用于檢測(cè)核小體加合物的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和測(cè)量核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法以及此類(lèi)測(cè)量用于疾病檢測(cè)和診斷的用途。本發(fā)明還涉及鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于疾病檢測(cè)和診斷的方法和由所述方法鑒定的生物標(biāo)志。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)核小體加合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和測(cè)量核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法以及此類(lèi)測(cè)量 用于疾病檢測(cè)和診斷的用途。本發(fā)明還涉及鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于疾病檢測(cè)和診 斷的方法和由所述方法鑒定的生物標(biāo)志。
[0002] 發(fā)明背景 人體包含幾百種細(xì)胞類(lèi)型。所有這些細(xì)胞類(lèi)型均含有相同基因組，但廣泛不同的表 型和在體內(nèi)不同的功能。該表型多樣性是由于基因組在不同細(xì)胞類(lèi)型中的差異表達(dá)。差 異基因表達(dá)的控制并未完全了解，但基本機(jī)制包括由與基因相關(guān)的許多互聯(lián)表觀遺傳信號(hào) (印igenetic signals)的基因調(diào)節(jié)，包括染色質(zhì)包裝為常染色質(zhì)或異染色質(zhì)的控制、核小 體定位和核酸酶可接近位點(diǎn)的控制、DNA的甲基化和DNA在其周?chē)p繞的核小體結(jié)構(gòu)中的 變化。
[0003] 核小體是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位并且由八個(gè)高度保守的核心組蛋白的蛋白質(zhì)復(fù) 合物組成(包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各一對(duì))。在該復(fù)合物周?chē)p繞約146個(gè)堿基對(duì)的 DNA。另一種組蛋白H1或H5充當(dāng)接頭，并且涉及染色質(zhì)壓實(shí)。DNA在通常被說(shuō)成類(lèi)似"串 上的珠"的結(jié)構(gòu)中繞在連續(xù)核小體周?chē)?，并且這構(gòu)成開(kāi)放的或常染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)。在壓 實(shí)的或異染色質(zhì)中，該串是卷曲的并且超卷曲成閉合和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（Herranz和Esteller, 2007)。
[0004] 在成年人中的正常的細(xì)胞更新涉及每天通過(guò)約1011細(xì)胞的細(xì)胞分裂的產(chǎn)生和主 要通過(guò)細(xì)胞凋亡的相似數(shù)目的死亡。在細(xì)胞凋亡的過(guò)程期間，染色質(zhì)分解成由細(xì)胞釋放的 單核小體和寡核小體。在正常條件下，這些被去除并且在健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的循環(huán)核小體水 平很低。升高水平在具有多種狀況的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)，所述狀況包括多種癌癥、自身免疫疾病、 炎性狀況、中風(fēng)和心肌梗塞（Holdenrieder和Stieber，2009)。
[0005] 單核小體和寡核小體可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，并且?guī)追N方 法已得到報(bào)道（Salgame 等人，1997 ;Holdenrieder 等人，2001 ;van Nieuwenhuijze 等人， 2003)。這些測(cè)定通常采用抗組蛋白抗體(例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4)作 為捕獲抗體和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA復(fù)合抗體作為檢測(cè)抗體。然而，我們已發(fā)現(xiàn)這些測(cè) 定的結(jié)果彼此不一致。此外，盡管血清或血漿中的大多數(shù)循環(huán)DNA據(jù)報(bào)道作為單核小體和 寡核小體存在（Holdenrieder等人，2001 )，但測(cè)量的血清或血漿中的核小體和DNA水平并 不良好吻合。循環(huán)細(xì)胞游離核小體（circulating cell free nucleosomes)水平的ELISA結(jié) 果和如通過(guò)實(shí)時(shí)PCR (聚合酶鏈反應(yīng)）測(cè)量的循環(huán)DNA水平之間的相關(guān)系數(shù)據(jù)報(bào)道在血清 中是 r=0. 531，并且在血楽中是 r=0. 350 (Holdenrieder 等人，2005)。
[0006] 核小體ELISA方法用于細(xì)胞培養(yǎng)中，主要作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法（Salgame等 人，1997 ;Holdenrieder 等人，2001 ; van Nieuwenhuijze 等人，2003)，以及還用于測(cè)量血 清和血漿中的循環(huán)細(xì)胞游離核小體（Holdenrieder等人，2001)。由瀕死細(xì)胞釋放到循環(huán) 內(nèi)的細(xì)胞游離血清和血漿核小體水平已通過(guò)ELISA方法在眾多不同癌癥的研究中進(jìn)行測(cè) 量，以評(píng)估其作為潛在生物標(biāo)志的用途（Holdenrieder等人，2001)。平均循環(huán)核小體水平 據(jù)報(bào)道在研究的大多數(shù)但并非全部癌癥中很高。最高的循環(huán)核小體水平在肺癌個(gè)體中觀 察到。最低水平在前列腺癌中觀察到，其在健康個(gè)體的正常范圍內(nèi)。然而，具有惡性腫瘤 的個(gè)體據(jù)報(bào)道具有相當(dāng)不同的血清核小體濃度，并且發(fā)現(xiàn)具有晚期腫瘤疾病的一些個(gè)體具 有低循環(huán)核小體水平，在對(duì)于健康個(gè)體測(cè)量的范圍內(nèi)（Holdenrieder等人，2001)。由于這 點(diǎn)和核小體水平升高的多種非癌癥原因，循環(huán)核小體水平未在臨床上用作癌癥的生物標(biāo)志 (Holdenrieder 和 Stieber，2009)。
[0007] 核小體的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM)和通過(guò)包括變體組蛋白而改 變。組蛋白的PTM通常在八核組蛋白的尾部上發(fā)生，并且常見(jiàn)修飾包括賴(lài)氨酸殘基的乙酰 化、甲基化或泛素化以及精氨酸殘基的甲基化和絲氨酸殘基的磷酸化。組蛋白修飾已知涉 及基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)（Herranz和Esteller，2007)。核小體的結(jié)構(gòu)還可以通過(guò)包 括可選組蛋白同種型或變體而改變，所述可選組蛋白同種型或變體是不同基因或剪接產(chǎn) 物，并且具有不同的氨基酸序列。組蛋白變體可以分類(lèi)成多個(gè)家族，所述家族再分成各個(gè) 類(lèi)型。大量組蛋白變體的核苷酸序列是已知的，并且例如在下述中可公開(kāi)獲得：National Human Genome Research Institute NHGRI Histone DataBase(Marin〇-Ramirez,L. ,Levine, K. M. , Morales, M. , Zhang, S. , Moreland, R. T. , Baxevanis, A. D.和 Landsman, D. The Histone Database ：an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol. 2011.(已投稿）和 http://genome. nhgri. nih. gov/histones/ complete. shtml)、GenBank(NIH 遺傳序列）DataBase、EMBL Nucleotide Sequence Database 和 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)。
[0008] 健康和患病細(xì)胞中存在的組蛋白變體和組蛋白修飾模式在眾多（主要是免疫組織 化學(xué)）研究中已顯示是不同的（Herranz和Esteller，2007)。臨床使用的免疫組織化學(xué)方 法的一個(gè)缺點(diǎn)是組織樣品收集涉及侵入性手術(shù)或活組織檢查。
[0009] 除由核小體結(jié)構(gòu)和位置介導(dǎo)的表觀遺傳信號(hào)傳導(dǎo)之外，細(xì)胞中的基因表達(dá)控制也 由DNA的甲基化狀態(tài)介導(dǎo)（Herranz和Esteller，2007)。一段時(shí)間以來(lái)本領(lǐng)域已知DNA可 以在胞嘧啶核苷酸的第5位處甲基化，以形成5-甲基胞嘧啶。
[0010] DNA甲基化在癌癥中的涉及早在1983年得到報(bào)道（Feinberg和Vogelstein, 1983)。在癌細(xì)胞中觀察到的DNA甲基化模式不同于健康細(xì)胞的那些。特別在近著絲粒區(qū) 域周?chē)闹貜?fù)元件據(jù)報(bào)道相對(duì)于健康細(xì)胞在癌癥中是低甲基化的，但特定基因的啟動(dòng)子據(jù) 報(bào)道在癌癥中是高甲基化的。這兩種效應(yīng)的平衡據(jù)報(bào)道導(dǎo)致癌細(xì)胞中的總體DNA低甲基化 (Rodriguez-Paredes 和 Esteller，2011)。
[0011] 某些特定基因的高甲基化可以用作癌癥的診斷生物標(biāo)志。例如，報(bào)道通過(guò)從血漿 提取的DNA的PCR擴(kuò)增用于檢測(cè)S印tin 9基因的高甲基化的方法據(jù)報(bào)道檢測(cè)72%的結(jié)腸 癌，伴隨10%的假陽(yáng)性率（Grutzmann等人，2008)。特定基因或基因座的DNA甲基化狀態(tài) 通常通過(guò)胞啼陡而不是5-甲基胞啼陡至尿啼陡的選擇性亞硫酸氫鹽脫氨基（bisulphite deamination)進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致可以通過(guò)測(cè)序或其他方法檢測(cè)的一級(jí)DNA序列改變（A1 len等 人，2004)。
[0012] 總體DNA低甲基化是癌細(xì)胞的標(biāo)志（Esteller 2007和Hervouet等人，2010)?？?體DNA甲基化可以使用免疫組織化學(xué)技術(shù)在細(xì)胞中進(jìn)行研究。或者，從細(xì)胞中提取DNA用 于分析。
