shí)間分辨熒光共振原理(HTRF)對(duì)加標(biāo)簽化合物和文庫(kù)蛋白結(jié)合能力檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明中，將待測(cè)化合物標(biāo)記后，與人類全基因組表達(dá)的蛋白文庫(kù)進(jìn)行親和力檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明中，采用構(gòu)建的人類全基因庫(kù)，為每組基因增加熒光標(biāo)簽(例如HA-lag)，構(gòu)建全基因組的基因過表達(dá)質(zhì)粒，形成蛋白文庫(kù)；
本發(fā)明方法步驟(2)中，將根據(jù)待測(cè)試化合物的溶解性、極性和其他物理性質(zhì)，選擇與其匹配的標(biāo)志物(例如生物素)，根據(jù)標(biāo)志物的特點(diǎn)選擇孵育條件，得到攜帶可被識(shí)別標(biāo)簽的化合物；
本發(fā)明中，將構(gòu)建的待測(cè)化合物與蛋白文庫(kù)進(jìn)行共孵育，使二者得到充分的結(jié)合，為后續(xù)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移提供反應(yīng)條件；
本發(fā)明中，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行篩選，在人類全基因組蛋白文庫(kù)的基礎(chǔ)上，通過高內(nèi)涵檢測(cè)設(shè)備的篩選，從而得到待測(cè)化合物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。
[0011]更優(yōu)選的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(1)應(yīng)用組建的攜帶特定蛋白標(biāo)簽的人類全基因庫(kù)，在DNA組的XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)之間插入HA標(biāo)簽，構(gòu)建pcDNA/HA融合的表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶分別消化純化后的克隆產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA/HA，用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，并挑選有氨芐青霉素抗性的中等大小的白色菌落在含Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中搖動(dòng)過夜，抽提質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及基因測(cè)序鑒定，進(jìn)行表達(dá)得到人類全基因表達(dá)攜帶HA標(biāo)簽的蛋白；
(2)化合物進(jìn)行生物素標(biāo)記，聯(lián)合銪聯(lián)穴狀化合物EuK，檢測(cè)其與XL-665標(biāo)記抗HA抗體的蛋白的親和力，其原理是采用的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)是基于兩個(gè)熒光化合物EuK和XL-665之間的能量共振轉(zhuǎn)移原理，如果化合物與蛋白之間存在結(jié)合，那么在反應(yīng)過程中，標(biāo)記XL-665的蛋白與結(jié)合了 EuK并被生物素標(biāo)記的化合物結(jié)合，使兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離小于1nm ;銪聯(lián)穴狀化合物EuK作為能量供給基團(tuán)在受到入射光340nm的激發(fā)后以能量共振的方式把能量轉(zhuǎn)移給能量接受基團(tuán)異藻藍(lán)蛋白XL-665，后者接受能量后發(fā)射出的長(zhǎng)壽命突光670nm,可作為檢測(cè)信號(hào)，而未結(jié)合的XL-665發(fā)射的短壽命突光可通過延遲檢測(cè)時(shí)間來排除對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾；另一方面，游離的EuK在入射光340nm的激發(fā)下發(fā)射612 nm的長(zhǎng)壽命熒光，此信號(hào)作為背景信號(hào)；
(3)在96或384孔板中，利用點(diǎn)樣機(jī)分別加入上述反應(yīng)體系，37°C孵育24h后，在Thermo Fisher的高內(nèi)涵掃描儀上進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，反應(yīng)結(jié)果能直接顯示出化合物與何種蛋白的親和力最強(qiáng)，為藥物的靶點(diǎn)篩選提供技術(shù)支持。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1，采用現(xiàn)有技術(shù)的已經(jīng)構(gòu)建的人類全基因組的蛋白表達(dá)庫(kù)，能為已上市藥物或新型先導(dǎo)化合物的靶點(diǎn)篩選和藥效確認(rèn)提供真正意義上的高通量篩選；
2，高內(nèi)涵技術(shù)是高通量篩選中意義重大前景廣泛的技術(shù)，設(shè)備和操作雖然相對(duì)復(fù)雜，但結(jié)果可靠，工作效率高；
3，HTRF均相時(shí)間分辨熒光免疫分析方法具有簡(jiǎn)潔高效的特點(diǎn)，未來將有可能取代ELISA等技術(shù)，成為新的檢測(cè)手段。
[0013]本發(fā)明提供了無需質(zhì)譜分析及蛋白純化的檢測(cè)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)量的新方法，并達(dá)到了與高通量篩選兼容。與傳統(tǒng)的利用親和柱的藥物蛋白靶檢測(cè)技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于其加入藥物時(shí)無需裂解細(xì)胞，也不需要經(jīng)過洗滌的過程，從而降低傳統(tǒng)生化方法產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本發(fā)明方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作相對(duì)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可用于化合物的體外蛋白靶點(diǎn)的高通量篩選，以及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界篩選疾病蛋白結(jié)合的化合物，以及學(xué)術(shù)界對(duì)與待定蛋白功能結(jié)構(gòu)域的化合物篩選等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是采用本發(fā)明方法高通量分析生物素分子偶聯(lián)的目標(biāo)蛋白的示意圖，
結(jié)果顯示，只有既被生物素標(biāo)記，又能被目標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合的蛋白，才會(huì)產(chǎn)生熒光共振信號(hào)，根據(jù)熒光共振信號(hào)可以定量反映蛋白與候選化合物的親和力。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面用具體的實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]實(shí)施例1高通量篩選PTK激酶的抑制劑活性
