專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜分析嬰兒乳粉中唾液酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析嬰兒乳粉中唾液酸的方法，特別涉及一種利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜分析嬰兒乳粉中唾液酸的方法，屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
唾液酸，是指一系列含九個(gè)碳原子的羧基化單糖?；苌锏慕y(tǒng)稱(chēng)，其系統(tǒng)命名為5-氨基-3，5- 二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。它在人乳和嬰兒配方乳中，分別以游離、低聚糖結(jié)合和蛋白結(jié)合形式存在，人乳低聚糖結(jié)合唾液酸約占73%，嬰兒配方乳蛋白結(jié)合唾液酸約占70%,主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac),所以常把N-乙酰神經(jīng)氨酸稱(chēng)為唾液酸，牛乳和嬰兒配方乳中唾液酸含量都很低。最新報(bào)道證明唾液酸也是一種天然的大腦營(yíng)養(yǎng)素，能促進(jìn)嬰幼兒的記憶力和智力發(fā)育，以其在母乳中的高含量而受到廣泛的關(guān)注，但在牛奶和嬰兒配方乳粉中的含量卻很低。這也預(yù)示著在嬰幼兒配方乳粉中，特別是針對(duì)早產(chǎn)兒的嬰幼兒配方乳粉中添加唾液酸可以有效地促進(jìn)他們的神經(jīng)系統(tǒng)和大腦的發(fā)育，同時(shí)進(jìn)一步提高其在生長(zhǎng)早期的智力發(fā)育水平。用于唾液酸分析的方法很多，酶反應(yīng)、抗體、凝集素以及病毒已經(jīng)用于確定總唾液酸含量或檢測(cè)特定類(lèi)型的唾液酸；苔黑酚、間苯二酚、定期/硫代巴比妥酸比色法，分光光度法多年來(lái)也已廣泛應(yīng)用于唾液酸的檢測(cè)。這些方法的共同局限是他們無(wú)法區(qū)分唾液酸的類(lèi)型并且要求樣品凈化。而比色法和色譜光度測(cè)量法等傳統(tǒng)方法則是用離子交換柱純化酸水解樣品后的唾液酸，這種方法樣品中唾液酸損失較大，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。食品中唾液酸的檢測(cè)方法，文獻(xiàn)報(bào)道有高效液相色譜法(HPLC)，但其前處理繁瑣，需要求對(duì)唾液酸進(jìn)行衍生化后在測(cè)定，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，并且靈敏度和準(zhǔn)確度還不是很理想。由于唾液酸在國(guó)內(nèi)食品中應(yīng)用的比較少，且乳中自身存在的基質(zhì)，如蛋白質(zhì)，維生素，鈣，鉀，鎂等礦物質(zhì)會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成影響，因此關(guān)于對(duì)其檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)還不是很成熟。因此，研究一種高效快速的檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中唾液酸含量的方法，針對(duì)較低含量樣品做進(jìn)一步的優(yōu)化處理，在其配方乳粉中提高唾液酸的含量，使其更接近母乳，從而更好的促進(jìn)嬰幼兒大腦的健康發(fā)育，滿足嬰幼兒成長(zhǎng)的生理營(yíng)養(yǎng)需要成為一種迫切的需要。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)已有嬰兒配方乳添加唾液酸，使其更接近人乳成分。隨著添加唾液酸食品的增加，食品質(zhì)量監(jiān)督部門(mén)與生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制需要也不斷增多，勢(shì)必要求更加準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法。隨著色譜柱填料技術(shù)的發(fā)展，基于1.7μπι小顆粒技術(shù)的超高效液相色譜(UPLC)比傳統(tǒng)的HPLC具有更高的分離能力，質(zhì)譜聯(lián)用能夠進(jìn)行分子量的精確測(cè)定。栗暉等利用液相色譜-質(zhì)譜法(栗暉、金一寶、劉紅霞、于治國(guó)等，分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008, 11(27): 193-194)對(duì)奶粉中唾液酸含量進(jìn)行了測(cè)定，以氫氧化四丁基銨水溶液_甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，三重四極桿質(zhì)譜采用負(fù)離子模式，檢出限為0.06mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。所應(yīng)用的色譜及質(zhì)譜條件如下:色譜柱:XBridgeC18 (3.5 μ m，2.1mmX 100mm)(Waters, Massachusetts, USA);流動(dòng)相:4mmol/L氫氧化四丁基銨水溶液-甲醇梯度洗脫；流速:0.2mL/min;進(jìn)樣量10 μ L;三重四極桿質(zhì)譜采用負(fù)離子模式，離子源溫度為110° C，離子源電離電壓為3kV，霧化氣流速為SOOL/tT1，離子采集方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，采集離子308.1>87.1,保留時(shí)間為6.lmin。