[0013] 多年來(lái)已知除核酸和組蛋白蛋白質(zhì)之外，染色質(zhì)包含與其組成成分DNA和/或組 蛋白結(jié)合的大量非組蛋白蛋白質(zhì)（Yoshida和Shimura, 1972)。這些染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)具有 廣泛多樣的類(lèi)型，并且具有多種功能，包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子、轉(zhuǎn)錄阻遏因子、組蛋白 修飾酶、DNA損害修復(fù)蛋白質(zhì)及許多其他功能。染色質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)的研究已在很大程度上 通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP)法進(jìn)行。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的，但卻是復(fù)雜、費(fèi)力和 昂貴的。
[0014] 在典型Chip法中，細(xì)胞染色質(zhì)是交聯(lián)的，使得所有蛋白質(zhì)和核酸組分彼此共價(jià)附 著。隨后剪切染色質(zhì)以形成單核小體和寡核小體的制劑。將針對(duì)目的蛋白質(zhì)的抗體加入剪 切的染色質(zhì)，以免疫沉淀含有蛋白質(zhì)的那些染色質(zhì)片段?？贵w通常附著至固相(例如塑料 珠)，以促進(jìn)含有目的蛋白質(zhì)的染色質(zhì)復(fù)合物的分離。隨后逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，并且通過(guò)用蛋白酶消 化去除蛋白質(zhì)。將與染色質(zhì)復(fù)合物相關(guān)的DNA分離且分析，以測(cè)定與特定蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān) 的DNA序列、基因或基因座，其使用多種技術(shù)中的任一種，包括PCR隨后凝膠電泳、DNA測(cè)序 (ChlP-Seq)或 DNA 微陣列（ChIP-〇n_chip)。
[0015] 這些Chip法揭示與染色質(zhì)結(jié)合組蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的DNA序列。Chip法的衍生方 法已得到開(kāi)發(fā)，以促進(jìn)非組蛋白蛋白質(zhì)與組蛋白和核小體的關(guān)系的研究，包括例如組蛋白 相關(guān)測(cè)定（Rieke 和 Bielinsky，2005)。
[0016] 與染色質(zhì)結(jié)合的許多蛋白質(zhì)涉及癌癥及其他疾病機(jī)制，但其在循環(huán)中以核小體加 合物形式的豐度先前未進(jìn)行研究。實(shí)例包括高速泳動(dòng)族盒蛋白（High Mobility Group Box Protein) 1 (HMGB1)、多梳蛋白（polycomb protein) Zeste 同源物 2 的增強(qiáng)子（EZH2)和核 受體族的蛋白質(zhì)。
[0017] 高速泳動(dòng)族蛋白是以約3%的DNA或組蛋白重量存在的染色質(zhì)組分。它們是與核小 體結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，對(duì)潛在DNA序列沒(méi)有任何已知特異性（Gerlitz等人；2009)。HMGB1 是構(gòu)筑染色體蛋白質(zhì)和促炎介質(zhì)。它涉及細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡和眾多疾病，包括多種炎性 和自身免疫狀況、膿毒癥、腦膜炎和神經(jīng)變性。HMGB1的過(guò)表達(dá)與癌癥的所有關(guān)鍵標(biāo)志相關(guān) (Tang等人；2010)。HMGB1緊密附著至細(xì)胞凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)。核小體-HMGB1復(fù)合物的研 究已顯示這些加合物在患有自身免疫疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的個(gè)體的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，并 且該加合物涉及其為SLE關(guān)鍵特征的抗核抗體的發(fā)展。未附著至HMGB1的核小體不引發(fā)免 疫應(yīng)答。這些加合物中HMGB1與核小體的結(jié)合通過(guò)下述加以證實(shí)：用針對(duì)DNA或組蛋白的 抗體免疫沉淀核小體，隨后為使用抗HMGB1抗體的蛋白質(zhì)印跡，以證實(shí)免疫沉淀的核小體 中 HMGB1 的存在（Urbonaviciute 等人；2008)。
[0018] HMGB蛋白質(zhì)與已知影響染色質(zhì)功能的許多其他蛋白質(zhì)相互作用，并且已顯示存在 涉及HMGB蛋白質(zhì)加上另外蛋白質(zhì)的染色質(zhì)復(fù)合物（Gerlitz等人；2009)。因此，除簡(jiǎn)單的 核小體-蛋白質(zhì)加合物之外，在染色質(zhì)中存在其中2種或多種蛋白質(zhì)與核小體結(jié)合的核小 體-蛋白質(zhì)-復(fù)合加合物（complex adduct)。
[0019] EZH2是多梳族（PcG)家族的成員，其形成涉及維持基因的轉(zhuǎn)錄阻遏狀態(tài)的多聚蛋 白質(zhì)復(fù)合物。EZH2是組蛋白修飾酶(組蛋白-賴(lài)氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶)，其甲基化核小體的組 蛋白3的賴(lài)氨酸27氨基酸殘基。該組蛋白修飾與染色質(zhì)凝聚和基因沉默相關(guān)（Cao等人； 2002)。
[0020] 核小體受體是在組蛋白或配體的控制下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子，例如雌激素受體 (ER)調(diào)節(jié)雌激素依賴(lài)性基因的表達(dá)。這些蛋白質(zhì)中的許多涉及疾病過(guò)程，例如ER涉及乳腺 癌的進(jìn)展，并且許多乳腺癌治療靶向ER和/或阻止ER與其配體雌二醇的相互作用。
[0021] 除細(xì)胞中存在的核小體-蛋白質(zhì)加合物之外，存在可以在細(xì)胞死亡后從細(xì)胞中釋 放核小體后形成的其他核小體-蛋白質(zhì)加合物。此類(lèi)核小體加合物包括其為SLE關(guān)鍵特征 的核小體-免疫球蛋白加合物。
[0022] 我們目前報(bào)道用于直接估計(jì)生物樣品中的蛋白質(zhì)-核小體加合物的簡(jiǎn)單免疫測(cè) 定方法。我們已開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)核小體結(jié)合的EZH2、HMGB1和幾種核受體的簡(jiǎn)單方法，并且顯 示此類(lèi)核小體加合物可以在血清樣品中進(jìn)行檢測(cè)，并且它們具有作為疾病中的生物標(biāo)志的 用途。
[0023] 發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標(biāo)志用于診 斷癌癥、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于檢測(cè)樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在 的方法，其包括下述步驟： (i)使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii )使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋 白質(zhì)； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于檢測(cè)樣品中的核小體加合物的存在的方法， 其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)細(xì)胞中的核小體加合物的方法，其包 括下述步驟： (i) 從細(xì)胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 根據(jù)上述第二或第三方面中所述的本發(fā)明的ELISA方法，檢測(cè)或測(cè)量核小體加 合物的存在。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)或診斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平來(lái)鑒定個(gè)體的疾病狀態(tài)。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了評(píng)估動(dòng)物或人個(gè)體對(duì)醫(yī)學(xué)治療的適合性的方 法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平作為選擇個(gè)體的合適治療的參數(shù)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于監(jiān)控動(dòng)物或人個(gè)體的治療的方法，其包括 下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物； (ii) 在一個(gè)或多個(gè)場(chǎng)合重復(fù)個(gè)體體液中的核小體加合物的檢測(cè)或測(cè)量； (iii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平中的任何改變作為個(gè)體狀況中的任何改變的參 數(shù)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于檢測(cè)或診 斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物； (ii) 檢測(cè)或測(cè)量健康個(gè)體或?qū)φ諅€(gè)體體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對(duì)照個(gè)體中檢測(cè)到的水平之間的差異，來(lái)鑒定核小體加合物是否 可用作疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了依照本文限定的方法鑒定的生物標(biāo)志。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)核小體加合物的試劑盒，其包括對(duì)于 核小體加合物或其組成部分、或DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物 特異性的配體或結(jié)合劑，連同試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0033] 附圖簡(jiǎn)述 圖1 :用于檢測(cè)稀釋到馬血清內(nèi)的從Hela細(xì)胞中提取的消化染色質(zhì)中的核小體EZH2 加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0034] 圖2 :得自5個(gè)健康個(gè)體和11個(gè)患有腫瘤的個(gè)體的血清樣品的核小體-EZH2加合 物ELISA結(jié)果。
[0035] 圖3 :用于檢測(cè)稀釋到馬血清內(nèi)的從Hela細(xì)胞中提取的消化染色質(zhì)中的核小 體-HMGB1加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0036] 圖4 :得自5個(gè)健康個(gè)體和11個(gè)患有腫瘤的個(gè)體的血清樣品的核小體-HMGB1加 合物ELISA結(jié)果。