實(shí)驗(yàn)以96孔板為反應(yīng)底板，在每孔中一次加入20ul的HEPES緩沖液、1ul待測(cè)化合物(多種候選化合物)、1ul的蛋白激酶PTK，在37°C孵箱中孵育60min。然后依次加入20ul鏈激酶素標(biāo)記的XL-665及20ul的EuK標(biāo)記的抗磷酸化的酪氨酸激酶抗體，室溫反應(yīng)60min。最后用賽默飛的Cellomics高內(nèi)涵設(shè)備檢測(cè)熒光信號(hào)，每孔檢測(cè)16個(gè)視野，物鏡放大XlO倍，熒光參數(shù)設(shè)置如下Em=670 nm, Exl=670nm, Ex2=612nm，根據(jù)熒光強(qiáng)度自動(dòng)設(shè)置曝光時(shí)間，反應(yīng)設(shè)3復(fù)孔，設(shè)陰性對(duì)照及空白對(duì)照。96孔板掃描只需要60min即可完成，根據(jù)熒光結(jié)果可以分析待測(cè)化合物對(duì)蛋白激酶PTK的親和力。
[0017]實(shí)施例2高通量分析生物素分子偶聯(lián)的目標(biāo)蛋白
利用鏈霉親和素(Streptavidin)和生物素(B1tin)具有特異性結(jié)合的性質(zhì)，通過加入熒光基團(tuán)標(biāo)記了的鏈霉親和素和目標(biāo)蛋白抗體，利用均相時(shí)間分辨熒光共振原理(HTRF)，采用高內(nèi)涵對(duì)被標(biāo)記了的化合物與目標(biāo)蛋白進(jìn)行高通量、高精度、特異性的定量，從而準(zhǔn)確地檢測(cè)化合物對(duì)蛋白的親和力。
[0018]在384孔板中加入含有一定量被生物素標(biāo)記的蛋白樣品，加入溶解在含400 mM氟離子緩沖液中的含有熒光受體D2標(biāo)記的鏈霉親和素(Str印tavidin-D2，1.4 ng/μ I)和鋱穴狀化合物(Terbium Cryptate)標(biāo)記的目標(biāo)蛋白特異性抗體(2B7_Tb, 0.023 ng/ μ I),孵育I?2小時(shí)候后在高內(nèi)涵儀器上檢測(cè)熒光共振信號(hào)，結(jié)果顯示，只有既被生物素標(biāo)記，又能被目標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合的蛋白，才會(huì)產(chǎn)生熒光共振信號(hào)(如圖1所示)，根據(jù)熒光共振信號(hào)可以定量反映蛋白與候選化合物的親和力。
[0019]實(shí)施案例3抗肝癌活性的化合物高通量篩選
在聯(lián)合藥品庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)多種潛在的抗肝癌藥物和其他先導(dǎo)化合物進(jìn)行活性研究；將初步篩選出的化合物進(jìn)行濃度稀釋或配置，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)化合物的濃度進(jìn)行調(diào)整；目的蛋白通過基因克隆技術(shù)制備，增加HA標(biāo)簽,通過構(gòu)建攜帶pcDNA的質(zhì)粒,按Invitrogen公司Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書配制轉(zhuǎn)染試劑/DNA混合液，按每孔4ul的Lipofeetamine2000試劑、2ul重組質(zhì)粒及0.2 ml無血清培養(yǎng)基Opt1-MEM配制,混勻后加入12孔板中，置37°C、5% C02孵箱中培養(yǎng)48h，對(duì)獲得的目的蛋白進(jìn)行純化，按照Cisb1B1assay公司的HTRF試劑盒說明書，對(duì)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，在384孔板中，用自動(dòng)加樣器將以配置的生物素標(biāo)記的化合物和目的蛋白依次加入，37 V孵育24h后，在高內(nèi)涵設(shè)備上檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)熒光強(qiáng)度反應(yīng)，獲得候選化合物對(duì)目的蛋白的結(jié)合作用。
【權(quán)利要求】
1.一種高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法，其特征在于，其包括步驟: 構(gòu)建攜帶熒光標(biāo)簽的蛋白文庫(kù)； 為待檢測(cè)化合物增添可識(shí)別的標(biāo)簽； 將構(gòu)建的步驟(2)待測(cè)化合物與步驟(I)的蛋白文庫(kù)進(jìn)行共孵育，使所述的化合物與文庫(kù)蛋白充分的結(jié)合； (4)利用均相時(shí)間分辨熒光共振原理(HTRF)檢測(cè)加標(biāo)簽化合物和文庫(kù)蛋白的結(jié)合能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量檢測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白的方法，其特征在于，將待測(cè)化合物標(biāo)記后，與人類全基因組表達(dá)的蛋白文庫(kù)進(jìn)行親和力檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，運(yùn)用構(gòu)建的人類全基因庫(kù)，為每組基因增加突光標(biāo)簽，構(gòu)建全基因組的基因過表達(dá)質(zhì)粒，形成蛋白文庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的熒光標(biāo)簽是HA-lag。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，根據(jù)待測(cè)試化合物的溶解性、極性和其他物理性質(zhì)，選擇與其匹配的標(biāo)志物(例如生物素)，根據(jù)標(biāo)志物的特點(diǎn)選擇孵育條件，獲得攜帶可被識(shí)別標(biāo)簽的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:選擇與待測(cè)試化合物匹配的標(biāo)志物是生物素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中將構(gòu)建的待測(cè)化合物與蛋白文庫(kù)進(jìn)行共孵育，使二者得到充分的結(jié)合，為后續(xù)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移提供反應(yīng)條件。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行篩選后，得到待測(cè)化合物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104280366SQ201310276185
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月3日
【發(fā)明者】魯伯塤, 胡朝陽(yáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)