該方法利用液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜的方法，采用多反應(yīng)負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式，流動(dòng)相選擇氫氧化四丁基銨水溶液-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)奶粉中的唾液酸實(shí)現(xiàn)了良好的分離，保留時(shí)間為6.lmin，唾液酸的最低檢出限為0.06mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。但在質(zhì)譜分離，應(yīng)用電噴霧離子源對(duì)母離子全掃描時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下母離子的豐度值并不是很高，為此結(jié)合唾液酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式我們大膽假設(shè)，完全可以應(yīng)用正離子多 反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品的母離子進(jìn)行全掃描，找到在負(fù)源和正源條件下豐度值更高的可靠質(zhì)譜條件，為提高檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度奠定基礎(chǔ)；其次在結(jié)合色譜柱選擇流動(dòng)相時(shí)，我們認(rèn)為流動(dòng)相應(yīng)該使唾液酸在色譜柱上得到很好的分離，在保留時(shí)間方面得到最佳的響應(yīng)，因此在研究流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)要棄繁從簡(jiǎn)，優(yōu)中選優(yōu)確定流動(dòng)相及其配比，進(jìn)而提高本方法的靈敏度和檢出限，為建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)做基礎(chǔ)。馮君等采用高效液相色譜法對(duì)乳中唾液酸的含量進(jìn)行了測(cè)定(馮君，李宏基，韓立強(qiáng)，李衛(wèi)華，李平，楊國(guó)宇，現(xiàn)代食品科技，2007，12:23)，利用酸水解法把乳中的唾液酸釋放出來(lái)，以鄰苯二氨鹽酸鹽(10mg/mL)為衍生化試劑，在80°C水浴鍋中衍生40min,采用Symmetry C18柱(250mmX4.6mm, 5 μ m);流動(dòng)相為1.0%的四氫呋喃水溶液(含0.2%磷酸)-乙腈(92:8);流速為1.0mL/min，柱溫為35°C ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。結(jié)果表明，唾液酸在1(Γ320μ g/mL范圍內(nèi)線性良好,N-乙酰神經(jīng)氨酸的最低檢測(cè)限為0.25 μ g/mL,平均回收率為95.7%。該方法利用常規(guī)的高效液相色譜法，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的糖類(lèi)化合物沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)，唾液酸也不例外，所以HPLC的分析需要對(duì)唾液酸進(jìn)行衍生后分離測(cè)定，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和可能的干擾因素。衍生化試劑從經(jīng)濟(jì)角度考慮相對(duì)昂貴，衍生化過(guò)程相對(duì)比較麻煩，繁瑣；同時(shí)高效液相色譜檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度有限，故研究方法應(yīng)想辦法預(yù)防前處理的繁瑣，降低實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和可能的干擾因素，進(jìn)一步確定最優(yōu)化最簡(jiǎn)單的前處理?xiàng)l件，采用合理的分離和檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)而完善嬰幼兒乳粉中唾液酸的檢測(cè)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)。該方法雖然可準(zhǔn)確測(cè)定乳中唾液酸含量，但靈敏度和準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明在原有高效液相色譜法檢測(cè)乳粉中唾液酸的基礎(chǔ)上，基于1.7 μ m小顆粒的超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)，對(duì)樣品中三種形式唾液酸進(jìn)行提取，從而建立了靈敏度更高、更快速的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)嬰幼兒配方乳中唾液酸的方法，實(shí)際檢測(cè)樣品效果明顯。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:本發(fā)明的一種利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜分析嬰幼兒乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步驟:(I)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)樣品的前處理:對(duì)樣品中三種形式唾液酸進(jìn)行提取，所述的三種形式唾液酸分別為游離唾液酸、低聚糖結(jié)合唾液酸以及蛋白結(jié)合唾液酸；