[0037] 圖5:得自31個(gè)健康個(gè)體和74個(gè)患有（A)結(jié)腸癌、（B)乳腺癌或（C)肺癌的個(gè)體 的血清樣品的核小體-HMGB1加合物ELISA結(jié)果。
[0038] 圖6 :在通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細(xì)胞游離核小體中，用于檢 測(cè)核小體-孕酮受體加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0039] 圖7 :在2個(gè)前列腺癌病例和通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細(xì)胞游 離核小體樣品中，用于檢測(cè)核小體-雄激素受體加合物水平的ELISA結(jié)果。
[0040] 圖8 :在通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細(xì)胞游離核小體中，用于檢 測(cè)核小體-雌激素受體a (ERa )加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0041] 圖9 :用于檢測(cè)消化的MCF7染色質(zhì)中的核小體-ERi3加合物水平的ELISA結(jié)果。 該測(cè)定以?xún)煞N不同形式進(jìn)行。在第一形式中，將抗核小體抗體包被到孔上，并且使抗ER3 抗體生物素化。在第二形式中，將抗ERi3抗體包被到孔上，并且使抗核小體抗體生物素化。
[0042] 圖10 :核小體H2AZ_ER@加合物ELISA結(jié)果。
[0043] 圖11 :得12個(gè)健康個(gè)體和16個(gè)患有腫瘤的個(gè)體的血清樣品的核小體-ERP加合 物ELISA結(jié)果。
[0044] 發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標(biāo)志用于診 斷癌癥、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志用于診斷癌癥。我 們已顯不含有HMGB1和EZH2的兩種此類(lèi)加合物存在于患有癌癥的個(gè)體的循環(huán)中，但在健康 個(gè)體的循環(huán)中未檢測(cè)到。
[0045] 本領(lǐng)域眾所周知癌癥可以是激素依賴(lài)性的，并且需要激素的存在用于生長(zhǎng)。還眾 所周知核激素通過(guò)受體結(jié)合的激素復(fù)合物的核定位以及與基因組中的特定激素應(yīng)答元件 結(jié)合來(lái)起作用。與元件相關(guān)的基因的表達(dá)通過(guò)受體結(jié)合的激素復(fù)合物與基因組應(yīng)答元件的 結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了激素受體-核小體加合物和激素-激素 受體-核小體復(fù)合加合物生物標(biāo)志，用于表征個(gè)體的腫瘤狀態(tài)。這些加合物可以是血液或 另一種體液中存在的循環(huán)加合物，或可以通過(guò)來(lái)自腫瘤組織樣品的染色質(zhì)消化而產(chǎn)生。
[0046] 本領(lǐng)域眾所周知核激素受體在激素或配體的控制下調(diào)節(jié)基因表達(dá)。例如，雌激素 受體通過(guò)結(jié)合其在細(xì)胞表面膜處的底物(類(lèi)固醇激素雌激素)起作用。結(jié)合隨后為激素-受 體復(fù)合物的內(nèi)在化和核內(nèi)定位，其中受體與基因組中的特定激素應(yīng)答元件結(jié)合。雌激素受 體與之結(jié)合的特定基因序列被稱(chēng)為雌激素應(yīng)答兀件（ERE)。與ERE相關(guān)的基因的表達(dá)可以 通過(guò)受體調(diào)節(jié)，并且因此通過(guò)個(gè)體循環(huán)中的雌激素的存在或水平調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域還眾所周知 乳腺癌的生長(zhǎng)通常處于雌激素控制下，并且此類(lèi)癌癥通常被稱(chēng)為雌激素依賴(lài)性的。因?yàn)檫@ 些腫瘤過(guò)表達(dá)雌激素受體（ER)，所以它們通常被稱(chēng)為ER+腫瘤。雌激素依賴(lài)性腫瘤的生長(zhǎng) 可以通過(guò)旨在阻止雌激素與雌激素受體結(jié)合的治療干預(yù)得到減慢或阻止，并且這是乳腺癌 治療的常見(jiàn)方法。此類(lèi)治療的實(shí)例包括下述藥物：充當(dāng)雌激素依賴(lài)性乳腺癌中的雌激素拮 抗劑的他莫昔芬，和減慢或阻止雌激素產(chǎn)生的芳香酶抑制劑。然而，隨著時(shí)間過(guò)去，癌癥發(fā) 展成雌激素非依賴(lài)性腫瘤，其即使在不存在雌激素刺激的情況下也生長(zhǎng)，并且需要不同治 療。雌激素依賴(lài)性和非依賴(lài)性腫瘤的診斷目前常規(guī)通過(guò)免疫染色腫瘤活組織檢查組織進(jìn) 行，以測(cè)定腫瘤細(xì)胞中雌激素受體的豐度或其他方面。臨床醫(yī)生可能需要在腫瘤治療過(guò)程 期間反復(fù)再測(cè)試腫瘤的雌激素依賴(lài)性，以確定進(jìn)一步的雌激素依賴(lài)性治療是否適合或個(gè)體 的治療方案是否應(yīng)改變，以反映隨著疾病進(jìn)展腫瘤的改變性質(zhì)。不幸的是，目前測(cè)試是次優(yōu) 的，并且需要在進(jìn)行測(cè)試的每個(gè)場(chǎng)合的重復(fù)疼痛的活組織檢查。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，將在乳腺癌患者的循環(huán)中雌激素受體-核小體加合物的檢測(cè)用作腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中 雌激素受體與ERE結(jié)合的指標(biāo)作為腫瘤的雌激素依賴(lài)性的指標(biāo)，以幫助選擇適當(dāng)治療和預(yù) 測(cè)性預(yù)后信息。該方法具有指示腫瘤中的ERE-雌激素受體結(jié)合，而不是雌激素受體的存在 或豐度的簡(jiǎn)單指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)，并且它可以如簡(jiǎn)單血液測(cè)試所需要的一樣頻繁地重復(fù)，而無(wú)需 活組織檢查。我們已開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)和定量含有受體的ERa和ERi3形式的核小體-ER加合 物的簡(jiǎn)單ELISA方法。令人驚訝的是，這些加合物存在于癌癥患者的循環(huán)中。
[0047] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，相同原理可以應(yīng)用于檢測(cè)由腫瘤組織自身產(chǎn)生的細(xì) 胞染色質(zhì)消化物中的雌激素受體-核小體加合物。這種評(píng)價(jià)腫瘤的雌激素依賴(lài)性的方法優(yōu) 于目前方法，因?yàn)樗甘灸[瘤中的ERE-雌激素受體結(jié)合，而不是雌激素受體的存在或豐度 的簡(jiǎn)單指標(biāo)。
[0048] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將在循環(huán)中、或在另一種體液中、或在作為來(lái)自腫 瘤組織的染色質(zhì)消化物產(chǎn)生的核小體中，在雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物中的 類(lèi)固醇雌激素自身的存在的檢測(cè)，用作腫瘤的雌激素依賴(lài)性狀態(tài)的指標(biāo)。
[0049] 據(jù)報(bào)道循環(huán)核小體在子宮內(nèi)膜異位癥中是升高的（Holdenrieder等人；2001)，并 且因?yàn)樽訉m內(nèi)膜異位癥組織是雌激素響應(yīng)的，所以在子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的染色質(zhì)中雌激 素受體的結(jié)合可以導(dǎo)致在循環(huán)中的雌激素受體-核小體加合物或雌激素-雌激素受體-核 小體復(fù)合加合物。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，在體液中檢測(cè)雌激素受體-核小體加合 物或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物，作為雌激素依賴(lài)性婦科狀況(包括例如子宮 內(nèi)膜異位癥）存在的生物標(biāo)志。
[0050] 以與雌激素依賴(lài)性乳腺癌相似的方式，雄激素依賴(lài)性前列腺癌的生長(zhǎng)需要雄激素 或由雄激素加速。雄激素依賴(lài)性前列腺腫瘤類(lèi)似地通過(guò)阻止雄激素與雄激素受體(AR)結(jié) 合的方法進(jìn)行治療。雄激素依賴(lài)性前列腺腫瘤還可以發(fā)展變成雄激素非依賴(lài)性的，并且因 此對(duì)治療(包括物理閹割或通過(guò)藥物的化學(xué)閹割，以阻止雄激素與其受體結(jié)合）是抗性的。 腫瘤的雄激素依賴(lài)性狀態(tài)可以通過(guò)雄激素受體與基因組中的雄激素應(yīng)答元件（ARE)的結(jié)合 水平來(lái)確定，并且這可以通過(guò)分析個(gè)體循環(huán)或來(lái)自前列腺組織的染色質(zhì)消化物中存在的雄 激素受體-核小體加合物水平進(jìn)行確定。用于該目的的本發(fā)明實(shí)施方案包括在個(gè)體循環(huán)或 體液或者由來(lái)自個(gè)體腫瘤組織的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的核小體中，雄激素受體-核小體加合物 或雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物的檢測(cè)。我們目前已開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)和定量核小 體-AR加合物的簡(jiǎn)單ELISA方法，且證實(shí)其效用。我們還已開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)和定量核小體-孕 酮受體加合物的簡(jiǎn)單ELISA方法。其他激素依賴(lài)性疾病可以用本發(fā)明方法的相似實(shí)施方案 加以解決。此類(lèi)實(shí)施方案包括檢測(cè)其他受體-核小體加合物，包括例如糖皮質(zhì)激素受體、甲 狀腺激素受體和視黃酸受體-核小體加合物，用于檢測(cè)腫瘤包括例如涉及視黃酸受體的多 個(gè)類(lèi)型的白血病。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，上文描述的方法可以用于檢測(cè)激素-激素受體-核小 體復(fù)合加合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物包含甲狀腺素-甲 狀腺激素受體-核小體復(fù)合加合物、三碘甲狀腺原氨酸-甲狀腺激素受體-核小體復(fù)合加 合物、視黃酸-視黃酸受體-核小體復(fù)合加合物、雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物、 或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物。本發(fā)明的這個(gè)方面具有區(qū)分激素活化的加合 物以及含有野生型或正常激素受體的加合物，與例如由于在疾病進(jìn)展的過(guò)程中（例如在雌 激素非依賴(lài)性乳腺癌中）的突變而不結(jié)合其配體的激素受體的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的這個(gè)方面可 以以多種方式進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用定向結(jié)合激素自身的抗體或其他結(jié)合劑，代替 定向結(jié)合激素受體的抗體。在可替代實(shí)施方案中，激素從抗體捕獲的激素-激素受體-核 小體復(fù)合加合物中提取，并且通過(guò)建立的方法定量，所述方法例如免疫測(cè)定法、光譜法或色 譜法，包括高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜法隨后為質(zhì)譜法（LC/MS)或氣相色譜法隨后 為質(zhì)譜法（GC/MS)。例如，雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物通過(guò)定向結(jié)合加合物上 (例如在雄激素受體或核小體上)存在的表位的固定抗體捕獲。激素隨后從固相結(jié)合的加合 物提取到有機(jī)溶劑(例如二乙醚)內(nèi)。將溶劑轉(zhuǎn)移，干燥且將雄激素再溶解于測(cè)定緩沖液中， 并且測(cè)量其濃度(例如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，該實(shí)施方案將 具有用于小分子激素例如類(lèi)固醇和甲狀腺激素的特定應(yīng)用。
