專利名稱：基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飼料中三聚氰胺的檢測方法，尤其涉及一種基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)簡稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，俗稱蜜胺，蛋白精，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺一甲醛樹脂，用于木材加工、塑料等行業(yè)，因?yàn)槊總€(gè)三聚氰胺分子中含有6個(gè)氮原子，在原有的粗蛋白含量的凱氏定氮法中，是通過氮的含量來確定蛋白質(zhì)的含量，這就給不法分子帶來了可乘之機(jī)，通過添加含氮量高的廉價(jià)工業(yè)原料來提高其氮的含量，造成蛋白含量虛假增高。2007年3月，美國發(fā)生多起貓、狗寵物中毒死亡事件。美國食品藥品管理局調(diào)查發(fā)現(xiàn)初步認(rèn)為寵物食品中含有的三聚氰胺是導(dǎo)致貓、狗中毒死亡的原因。近期，三聚氰胺毒奶粉事件“卷土重來”，嚴(yán)重威脅到老百姓的生命安全。飼料安全作為食品安全的源頭，直接關(guān)系到人民群眾身體健康，是人民切身利益所在，提高飼料檢測技術(shù)水平，研發(fā)出快速便捷的分析測試技術(shù)，對(duì)保障食品安全具有重要意義。SERRSC Surface-enhanced Resonant Raman Spectroscopy,表面增強(qiáng)散射拉曼光譜)具有分析速度快，靈敏度高，檢測成本低等特點(diǎn)，它能檢測到吸附在貴金屬表面的小分子化合物，給出豐富的結(jié)構(gòu)信息。SERRS在小分子化合物如三聚氰胺、孔雀石綠方面檢測的研究已有相關(guān)報(bào)道，然而，檢測方法基本上是針對(duì)食品，如牛奶，谷物，加工食品，但對(duì)基質(zhì)復(fù)雜、種類繁多的飼料樣品，未見相關(guān)報(bào)道。在現(xiàn)有技術(shù)中，飼料中三聚氰胺的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)、液相色譜(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、近紅外(NIR)等方法。目前應(yīng)用較多的是中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-飼料中三聚氰胺的測定(NY/T1372-2007)，該標(biāo)準(zhǔn)方法利用HPLC法和GC-MS法，并以GC-MS法作為確證法，這兩種方法分析時(shí)間長，前處理繁瑣，GC-MS更需要衍生化操作，不適合現(xiàn)場快速檢測；現(xiàn)有的ELISA快速篩選法雖然較為簡便，但該法受環(huán)境條件的限制，常常出現(xiàn)“假陽性”情況，給檢測工作帶來不便；利用近紅外進(jìn)行三聚氰胺檢測受近紅外方法本身限制，不能滿足PPm級(jí)的監(jiān)管要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場、快速檢測的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，包括步驟:A、樣品前處理:采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，獲得待測飼料樣品的提取液，所述待測飼料樣品與提取溶劑的比按Ig待測飼料樣品加入5mL提取溶劑計(jì)；
采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)所述提取液進(jìn)行液液萃取凈化，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯:正丁醇體積比=6:1的混合液或乙酸乙酯；B、制備檢測試劑:向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，并加入含有Cr的鹽水溶液,渦旋混合均勻后,混合液為最后的上機(jī)檢測液；C、定性檢測:用激光能量為200mw/785nm激光源拉曼光譜對(duì)所述檢測試劑進(jìn)行光譜掃描，以707 ±4cm—1為三聚氰胺的拉曼特征吸收位移；D、定量檢測:以TSliknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化，以TOTiknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。由上述本發(fā) 明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，從待測飼料樣品中提取三聚氰胺提取液，并采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)所述提取液進(jìn)行液液萃取，利用納米粒子的對(duì)小分子化合物的增強(qiáng)作用，結(jié)合SERRS高靈敏度、快速分析的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了飼料中三聚氰胺的現(xiàn)場、快速檢測。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中飼料基質(zhì)中三聚氰胺(濃度為5μ g.g—1)特征拉曼光譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中特征吸收峰(707cm—1)強(qiáng)度隨飼料中三聚氰胺賦值濃度變化趨勢圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中飼料基質(zhì)中添加三聚氰胺濃度與特征吸收峰σΟΤ ^πΓ1)強(qiáng)度線性關(guān)系示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其較佳的具體實(shí)施方式