提取得到的三種形式唾液酸溶液分別采用HLB聚合物填料的固相萃取柱凈化，采用超純水作為淋洗液,氨水-甲醇混合溶液作為洗脫液；(3)將步驟(2)得到的凈化后的提取物溶液混合后，調(diào)節(jié)pH值至2.5 3，用乙腈定容，0.22 um有機(jī)濾膜過(guò)濾，用UPLC-ES1-MS/MS進(jìn)行測(cè)定；(4)質(zhì)譜分析條件的選擇及參數(shù):離子源:電噴霧離子源；掃描方式:正離子掃描；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；毛細(xì)管電壓:3.0KV ;錐孔電壓:45V ;源溫度:150°C ;脫溶劑溫度:450°C ;脫溶劑氣流量:650L/hr ;錐孔反吹氣流量:50L/hr ;碰撞氣流量:0.24mL/min ;光電倍增器電壓:650V ；(5)色譜分離條件:色譜柱及梯度洗脫:規(guī)格為50mmX2.lmm, 1.7 μ m 的 Waters ACQUITY Ultra BEHHILIC超高效液相色譜柱；柱溫:30°C;樣品室溫度:30°C;進(jìn)樣量:5μ L ;流速:0.25mL/min ；流動(dòng)相A:乙腈；流動(dòng)相B:0.1%甲酸(v/v)水溶液。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的三種形式唾液酸是按照以下方法提取:游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取:精密稱(chēng)取一定量的嬰幼兒乳粉，加入三氯乙酸溶液至完全溶解，達(dá)到沉淀蛋白的目的，取上清液，在4°C、15000r/min條件下,離心IOmin,備用;蛋白結(jié)合唾液酸的提取:在“游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取”處理后的沉淀中加入鹽酸溶液，放入80°C水浴鍋中l(wèi)h，取出后冷卻，在4°C、15000r/min條件下，離心lOmin，備用。其中，優(yōu)選的，所述的三氯乙酸溶液的濃度為20% (v/v)，所述的三氯乙酸溶液(ml)與嬰幼兒乳粉(g)的體積質(zhì)量比為1:6-10 ;所述的鹽酸溶液的濃度為0.1% (v/v)，所述的鹽酸溶液(ml)與嬰幼兒乳粉(g)的體積質(zhì)量比為1:2-5。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的HLB聚合物填料的固相萃取柱為OasisHLB固相萃取小柱中，氨水-甲醇混合液中氨水與甲醇的體積比為25:75。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中用乙腈定容至原提取物混合溶液體積的2-5倍。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中所述的脫溶劑氣為氮?dú)?，所述的碰撞氣為氬氣。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(5)中所述的梯度洗脫的洗脫程序?yàn)?起始洗脫液中流動(dòng)相A的體積百分比為90%，流動(dòng)相B的體積百分比為10%，并維持至0.2min ；0.2 0.4min,A由90%降至12%，B由10%升為88%，并維持至1.8min ；1.8 2.2min, A由12%升為90%，B由88%降至10%ο實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)添加平均回收率為84.3% 98.9%，唾液酸的最低檢出限是0.0l μ g/mL，可知本發(fā)明建立的方法具有更高的回收率和靈敏度。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1、建立了更加快速，靈敏度和準(zhǔn)確度更高的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒乳粉中的唾液酸的方法；2、采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，負(fù)離子掃描方式，確定質(zhì)譜條件，進(jìn)而提高方法的準(zhǔn)確性；3、在色譜分離時(shí),通過(guò)對(duì)色譜柱的分析選取,確定采用BEH HILIC (50mmX 2.lmm, 1.7 μ m)色譜柱，選取0.1%的甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，確保唾液酸的色譜柱上的成功保留，為進(jìn)一步分析其含量奠定基礎(chǔ)。本產(chǎn)品主要技術(shù)性能指標(biāo):1、唾液酸在0.05 5.0 μ g/mL范圍內(nèi)與唾液酸峰面積的線性關(guān)系良好；2、唾液酸的平均回收率在84.3% 98.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9% 8.2% ；3、唾液酸的最低檢測(cè)限為0.01 μ g/mL。


圖1為典型1.0 μ g/mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖；圖2為空白奶粉樣品的MRM色譜圖；圖3為加標(biāo)奶粉樣品的MRM色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1嬰幼兒乳粉中唾液酸含量的測(cè)定方法:1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確移取適量唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，依次稀釋得到濃度為0.05,0.1,0.2,0.5、1.0和5.0 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。根據(jù)唾液酸的定量離子測(cè)定的峰面積(Y)與唾液酸的質(zhì)量濃度(X，μ g/mL)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，唾液酸的線性回歸方程為:Y=8514.5Χ — 811.09，R2=0.9989其中Y為測(cè)定的色譜峰峰面積，X為唾液酸的質(zhì)量濃度(μ g/mL)，得知此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。2、樣品的前處理取3份不同品牌的嬰幼兒配方乳粉樣品Al、B2、C3各1.0g，分別按照以下方法進(jìn)行三種形式唾液酸的提取，每個(gè)樣品3次平行分析，上機(jī)進(jìn)行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，以基質(zhì)匹配曲線進(jìn)