[0052] 本發(fā)明旨在檢測(cè)與核小體結(jié)合的蛋白質(zhì)。這可以借助于雙抗體ELISA測(cè)試完成， 其中一種抗體定向結(jié)合核小體，并且另一種定向結(jié)合與核小體結(jié)合的蛋白質(zhì)。然而，定向結(jié) 合核小體的抗體無(wú)需定向整體核小體復(fù)合物，而是可以定向核小體的蛋白質(zhì)或核酸組成部 分。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，用于結(jié)合核小體的抗體可以定向結(jié)合核小體的任何組成 部分，包括例如特定組蛋白、組蛋白修飾、組蛋白變體或同種型、或特定核苷酸或經(jīng)修飾的 核苷酸。我們已顯示這種測(cè)定設(shè)計(jì)使用定向結(jié)合組蛋白變體H2AZ的抗體作為核小體的結(jié) 合劑的實(shí)例良好工作。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，該方法具有僅選擇性結(jié)合含有加合物 中的目的蛋白質(zhì)和H2AZ的那些核小體的另外優(yōu)點(diǎn)。該設(shè)計(jì)提供用于測(cè)試加合物蛋白質(zhì)與 任何特定組蛋白、組蛋白修飾、組蛋白變體、核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或其他核小體結(jié)構(gòu)的 任何組合的測(cè)定方法。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于檢測(cè)樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在 的方法，其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋 白質(zhì)； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0054] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，待檢測(cè)的結(jié)合試劑可以選擇為針對(duì)加合蛋白質(zhì)或者 針對(duì)核小體或核小體的組成部分的抗體。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于檢測(cè)樣品中的核小體加合物的存在的方法， 其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，核小體加合物包括促炎蛋白、高速泳動(dòng)族蛋白、多梳蛋白、染 色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。在可替代實(shí)施方案中，核小體加合物包括高速泳動(dòng)族蛋白、多 梳蛋白、染色質(zhì)修飾酶、激素受體或激素。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核小體加合物包括染色 質(zhì)修飾酶、核受體或激素。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，高速泳動(dòng)族蛋白是HMGB1。在一個(gè)實(shí)施 方案中，當(dāng)生物標(biāo)志用于診斷癌癥時(shí)，核小體-蛋白質(zhì)加合物包括高速泳動(dòng)族蛋白。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，染色質(zhì)修飾酶是組蛋白乙?；?、去乙酰化、甲基化、去甲基化、 磷酸化、去磷酸化、泛素化（ubiquitination)、去泛素化、蘇素化（sumoylation)、去蘇素化 或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶酶。在可替代實(shí)施方案中，染色質(zhì)修飾酶是EZH2。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核小體-蛋白質(zhì)加合物包括核受體時(shí)，所述核受體是雌激 素受體、雄激素受體、孕酮受體、甲狀腺激素受體、糖皮質(zhì)激素受體或視黃酸受體。在可替代 實(shí)施方案中，當(dāng)核小體-蛋白質(zhì)加合物包括核受體時(shí)，所述核受體是雌激素受體、雄激素受 體或視黃酸受體。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素時(shí)，所述激素是甲狀腺激 素、糖皮質(zhì)激素或類(lèi)固醇激素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮質(zhì)類(lèi)固醇或視黃酸。在可 替代實(shí)施方案中，當(dāng)核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素時(shí)，所述激素是類(lèi)固醇激素，包括雌激 素、雄激素、皮質(zhì)類(lèi)固醇或視黃酸。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素受體時(shí)，所述激素受體是 雌激素受體、雄激素受體、孕酮受體、甲狀腺激素受體或視黃酸受體。
[0061] 我們已顯示該方法可以使用與定向結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)的抗體組合的針 對(duì)核小體自身的抗體進(jìn)行，或使用再次與定向結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)的抗體組合的針 對(duì)核小體組分的抗體進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，核小體或核小體組分抗體或結(jié)合劑定向結(jié) 合特定表觀遺傳核小體表位；例如任何組蛋白變體(例如H2AZ)、任何組蛋白修飾(例如三 甲基H3K9)或任何核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸(例如5-甲基胞嘧啶)。在可替代實(shí)施方案中， 核小體或核小體組分結(jié)合劑定向結(jié)合特定表觀遺傳信號(hào)結(jié)構(gòu)，使得僅檢測(cè)含有所述表觀遺 傳信號(hào)結(jié)構(gòu)的核小體加合物的特定子集。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的結(jié)合試劑是抗體、抗體片段或適體。在進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，使用的結(jié)合試劑是抗體。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是生物流體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，樣品是血液或血清 或血漿。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，體液中的核小體加合物的檢測(cè)具有是不需要活組織 檢查的最低限度侵入性方法的優(yōu)點(diǎn)。
[0064] 然而，在一些情況下，可能優(yōu)選直接通過(guò)下述評(píng)價(jià)細(xì)胞的核小體加合物狀態(tài)：由該 細(xì)胞產(chǎn)生核小體，并且就特定核小體加合物的存在分析核小體。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)細(xì)胞中的核小體加合物的方法，其包 括下述步驟： (i) 從細(xì)胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 根據(jù)上述第二至第六方面中任一項(xiàng)所述的本發(fā)明的ELISA方法，檢測(cè)或測(cè)量核 小體加合物的存在。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)或診斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平來(lái)鑒定個(gè)體的疾病狀態(tài)。
[0067] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，樣品中核小體加合物的存在用于確定需要此類(lèi)治療 的個(gè)體中的最優(yōu)治療方案。此類(lèi)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例是檢測(cè)核激素受體-核小體加合物或 激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物，用于評(píng)價(jià)腫瘤的激素依賴(lài)性。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于評(píng)價(jià)動(dòng)物或人個(gè)體對(duì)醫(yī)學(xué)治療的適合性的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平作為選擇個(gè)體的合適治療的參數(shù)。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于監(jiān)控動(dòng)物或人個(gè)體的治療的方法，其包括 下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物； (ii) 在一個(gè)或多個(gè)場(chǎng)合重復(fù)個(gè)體體液中的核小體加合物的檢測(cè)或測(cè)量； (iii) 使用檢測(cè)到的核小體加合物水平中的任何改變作為個(gè)體狀況中的任何改變的參 數(shù)。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)或測(cè)量核小體加合物作為一組測(cè)量之一。