是:包括步驟:Α、樣品前處理:采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，獲得待測飼料樣品的提取液，所述待測飼料樣品與提取溶劑的比按Ig待測飼料樣品加入5mL提取溶劑計(jì)；采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)所述提取液進(jìn)行液液萃取凈化，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯:正丁醇體積比=6:1的混合液或乙酸乙酯；B、制備檢測試劑:向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，并加入含有Cr的鹽水溶液,渦旋混合均勻后,混合液為最后的上機(jī)檢測液；C、定性檢測:用激光能量為200mw/785nm激光源拉曼光譜對(duì)所述檢測試劑進(jìn)行光譜掃描，以707 ±4cm—1為三聚氰胺的拉曼特征吸收位移；D、定量檢測:以731 iknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化，以TOTiknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。所述步驟A包括以下任一種方法:方法一:稱取1.0g飼料，加入5mL正丁醇，渦旋震蕩提取30s，12500rpm離心lmin,移取上清液3mL,加入3mL PH=3_4的HCl水溶液,潤旋離心,移取下層液500uL,加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液和500 μ L乙酸乙酯:正丁醇體積比=6:1的混合液，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L ρΗ=3-4的HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液；方法二:稱取1.(^飼料，加入51^乙酸乙酯，渦旋震蕩提取308，12500印111離心，移取上清液3mL，加入3mLpH=3-4的HCl水溶液，渦旋離心，移取下層液500 μ L，加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液和500 μ L乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L ρΗ=3_4的HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。所述步驟B中，應(yīng)用合成納米粒子的方法合成納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液，所述納米金的粒徑為50-60nm，取所述膠體溶液300-600 μ L，加入前處理后的待測液30-50 μ L，再加入l%NaCl溶液或0.05%CaCl2溶液50-100 μ L，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液。所述步驟C中，光譜掃描時(shí)間10s，掃描次數(shù)2，平滑參數(shù)I。所述步驟D中，以對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑，以TOTiknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。本發(fā)明采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，待測飼料樣品與提取溶劑的比按Ig待測飼料樣品加入5mL提取溶劑計(jì)；并采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)提取液進(jìn)行液液萃取，利用納米粒子的對(duì)小分子化合物的增強(qiáng)作用，結(jié)合SERRS高靈敏度、快速分析的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了飼料中三聚氰胺的現(xiàn)場、快速檢測。本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，樣品前處理步驟簡單(對(duì)于飼料這一類復(fù)雜的基質(zhì)樣品，僅需簡單的液液萃取操作)，每個(gè)樣品檢測時(shí)間少于5min ;靈敏度完全能滿足目前監(jiān)管的需要(儀器檢測限0.2μ g.g_\方法檢測限2 μ g.g_1);方法回收率高(85%以上)；線性良好(R2=0.991);重復(fù)性良好(RSD ( 8%)，實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料中三聚氰胺的現(xiàn)場快速檢測。 具體實(shí)施例，包括步驟:(I)樣品前處理:方法一:準(zhǔn)確稱取1.0g飼料，加入5mL正丁醇，渦旋提取30s，12500rpm離心lmin，移取上清液3mL， 加入3mL PH=3_4的HCl水溶液，渦旋離心，移取下層液500uL，加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液，500 μ L乙酸乙酯:正丁醇混合液(V/V=6:1)，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L pH=3-4HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。方法二:準(zhǔn)確稱取1.0g飼料，加入5mL乙酸乙酯，渦旋震蕩提取30s，12500rpm離心，移取上清液3mL，加入3mLpH=3-4的HCl水溶液，渦旋離心，移取下層液500 μ L，加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液，500 μ L乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L ρΗ=3_4的HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。
(2)檢測試劑:應(yīng)用目前公開的合成納米粒子的方法合成納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液(如納米金粒徑為50-60nm)，取納米膠體溶液300-600 μ L，加入待測液30-50 μ L，加入含有Cl—的鹽水溶液(如l%NaCl溶液，0.05%CaCl2溶液)50-100 μ L，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液。(3)定性檢測:785nm激光源拉曼光譜，激光能量200mw，光譜掃描時(shí)間10s，掃描次數(shù)2，平滑參數(shù)