行定量。2.1游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取精密稱(chēng)取1.0g嬰幼兒配方乳粉，加入8mL、20%的三氯乙酸溶液至完全溶解，達(dá)到沉淀蛋白的目的，取上清液裝入4個(gè)2mL的離心管中，在4°C、15000r/min條件下，離心IOmin,合并上清液備用。2.2蛋白結(jié)合唾液酸的提取在“游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取”處理后的沉淀中加入2mL、0.1% (v/v)的鹽酸溶液，放入80°C水浴鍋中l(wèi)h，取出后冷卻，在4°C、15000r/min條件下，離心lOmin。2.3樣品上清液的凈化將離心得到的樣品溶液加載到Oasis HLB固相萃取小柱(北京振翔公司，3mL/60mg)中，實(shí)驗(yàn)采用超純水作為淋洗液，氨水-甲醇(體積比25:75)溶液作為洗脫液，其中4mL淋洗液和3mL洗脫液即可滿足凈化要求。2.4最后把凈化后的兩部分提取物溶液混合后，調(diào)節(jié)pH值至2.5 3左右，用乙腈定容至20mL容量瓶中，用0.22 μ m有機(jī)濾膜過(guò)濾，用UPLC-ES1-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。3、質(zhì)譜分析條件的選擇及參數(shù)離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子(ESI+)掃描；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(MRM);毛細(xì)管電壓:3.0KV ;錐孔電壓:45V ;源溫度:150°C ;脫溶劑溫度:450°C ；脫溶劑氣(氮?dú)?流量:650L/hr ;錐孔反吹氣流量:50L/hr ;碰撞氣(氬氣)流量:0.24mL/min ;光電倍增器電壓:650V ；4、超高效液相色譜條件色譜柱:Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC超高效液相色譜柱(美國(guó)Waters公司)(50mmX2.lmm, 1.7ym);柱溫:30°C ;樣品室溫度:30°C ;進(jìn)樣量:5 μ L ;流速:0.25mL/min ;流動(dòng)相A:乙腈；流動(dòng)相B:0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序:起始比例A為90%，B為10%,并維持至0.2min ；0.2 0.4min，A由90%降至12%, B由10%升為88%,并維持至1.8min ；
1.8 2.2min, A 由 12% 升為 90%, B 由 88% 降至 10%。結(jié)果:實(shí)際樣品的確證分析:取3份不同品牌的嬰幼兒配方乳粉樣品Al、B2、C3各1.0g，按照建立的方法處理后，每個(gè)樣品3次平行分析，上機(jī)進(jìn)行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，以基質(zhì)匹配曲線進(jìn)行定量，得到3份不同樣品的唾液酸的含量分別為107.7μ g/g、72.9μ g/g和55.8μ g/g。與現(xiàn)行的方法(黃華軍，奚星林等奶粉中唾液酸的測(cè)定方法.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006, 25 (4): 129 131 ;陳海嬌，王萍等高效液相色譜法測(cè)定母乳中唾液酸含量.食品科學(xué)，2011，32(16): 1002 1008)測(cè)定結(jié)果作比較，得知驗(yàn)證該方法的樣品含量在合理的范圍內(nèi)。試驗(yàn)例I質(zhì)譜分析條件的選擇及參數(shù)的優(yōu)化取唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為0.5 μ g/mL)在ESI負(fù)源與正源條件下對(duì)母離子進(jìn)行全掃描。得到不同離子源下唾液酸的母離子棒狀圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:唾液酸在ESI正源條件下母離子棒狀圖的豐度遠(yuǎn)比負(fù)源的高，因此們選用了 ESI正源來(lái)做電離源。在正源模式下對(duì)唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為0.5 μ g/mL)進(jìn)行母離子全掃描，確定各種唾液酸的準(zhǔn)分子離子并分別優(yōu)化錐孔電壓(cone voltage, CV),確定最終的錐孔電壓為45V ;然后以其準(zhǔn)分子離子為母離子，母離子為310.1，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇碎片離子中豐度較高的兩個(gè)離子作為定性、定量特征離子，子離子為274.1和292.1，其中274.1為定量離子。唾液酸定性和定量離子流色譜圖見(jiàn)圖1。