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了單獨(dú)或作為一組測(cè)量的部分的用于檢測(cè)或測(cè)量 核小體加合物的方法，其用于以下目的：檢測(cè)或診斷疾病狀態(tài)，或用于評(píng)價(jià)動(dòng)物或人個(gè)體對(duì) 醫(yī)學(xué)治療的適合性，或用于監(jiān)控動(dòng)物或人個(gè)體的治療，所述方法用于在患有實(shí)際或可疑癌 癥、良性腫瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、傳染病、膿毒癥、中風(fēng)或心肌梗塞 的個(gè)體中。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于檢測(cè)或診 斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體體液中的核小體加合物； (ii) 檢測(cè)或測(cè)量健康個(gè)體或?qū)φ諅€(gè)體體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對(duì)照個(gè)體中檢測(cè)到的水平之間的差異，來(lái)鑒定核小體加合物是否 可用作疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)核小體加合物的試劑盒，其包括對(duì)于 核小體加合物或其組成部分、或DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物 特異性的配體或結(jié)合劑，連同試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0074] 除組蛋白和核酸組分之外，已知染色質(zhì)含有廣泛多樣的蛋白質(zhì)，其執(zhí)行廣泛范圍 的功能。我們選擇HMGBUEZH2和幾種核受體作為這些蛋白質(zhì)的實(shí)例，并且已開(kāi)發(fā)用于檢測(cè) 這些蛋白質(zhì)的單核小體和寡核小體加合物的簡(jiǎn)單ELISA方法。我們直接對(duì)得自健康和患病 個(gè)體的血清樣品進(jìn)行這些ELISA方法，并且該方法不需要樣品提取或其他樣品預(yù)處理。令 人驚訝的是，我們已顯示這些核小體加合物可以在癌癥個(gè)體的血清中檢測(cè)到，并且核小體 加合物ELISA測(cè)定可用于疾病狀態(tài)的檢測(cè)和診斷。
[0075] HMGB1是與細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡和眾多疾病相關(guān)的損傷相關(guān)分子模式（DAMP)蛋白 質(zhì)，所述疾病包括多種炎性和自身免疫狀況、膿毒癥、腦膜炎、神經(jīng)變性、SLE和癌癥（Tang 等人；2010)。升高的HMGB1表達(dá)在許多癌癥中發(fā)生，并且被認(rèn)為與侵入和轉(zhuǎn)移相關(guān)（Sims等 人，2010)。升高的HMGB1水平也在癌癥患者的血液中以及多種其他狀況下發(fā)生（Stoetzer 等人，2012)。循環(huán)HMGB1可以通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)量，但此類(lèi)測(cè)量不用于常規(guī)臨床實(shí)踐中， 因?yàn)檠h(huán)HMGB1以結(jié)合和游離形式存在，并且目前可用于區(qū)分這些的蛋白質(zhì)免疫印跡方 法不適合于常規(guī)用途。因此，存在區(qū)分游離HMGB1和HMGB1復(fù)合物的可靠方法的需要 (Urbonaviciute和Voll，2011)。重要種類(lèi)的循環(huán)HMGB1復(fù)合物是HMGB1-核小體加合物， 并且本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案針對(duì)HMGB1-核小體加合物及其他HMG-核小體加合物的檢測(cè)。 我們已顯示HMG-核小體加合物可以使用快速和簡(jiǎn)單的ELISA方法，在癌癥患者的血液中進(jìn) 行測(cè)量。
[0076] HMGB1緊密附著至細(xì)胞凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)。核小體-HMGB1復(fù)合物的研究已顯示這 些加合物在患有自身免疫疾病SLE的個(gè)體的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，并且加合物涉及其為SLE關(guān)鍵特 征的抗核抗體的發(fā)生。這些加合物在循環(huán)中的存在仍未用于臨床診斷目的，因?yàn)橛糜谄錂z 測(cè)的蛋白質(zhì)印跡方法是昂貴、緩慢和費(fèi)力的，并且不適合于常規(guī)臨床用途。本發(fā)明克服了這 些缺點(diǎn)。
[0077] EZH2是染色質(zhì)修飾酶(組蛋白-賴(lài)氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶)，其甲基化核小體的組蛋白 3的賴(lài)氨酸27氨基酸殘基，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和基因沉默（Cao等人；2002)。該蛋白質(zhì)已知結(jié) 合活細(xì)胞的細(xì)胞核中的染色質(zhì)。令人驚訝的是，我們已顯不EZH2在細(xì)胞死亡后保持與核小 體結(jié)合，并且使用本發(fā)明的新ELISA方法，可以在癌癥個(gè)體的血清中檢測(cè)到單核小體-EZH2 和寡核小體-EZH2加合物。
[0078] 已知染色質(zhì)修飾酶涉及癌癥（Fullgrabe等人，2011)，并且通過(guò)使用祀向藥物抑 制這些酶的活性是主要形式的癌癥治療。這些藥物包括例如但不限于組蛋白去乙?；瘡?fù)合 物抑制劑（HDACi)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（HMTi)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTi)。雖 然HMGB1加合物在循環(huán)中的存在已知是病理的，并且與抗核抗體相關(guān)，但染色質(zhì)修飾酶-核 小體加合物存在于循環(huán)中的發(fā)現(xiàn)先前未得到報(bào)道。染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物的測(cè)定具 有在癌癥中的多種用途，包括例如評(píng)價(jià)癌癥疾病狀態(tài)和測(cè)定染色質(zhì)修飾酶抑制劑藥物的功 效，例如測(cè)定循環(huán)染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物的水平是否通過(guò)用特定藥物的治療改變。 本發(fā)明的方法可以用于測(cè)定循環(huán)染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物水平，用于廣泛多樣的疾病 診斷目的，包括疾病檢測(cè)、監(jiān)控、預(yù)后、鑒別診斷和選擇治療方案。我們已顯示含有HMT酶 EZH2的核小體加合物可以在癌癥患者的循環(huán)中檢測(cè)到。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，本發(fā) 明的方法可以應(yīng)用于其他染色質(zhì)修飾酶，包括以前提及的HDAC和DNMT酶以及許多其他酶， 包括例如用于組蛋白乙?；⑷ゼ谆?、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、蘇素化和去 蘇素化的酶。
[0079] 核受體在配體激素控制下在細(xì)胞核中發(fā)揮其基因調(diào)節(jié)作用。實(shí)例包括類(lèi)固醇激素 受體、甲狀腺受體、糖皮質(zhì)激素受體以及視黃酸和維生素 D受體。這些受體涉及多種癌癥及 其他疾病機(jī)制。一些實(shí)例包括視黃酸受體（RAR)在白血病中的涉及、雌激素受體（ER)在乳 腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥中的涉及、雄激素受體(AR)在前列腺癌中的涉及、以及甲狀腺激素 受體在甲狀腺疾病和癌癥中的涉及。
[0080] 令人驚訝的是，我們已顯示核受體-核小體加合物可以在癌癥患者的循環(huán)中檢測(cè) 到。
[0081] 因此，我們選擇研究的所有細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)可以以核小體加合物的形式 在癌癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)指示此類(lèi)加合物可能不是罕見(jiàn)的，并且涉及許多不同 染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的許多此類(lèi)細(xì)胞內(nèi)核小體蛋白質(zhì)加合物可以在細(xì)胞死亡后保留其完整 性，并且順應(yīng)通過(guò)本發(fā)明的方法在癌癥、自身免疫和炎性疾病患者的血清中的檢測(cè)。
[0082] 我們已使用與適當(dāng)?shù)奶禺愋钥谷旧|(zhì)蛋白質(zhì)(抗HMGB1、抗EZH2或抗核受體)抗體 組合的抗組蛋白抗體，作為用于這些測(cè)定的捕獲抗體。我們已使用測(cè)定以顯示含有特定蛋 白質(zhì)的核小體加合物可以在得自患有癌癥的個(gè)體的血樣中進(jìn)行測(cè)量，并且區(qū)別用作非侵入 性或最低限度侵入性生物標(biāo)志。在得自患病個(gè)體的血清樣品中檢測(cè)到的核小體-加合物水 平不同于在來(lái)自健康個(gè)體的血清樣品中檢測(cè)到的那些。
[0083] 我們測(cè)量得自3個(gè)患有結(jié)腸癌的個(gè)體、6個(gè)患有肺癌的個(gè)體和2個(gè)患有胰腺癌的個(gè) 體的血樣中的循環(huán)細(xì)胞游離核小體-HMGB1和核小體-EZH2加合物水平，并且比較這些與來(lái) 自5個(gè)健康個(gè)體的血樣中存在的水平，以及如文獻(xiàn)（*Holdenrieder等人，2001)中所述制備 的來(lái)自健康個(gè)體的人工產(chǎn)生的血清核小體制劑，和通過(guò)由Hela細(xì)胞提取的染色質(zhì)消化制 備的商購(gòu)可得的核小體制劑。
[0084] 對(duì)于核小體-HMGB1和核小體-EZH2加合物，由5個(gè)健康個(gè)體的結(jié)果計(jì)算正常范圍 (平均結(jié)果土平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)，并且檢查癌癥個(gè)體的結(jié)果以查看它們是落入各自正常 范圍Z內(nèi)還是Z外。數(shù)據(jù)顯不3個(gè)結(jié)腸癌樣品中的2個(gè)、6個(gè)肺癌樣品中的4個(gè)和2個(gè)胰 腺癌樣品中的1個(gè)具有升高的核小體-HMGB1加合物水平，并且類(lèi)似地3個(gè)結(jié)腸癌樣品中的 2個(gè)、6個(gè)肺癌樣品中的4個(gè)和2個(gè)胰腺癌樣品中的1個(gè)具有升高的核小體-EZH2加合物水 平(光密度結(jié)果高于正常范圍的頂端)。
[0085] 我們已類(lèi)似地測(cè)量健康和患病患者中的核受體-核小體加合物水平，并且顯示這 些存在于癌癥患者的血清中。
[0086] 與染色質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)包括但不限于核受體、高速泳動(dòng)族蛋白（例如HMGB1)、多梳 蛋白、染色質(zhì)修飾酶(例如EZH2)、DNA修飾酶、核受體、轉(zhuǎn)錄因子、構(gòu)筑或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)因子、轉(zhuǎn)錄阻遏因子、復(fù)制蛋白、DNA損傷修復(fù)蛋白以及涉及基因表達(dá)、染色質(zhì)包裝或復(fù) 制控制的任何其他蛋白質(zhì)。