I。以TOTiknT1為三聚氰胺特征位移(如圖1)為判定特征峰。(4)定量檢測:以對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑。從圖2可以看出，707cm—1處的峰強(qiáng)度隨著飼料基質(zhì)中三聚氰胺賦值濃度的增大呈現(xiàn)有規(guī)律的增加。以TOTiknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度結(jié)合線性曲線(見圖3)進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果:(I)飼料基質(zhì)復(fù)雜，按照目前現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法樣品前處理步驟繁瑣，通常需要通過固相萃取柱進(jìn)行凈化處理，本發(fā)明通過簡單的液液萃取進(jìn)行凈化，效果好，回收率高(回收率85%以上)，選取PH=3-4HC1水溶液和乙酸乙酯:正丁醇混合液(V/V=6:1)或乙酸乙酯作為三聚氰胺的萃取溶劑，通過三聚氰胺在不同離子環(huán)境下的存在形式不同的原理(pH > Pka時(shí)，三聚氰胺呈分子狀態(tài)；PH < PKa時(shí)，三聚氰胺呈離子狀態(tài))，在樣品前處理階段實(shí)現(xiàn)快速凈化。(2)飼料基質(zhì)復(fù)雜，在三聚氰胺特征吸收位移TOTiknT1附近處常有干擾，特征吸收峰常常被掩蓋。本發(fā)明在選擇特異性提取溶劑與萃取溶劑的情況下，在分辨率不高(如8cm—1)的拉曼光譜儀上實(shí)現(xiàn)707CHT1與731cm—1處峰的部分分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺實(shí)現(xiàn)定性定量分析。(3)選取731CHT1作為歸一化峰的目的在于731CHT1處的吸收位移通常為基質(zhì)中存在蛋白的-NH2吸收，基本上可以認(rèn)定為本地吸收，以此作為歸一化峰有利于定量分析。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其特征在于，包括步驟: A、樣品前處理: 采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，獲得待測飼料樣品的提取液，所述待測飼料樣品與提取溶劑的比按Ig待測飼料樣品加入5mL提取溶劑計(jì)； 采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)所述提取液進(jìn)行液液萃取凈化，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為乙 酸乙酯:正丁醇體積比=6:1的混合液或乙酸乙酯； B、制備檢測試劑: 向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，并加入含有Cl—的鹽水溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液； C、定性檢測: 用激光能量為200mw/785nm激光源拉曼光譜對(duì)所述檢測試劑進(jìn)行光譜掃描，以707 ±4cm—1為三聚氰胺的拉曼特征吸收位移； D、定量檢測: 以731 土 4cm—1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化，以707 土 4cm—1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其特征在于，所述步驟A包括以下任一種方法: 方法一:稱取1.0g飼料,加入5mL正丁醇，潤旋震蕩提取30s, 12500rpm離心lmin,移取上清液3mL，加入3mL PH=3_4的HCl水溶液，渦旋離心，移取下層液500uL，加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液和500 μ L乙酸乙酯:正丁醇體積比=6:1的混合液，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L ρΗ=3-4的HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液； 方法二:稱取1.(^飼料，加入51!^乙酸乙酯，渦旋震蕩提取30s，12500rpm離心，移取上清液3mL，加入3mLpH=3-4的HCl水溶液，渦旋離心，移取下層液500 μ L，加入10 μ LlM濃度的NaOH溶液和500 μ L乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入500 μ L ρΗ=3_4的HCl水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其特征在于，所述步驟B中，應(yīng)用合成納米粒子的方法合成納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液，所述納米金的粒徑為50-60nm，取所述膠體溶液300-600 μ L，加入前處理后的待測液30-50 μ L，再加入l%NaCl溶液或0.05%CaCl2溶液50-100 μ L，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其特征在于，所述步驟C中，光譜掃描時(shí)間10s，掃描次數(shù)2，平滑參數(shù)I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，其特征在于，所述步驟D中，以對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑，以TOTiknT1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于表面增強(qiáng)散射拉曼光譜飼料中三聚氰胺的速測方法，首先采用正丁醇或乙酸乙酯為提取溶劑，并采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對(duì)提取液進(jìn)行液液萃取凈化；然后向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入凈化后的待測液和含有Cl-的鹽水溶液，混合液為最后上機(jī)檢測液；用785nm激光源拉曼光譜對(duì)檢測試劑進(jìn)行光譜掃描，以707±4cm-1為三聚氰胺的定性特征峰位移；以731±4cm-1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化，以707±4cm-1對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行三聚氰胺含量計(jì)算。實(shí)現(xiàn)了飼料中三聚氰胺的現(xiàn)場、快速檢測。
文檔編號(hào)G01N1/34GK103196890SQ20131014655
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者程劼, 王石, 蘇曉鷗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所