最后以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各種質(zhì)譜調(diào)諧參數(shù)，最大程度的提高了檢測(cè)靈敏度，結(jié)果見(jiàn)表I。表I唾液酸的色譜-質(zhì)譜參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜分析嬰幼兒乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步驟: (O繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)樣品的前處理:對(duì)樣品中三種形式唾液酸進(jìn)行提取，所述的三種形式唾液酸分別為游離唾液酸、低聚糖結(jié)合唾液酸以及蛋白結(jié)合唾液酸； 提取得到的三種形式唾液酸溶液分別采用HLB聚合物填料的固相萃取柱凈化，采用超純水作為淋洗液，氨水-甲醇混合溶液作為洗脫液； (3)將步驟(2)得到的凈化后的提取物溶液混合后，調(diào)節(jié)pH值至2.5 3，用乙腈定容，0.22 μ m有機(jī)濾膜過(guò)濾，用UPLC-ES1-MS/MS進(jìn)行測(cè)定； (4)質(zhì)譜分析條件的選擇及參數(shù): 離子源:電噴霧離子源；掃描方式:正離子掃描；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；毛細(xì)管電壓:3.0KV ;錐孔電壓:45V ;源溫度:150°C ;脫溶劑溫度:450°C ;脫溶劑氣流量:650L/hr ；錐孔反吹氣流量:50L/hr ;碰撞氣流量:0.24mL/min ;光電倍增器電壓:650V ； (5)色譜分離條件: 色譜柱及梯度洗脫:規(guī)格為 50mmX2.1mm, 1.7μπι 的 Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC超高效液相色譜柱；柱溫:30°C ;樣品室溫度:30°C ;進(jìn)樣量:5μ L ;流速:0.25mL/min ;流動(dòng)相A:乙腈；流動(dòng)相B:0.1%甲酸(v/v)水溶液。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的三種形式唾液酸是按照以下方法提取: 游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取:精密稱(chēng)取一定量的嬰幼兒乳粉，加入三氯乙酸溶液至完全溶解，達(dá)到沉淀蛋白的目的，取上清液，在4°C、15000r/min條件下，離心IOmin,備用； 蛋白結(jié)合唾液酸的提取:在“游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的提取”處理后的沉淀中加入鹽酸溶液，放入80°C水浴鍋中l(wèi)h，取出后冷卻，在4°C、15000r/min條件下，離心lOmin，備用。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的三氯乙酸溶液的濃度為20%(v/V)，所述的三氯乙酸溶液與嬰幼兒乳粉的體積質(zhì)量比為1:6-10 ;所述的鹽酸溶液的濃度為0.1% (v/v)，所述的鹽酸溶液與嬰幼兒乳粉的體積質(zhì)量比為1:2-5。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的HLB聚合物填料的固相萃取柱為Oasis HLB固相萃取小柱中，氨水-甲醇混合液中氨水與甲醇的體積比為25:75。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中用乙腈定容至原提取物混合溶液體積的2-5倍。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的脫溶劑氣為氮?dú)?，所述的碰撞氣為IS氣。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中所述的梯度洗脫的洗脫程序?yàn)?起始洗脫液中流動(dòng)相A的體積百分比為90%，流動(dòng)相B的體積百分比為10%，并維持至.0.2min ；0.2 0.4min, A 由 90% 降至 12%, B 由 10% 升為 88%,并維持至 1.8min ；1.8 .2.2min,A由12%升為90%，B由88%降至10%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜分析嬰幼兒乳粉中唾液酸的方法。本發(fā)明在原有高效液相色譜法檢測(cè)乳粉中唾液酸的基礎(chǔ)上，結(jié)合超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)，對(duì)樣品中三種形式唾液酸進(jìn)行提取，從而建立了靈敏度更高、更快速的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)嬰幼兒配方乳中唾液酸的方法。采用本發(fā)明的方法唾液酸的平均回收率在84.3%～98.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～8.2%；唾液酸的最低檢測(cè)限為0.01μg/mL。該方法簡(jiǎn)單而方便操作，采用了較好的分離方式，基質(zhì)效應(yīng)較小，前處理采用了水解后高速離心的過(guò)程，簡(jiǎn)便宜于操作，有效避免了復(fù)雜樣品前處理過(guò)程中唾液酸的損失，提高了回收率。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103149312SQ201310045619
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者李春, 劉寧, 劉麗波, 解鴻蕾 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)