[0087] 核小體加合物還可以由于細(xì)胞死亡后在生物流體（biological fluid)中存在的 核小體的結(jié)合而存在。此類(lèi)加合物的實(shí)例將是自身免疫疾病例如SLE形成的核小體-抗體 加合物。
[0088] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于檢測(cè)或測(cè)量核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合 物或加合物的存在的方法。待測(cè)量的核小體加合物可以具有任何起源，包括但不限于由于 健康或患病狀況在生物流體中存在的天然存在的核小體加合物，或核小體加合物可以通過(guò) 由細(xì)胞提取的染色質(zhì)消化而產(chǎn)生，或它們可以通過(guò)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死而產(chǎn)生(例 如通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法)。令人驚訝的是，我們已顯示核小體加合物在所 有這些情形下存在，并且可以通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0089] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于檢測(cè)或測(cè)量生物流體中的核小體-蛋 白質(zhì)加合物的存在的方法。
[0090] 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，提供了通過(guò)就一種或多種核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合物 或加合物的存在或水平測(cè)試個(gè)體樣品，用于檢測(cè)或診斷疾病的存在、類(lèi)型、復(fù)發(fā)或嚴(yán)重性， 或評(píng)價(jià)最優(yōu)藥物或其他治療選項(xiàng)的方法。
[0091] 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，提供了通過(guò)就核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合物或加合物的 存在或水平測(cè)試得自個(gè)體的樣品作為一組測(cè)試的部分，用于檢測(cè)或診斷疾病的存在、類(lèi)型、 復(fù)發(fā)或嚴(yán)重性，或評(píng)價(jià)最優(yōu)藥物或其他治療選項(xiàng)的方法。用于檢測(cè)含有不同組蛋白修飾的 細(xì)胞游離核小體的ELISA方法已得到報(bào)道（Bawden等人；2005)。
[0092] 因此，此類(lèi)一組測(cè)試可以由例如含有不同核小體表位的核小體的兩種或更多種測(cè) 量組成；包括但不限于不同加合物和/或組蛋白修飾和/或組蛋白變體和/或經(jīng)修飾的核 苷酸和/或核小體自身的測(cè)量，或這些中的任何和任何其他核小體表位的任何組合或比， 作為個(gè)體的健康或疾病狀態(tài)的指標(biāo)。
[0093] 我們得出結(jié)論本發(fā)明的方法是用于檢測(cè)和測(cè)量含有特定蛋白質(zhì)的核小體加合物 的成功方法，并且該方法是比本領(lǐng)域的方法更佳的用于檢測(cè)核小體加合物的方法。該方法 是快速、低成本的且適合用于復(fù)雜生物介質(zhì)和流體，包括血液及其衍生物。我們已證實(shí)本發(fā) 明的方法可以用于檢測(cè)血液中的核小體加合物，并且這可以用作癌癥的生物標(biāo)志。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將明確的是，血液中存在的生物標(biāo)志具有用于癌癥及其他與升高的循環(huán)核小體相 關(guān)的疾病的廣泛范圍的診斷和疾病篩選目的的價(jià)值（Ho 1 denrieder等人，2001)。
[0094] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)且測(cè)量樣品中的細(xì)胞游離核小體加合物 的雙抗體、免疫測(cè)足或夾心（sandwich)免疫測(cè)足萬(wàn)法。這個(gè)萬(wàn)面的一個(gè)實(shí)施萬(wàn)案是免疫測(cè) 定，其包含下述步驟： (i) 使可能含有核小體加合物的樣品與第一抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第一抗體或 其他結(jié)合劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使核小體或樣品與第二抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第二抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合 可能作為核小體-蛋白質(zhì)加合物存在的蛋白質(zhì)； (iii) 檢測(cè)和/或定量所述第二抗體或其他結(jié)合劑與樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物 的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的量度。 [0095] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過(guò)免疫測(cè)量免疫測(cè)定用于檢測(cè)且測(cè)量樣品中 的細(xì)胞游離核小體加合物的方法，其包含下述步驟： (i)使可能包含含有特定蛋白質(zhì)的核小體加合物的樣品與第一抗體或其他結(jié)合劑接 觸，所述第一抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合目的蛋白質(zhì)； (ii )使核小體或樣品與第二抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第二抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合 核小體或其組分； (iii) 用結(jié)合樣品中的核小體或其組分的第二抗體或其他結(jié)合劑檢測(cè)和/或定量所述 第二抗體或其他結(jié)合劑與核小體樣品的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為樣品中核小體加合物的存在的量度。
[0096] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，在上文第一方面的階段（i)和上文第二方面的階段 (i i )中，用于結(jié)合核小體或其組分的抗體或其他結(jié)合劑可以是針對(duì)完整核小體或針對(duì)核小 體的任何組成部分的抗體(或其他結(jié)合劑)，包括但不限于針對(duì)組蛋白、組蛋白變體、組蛋白 修飾、核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或核小體的DNA組分的其他部分。因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步 方面，提供了用于(僅)檢測(cè)那些核小體-蛋白質(zhì)加合物的方法，所述核小體-蛋白質(zhì)加合物 另外含有該結(jié)合劑針對(duì)其的另一個(gè)特征，包括但不限于特定組蛋白修飾、組蛋白變體或核 苷酸。該設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)定的核小體組分表位和加合的蛋白質(zhì)表位可以選擇為其水平在 健康或患病患者，或處于研究下的其他患者狀態(tài)中極大不同的表位。因此有可能降低通過(guò) 測(cè)定檢測(cè)到的核小體比例，而增加測(cè)定的臨床選擇性或特異性。
[0097] 我們已使用與抗EZH2抗體結(jié)合的針對(duì)核小體組分H2AZ的抗體作為抗核小體抗 體，進(jìn)行測(cè)定的該設(shè)計(jì)，并且顯示與H2AZ特異性相關(guān)的核小體-EZH2加合物可以通過(guò)此類(lèi) 測(cè)定檢測(cè)，并且這些測(cè)定可以用于區(qū)分得自健康和患病個(gè)體的樣品。
[0098] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，待檢測(cè)的核小體加合物可以含有超過(guò)一種蛋白質(zhì)。加合 物中的進(jìn)一步蛋白質(zhì)可以直接或間接結(jié)合核小體。例如，核小體可以結(jié)合HMGB蛋白質(zhì)，并 且另外結(jié)合進(jìn)一步的一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的一種或多種蛋白質(zhì)可以直接結(jié)合 核小體或可以結(jié)合HMGB蛋白質(zhì)，并且因此間接結(jié)合核小體。核小體加合物可以含有由多種 蛋白質(zhì)組分組成的大蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中復(fù)合加合物中的特定蛋白質(zhì)與核小體的結(jié)合可以 通過(guò)多種中間結(jié)合連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，核小體加合物中直接或間接結(jié)合核 小體的蛋白質(zhì)可以通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0099] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，所述本發(fā)明的方法包括多個(gè)實(shí)施方案，包括生物傳 感器型測(cè)定和例如由美國(guó)的ForteBio Incorporated銷(xiāo)售的無(wú)標(biāo)記測(cè)定類(lèi)型。
[0100] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè)樣品中包含特定核小體加合物的核小 體比例的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量樣品中的核小體水平； (ii) 根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)或測(cè)量核小體加合物水平；和 (iii) 使用兩種測(cè)量來(lái)測(cè)定包含核苷酸加合物的核小體比例。
[0101] 我們已顯示得自個(gè)體的血液中的核小體加合物的檢測(cè)和測(cè)量可以用作診斷方法， 以鑒定患有癌癥的個(gè)體且區(qū)分其與健康個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于檢測(cè) 或診斷疾病的存在的方法，通過(guò)測(cè)量或檢測(cè)體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的存在和/或 水平或濃度，并且使用檢測(cè)的水平作為個(gè)體的疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志，包括但不限于疾病的 臨床診斷、疾病類(lèi)型或亞型的鑒別診斷、或疾病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)、或?qū)χ委煼桨傅膫€(gè)體敏 感性的診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解用于診斷測(cè)試的體液包括但不限于血液、血清、血 漿、尿、腦脊液及其他流體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇為樣品的體液是血液、血清或血 漿。體液中的核小體加合物的測(cè)定應(yīng)答、水平、濃度或數(shù)量可以表示為絕對(duì)項(xiàng)或相對(duì)項(xiàng)，例 如但不限于作為存在的總核小體水平的比例，或者作為與含有另一種核小體結(jié)構(gòu)如組蛋白 修飾的核小體水平或與總DNA水平的比例。
[0102] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核小體加合物測(cè)量用作測(cè)試的診斷組的成員或用于 檢測(cè)或診斷個(gè)體的疾病狀態(tài)的測(cè)量，包括但不限于疾病的臨床診斷、疾病類(lèi)型或亞型、或疾 病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)的鑒別診斷、或?qū)χ委煼桨傅膫€(gè)體敏感性的診斷。
[0103] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)或測(cè)量細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的染色質(zhì)結(jié)合 的存在和/或水平的方法，其包括下述步驟： (i) 從細(xì)胞中分離染色質(zhì)； (ii) 分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 借助于本發(fā)明的免疫測(cè)定方法，檢測(cè)或測(cè)量單核小體和/或寡核小體中的核小 體加合物的存在。
[0104] 用于由染色質(zhì)產(chǎn)生單核小體和/或寡核小體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包 括酶消化和超聲處理（Dai等人，2011)。我們已證實(shí)用于由Hela和MCF7細(xì)胞產(chǎn)生的核小 體的這個(gè)方面。
[0105] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，就本發(fā)明的任何方面而言的術(shù)語(yǔ)抗體、結(jié)合劑或配 體不是限制性的，而是旨在包括抗體片段、適體或任何能夠與特定分子或?qū)嶓w結(jié)合的結(jié)合 齊IJ，并且任何合適的結(jié)合劑均可用于本發(fā)明的方法中。還將明確的是，術(shù)語(yǔ)核小體旨在包括 單核小體和寡核小體，以及可以在流體介質(zhì)中分析的任何此類(lèi)染色質(zhì)片段。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)或測(cè)量核小體加合物的試劑盒，其包 括對(duì)于核小體加合物或其組成部分、或核小體加合物或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特 異性的配體或結(jié)合劑，連同依照本文定義的任何方法的試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0107] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于檢測(cè)或診 斷動(dòng)物或人中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量患病個(gè)體的體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的水平； (ii) 檢測(cè)或測(cè)量對(duì)照個(gè)體的體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的水平；和 (iii) 使用患病和對(duì)照個(gè)體中檢測(cè)到的水平之間的差異，來(lái)鑒定核小體加合物是否可 用作該疾病的生物標(biāo)志。
[0108] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，對(duì)照個(gè)體可以在多種基礎(chǔ)上加以選擇，所述基礎(chǔ)可 以包括例如已知不患有疾病的個(gè)體，或可以是患有不同疾病的個(gè)體(例如，用于研究鑒別診 斷)。
[0109] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于評(píng)價(jià)患病 動(dòng)物或人個(gè)體的預(yù)后的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測(cè)或測(cè)量患病個(gè)體的體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的水平；和 (ii) 使患病個(gè)體的體液中檢測(cè)的細(xì)胞游離核小體加合物的水平與個(gè)體的疾病結(jié)果關(guān) 聯(lián)。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志的方法，所述 核小體加合物生物標(biāo)志待用于選擇需要治療的患病動(dòng)物或人個(gè)體的治療方案，所述方法包 括下述步驟： (i)檢測(cè)或測(cè)量患病個(gè)體的體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的水平；和 (i i )使患病個(gè)體的體液中檢測(cè)的細(xì)胞游離核小體加合物的水平與那些個(gè)體中觀察到 的治療方案功效關(guān)聯(lián)。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標(biāo)志的方法，所述 核小體加合物生物標(biāo)志待用于監(jiān)控患病動(dòng)物或人個(gè)體的治療，所述方法包括下述步驟： (i)檢測(cè)或測(cè)量患病個(gè)體的體液中的細(xì)胞游離核小體加合物的水平； (ii )在個(gè)體的疾病進(jìn)展過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)場(chǎng)合，重復(fù)所述檢測(cè)或測(cè)量；和 (iii) 使患病個(gè)體的體液中檢測(cè)的細(xì)胞游離核小體加合物的水平與個(gè)體中的疾病進(jìn)展 關(guān)聯(lián)。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了通過(guò)如本文定義的方法鑒定的生物標(biāo)志。
[0113] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了能夠與生物標(biāo)志特異性結(jié)合的配體或結(jié)合劑，例如天 然存在的或化學(xué)合成的化合物。根據(jù)本發(fā)明的配體或結(jié)合劑可以包含能夠與生物標(biāo)志特異 性結(jié)合的肽、抗體或其片段，或合成配體例如塑料抗體，或適體或寡核苷酸?？贵w可以是能 夠與生物標(biāo)志特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。根據(jù)本發(fā)明的配體可以用可檢測(cè)標(biāo)記物 進(jìn)行標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物例如發(fā)光、熒光、酶或放射性標(biāo)記物；或者或另外地，根據(jù)本發(fā) 明的配體可以用親和標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，所述親和標(biāo)簽例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物 素蛋白或His (例如六His)標(biāo)簽?；蛘撸潴w結(jié)合可以使用無(wú)標(biāo)記技術(shù)例如ForteBio Inc 的技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以包括能夠與針對(duì)生物標(biāo)志的抗體特異性結(jié)合的生 物標(biāo)志或其結(jié)構(gòu)/形狀模擬物。還提供的是包含如本文描述的配體或模擬物的陣列。
[0115] 本發(fā)明還提供的是如本文描述的一種或多種配體的用途，或本發(fā)明的生物傳感 器、或本發(fā)明的陣列或本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)和/或定量生物標(biāo)志的用途，所述一種或多種 配體可以是天然存在的或化學(xué)合成的，并且適合地是肽、抗體或其片段，適體或寡核苷酸。 在這些用途中，檢測(cè)和/或定量可以對(duì)如本文定義的生物樣品進(jìn)行。
[0116] 提供用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的診斷或監(jiān)控試劑盒。此類(lèi)試劑盒適當(dāng)?shù)匕ㄓ糜跈z 測(cè)和/或定量生物標(biāo)志的根據(jù)本發(fā)明的配體，和/或生物傳感器，和/或如本文描述的陣 列，任選連同試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0117] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面是用于檢測(cè)疾病狀態(tài)的存在的試劑盒，其包括能夠檢測(cè)和/ 或定量如本文定義的一種或多種生物標(biāo)志的生物傳感器。
[0118] 用于檢測(cè)疾病存在的生物標(biāo)志是用于發(fā)現(xiàn)新靶和藥物分子的必需靶，所述新靶和 藥物分子延緩或停止病癥的進(jìn)展。因?yàn)樯飿?biāo)志的水平指示病癥和藥物應(yīng)答，所以生物標(biāo) 志可用于在體外和/或體內(nèi)測(cè)定中鑒定新治療化合物。本發(fā)明的生物標(biāo)志可以用于篩選化 合物的方法中，所述化合物調(diào)節(jié)生物標(biāo)志的活性。
[0119] 因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了如所述的結(jié)合劑或配體的用途，所述結(jié)合劑 或配體可以是根據(jù)本發(fā)明的肽、抗體或其片段或適體或寡核苷酸；或根據(jù)本發(fā)明的生物傳 感器、或根據(jù)本發(fā)明的陣列；或根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途，用于鑒定能夠促進(jìn)和/或抑制 生物標(biāo)志生成的物質(zhì)。
[0120] 還提供的是鑒定能夠促進(jìn)或抑制個(gè)體中的生物標(biāo)志生成的物質(zhì)的方法，其包括給 受試動(dòng)物施用測(cè)試物質(zhì)，和檢測(cè)和/或定量來(lái)自個(gè)體的測(cè)試樣品中存在的生物標(biāo)志水平。
[0121] 術(shù)語(yǔ)"生物標(biāo)志"意指過(guò)程、事件或狀況的鑒別性的生物或生物衍生的指示物。生 物標(biāo)志可以用于診斷例如臨床篩選和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法中，以及用于監(jiān)控治療的結(jié)果、鑒定 最可能響應(yīng)特定治療處理的個(gè)體、藥物篩選和開(kāi)發(fā)。生物標(biāo)志及其用途對(duì)于鑒定新藥物治 療和發(fā)現(xiàn)藥物治療的新靶是有價(jià)值的。
[0122] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"和"診斷"包含疾病狀態(tài)的鑒定、證實(shí)和/或表征。根 據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)、監(jiān)控和診斷方法可用于證實(shí)疾病的存在，通過(guò)評(píng)價(jià)發(fā)作和進(jìn)展來(lái)監(jiān)控疾 病的發(fā)展，或評(píng)價(jià)疾病的好轉(zhuǎn)或消退。檢測(cè)、監(jiān)控和診斷方法還可用于評(píng)價(jià)臨床篩選、預(yù)后、 治療選擇、評(píng)估臨床利益的方法中，即用于藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)。
[0123] 通過(guò)確定正確診斷，允許快速鑒定最適當(dāng)?shù)闹委煟ㄒ虼藴p少不需要的對(duì)有害藥物 副作用的暴露)，并且降低復(fù)發(fā)率，有效診斷和監(jiān)控方法提供了非常有力的"個(gè)體解決方 案"，具有改進(jìn)預(yù)后的潛力。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志從腫瘤細(xì)胞中釋放。因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一 步方面，提供了用于檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的方法，其包括下述步驟：（i)測(cè)量生物樣品中的生物標(biāo) 志，其與腫瘤細(xì)胞相關(guān)或從腫瘤細(xì)胞中釋放，和（ii)證實(shí)所述生物標(biāo)志的水平與腫瘤大小、 分期、侵占性或散布相關(guān)。
[0125] 已知增加的細(xì)胞更新、細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致增加的細(xì)胞游離核小體的循環(huán) 水平（Holdenrieder等人，2001 )。循環(huán)細(xì)胞游離核小體水平是非特異性指標(biāo)，并且存在于 多種狀況中，包括炎性疾病、許多種良性和惡性狀況、自身免疫疾病、以及在創(chuàng)傷或缺血后 (Holdenrieder等人2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，本發(fā)明將具有在其中循環(huán)核小體 已在個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的多種疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用。這些包括但不限于創(chuàng)傷(例如，嚴(yán)重?fù)p傷或手 術(shù))、過(guò)度鍛煉(例如跑馬拉松)、中風(fēng)和心臟病發(fā)作、膿毒癥或其他嚴(yán)重感染和子宮內(nèi)膜異 位癥。
[0126] 本發(fā)明的免疫測(cè)定包括采用酶檢測(cè)方法(例如ELISA)的免疫測(cè)量測(cè)定、熒光標(biāo)記 的免疫測(cè)量測(cè)定、時(shí)間分辨的熒光標(biāo)記的免疫測(cè)量測(cè)定、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)量測(cè)定、免疫比濁 測(cè)定、微粒標(biāo)記的免疫測(cè)量測(cè)定和免疫放射測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定方法，包括標(biāo)記的抗原 和標(biāo)記的抗體競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定方法，其具有多種標(biāo)記類(lèi)型包括放射性、酶、熒光、時(shí)間分辨 的熒光和微粒標(biāo)記。所有所述免疫測(cè)定方法均是本領(lǐng)域眾所周知的，參見(jiàn)例如Salgame等 人，1997 和 van Nieuwenhui jze #人，2003。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物樣品包含體液。例如，可以在本發(fā)明的方法中測(cè)試的 生物樣品包括腦脊液（CSF )、全血、血液血清、血漿、月經(jīng)血、子宮內(nèi)膜流體、尿、唾液或其他 體液(糞便、淚液、滑液、痰)、呼氣例如凝結(jié)的呼氣、或由其的提取物或純化物或其稀釋物。 生物樣品還包括來(lái)自活個(gè)體的或死后獲得的樣本。樣品可以以通常方式進(jìn)行制備(例如適 當(dāng)時(shí)，稀釋或濃縮）且貯存。
[0128] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在多個(gè)場(chǎng)合重復(fù)。該實(shí)施方案提供了允許經(jīng)過(guò) 一段時(shí)期監(jiān)控的檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。此類(lèi)安排將提供監(jiān)控或評(píng)價(jià)疾病狀態(tài)的治療功效的利 益。本發(fā)明的此類(lèi)監(jiān)控方法可以用于監(jiān)控發(fā)作、進(jìn)展、穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、復(fù)發(fā)和/或緩解。
[0129] 因此，本發(fā)明還提供了就懷疑患有此類(lèi)疾病的個(gè)體中的疾病狀態(tài)監(jiān)控治療功效的 方法，其包括檢測(cè)和/或定量來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品中存在的生物標(biāo)志。在監(jiān)控方法中， 測(cè)試樣品可以在兩個(gè)或更多個(gè)場(chǎng)合獲得。該方法可以進(jìn)一步包括比較測(cè)試樣品中存在的一 種或多種生物標(biāo)志的水平，與一種或多種對(duì)照和/或例如在治療開(kāi)始前，較早得自相同測(cè) 試個(gè)體，和/或在治療的較早階段來(lái)自相同測(cè)試個(gè)體的一種或多種先前測(cè)試樣品。該方法 可以包括檢測(cè)在不同場(chǎng)合獲得的測(cè)試樣品中的一種或多種生物標(biāo)志的性質(zhì)或量中的改變。
[0130] 因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于就人或動(dòng)物個(gè)體中的疾病狀態(tài)監(jiān)控 治療功效的方法，其包括： (a) 定量如本文定義的生物標(biāo)志的量；和 (b) 比較測(cè)試樣品中的所述生物標(biāo)志的量與一種或多種對(duì)照和/或在較早時(shí)間得自相 同測(cè)試個(gè)體的一種或多種先前測(cè)試樣品中存在的量。
[0131] 相對(duì)于較早得自相同測(cè)試個(gè)體的先前測(cè)試樣品中的水平，測(cè)試樣品中的生物標(biāo)志 水平中的改變可以指示所述治療對(duì)病癥或可疑病癥的有利效應(yīng)，例如穩(wěn)定或改善。此外，一 旦治療已完成，本發(fā)明的方法就可以定期重復(fù)，以便監(jiān)控疾病的復(fù)發(fā)。
[0132] 用于監(jiān)控治療功效的方法可以用于監(jiān)控現(xiàn)有治療和新治療在人個(gè)體和非人動(dòng)物 中（例如動(dòng)物模型中）的治療有效性。這些監(jiān)控方法可以并入新藥物質(zhì)和物質(zhì)組合的篩選 內(nèi)。
[0133] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，由于速效治療的更快速改變的監(jiān)控可以以數(shù)小時(shí)或數(shù)天 的更短間隔進(jìn)行。
[0134] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于鑒定檢測(cè)疾病狀態(tài)的存在的生物標(biāo)志的方 法。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"鑒定"意指證實(shí)生物樣品中存在的生物標(biāo)志的存在。定量樣品中 存在的生物標(biāo)志的量可以包括測(cè)定樣品中存在的生物標(biāo)志的濃度。鑒定和/或定量可以直 接對(duì)樣品或間接對(duì)由其的提取物或其稀釋物進(jìn)行。
[0135] 在本發(fā)明的可替代方面，生物標(biāo)志的存在通過(guò)檢測(cè)和/或定量能夠與生物標(biāo)志特 異性結(jié)合的抗體或其片段(其由個(gè)體身體響應(yīng)所述生物標(biāo)志而生成，并且因此存在于來(lái)自 具有疾病狀態(tài)的個(gè)體的生物樣品中）進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0136] 鑒定和/或定量可以通過(guò)適合于鑒定來(lái)自個(gè)體的生物樣品中或者生物樣品的純 化物或提取物或者其稀釋物中的特定蛋白質(zhì)的存在和/或量的任何方法進(jìn)行。在本發(fā)明的 方法中，定量可以通過(guò)測(cè)量一種或多種樣品中的生物標(biāo)志的濃度進(jìn)行?？梢栽诒景l(fā)明的方 法中測(cè)試的生物樣品包括如上文定義的生物樣品。樣品可以以通常方式進(jìn)行制備(例如適 當(dāng)時(shí)，稀釋或濃縮）且貯存。
[0137] 生物標(biāo)志的鑒定和/或定量可以通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志或其片段進(jìn)行，所述片段例如 具有C末端截短或具有N末端截短的片段。片段適當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)度大于4個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。特別指出與組蛋白尾部的序 列相同或相關(guān)的序列的肽是特別有用的組蛋白片段。
[0138] 生物標(biāo)志可以例如通過(guò)SELDI或MALDI-T0F直接檢測(cè)?；蛘?，生物標(biāo)志可以經(jīng)由 與一種或多種配體的相互作用而直接或間接檢測(cè)，所述一種或多種配體例如能夠特異性結(jié) 合生物標(biāo)志的抗體或其生物標(biāo)志結(jié)合片段、或其他肽、或配體例如適體或寡核苷酸。配體或 結(jié)合劑可以具有可檢測(cè)標(biāo)記，例如發(fā)光、熒光或放射性標(biāo)記和/或親和標(biāo)簽。
[0139] 例如，檢測(cè)和/或定量可以通過(guò)選自下述的一種或多種方法進(jìn)行：SELDI (-T0F)、 MALDI (-T0F)、基于1-D凝膠的分析、基于2-D凝膠的分析、質(zhì)譜法（MS)、反相（RP)LC、大小 滲透(凝膠過(guò)濾)、離子交換、親和力、HPLC、UPLC及其他基于LC或LC MS的技術(shù)。適當(dāng)?shù)腖C MS 技術(shù)包括 ICAT? (Applied Biosystems，CA，USA)或 iTRAQ? (Applied Biosystems，CA， USA)。還可以使用液相色譜法(例如高壓液相色譜法（HPLC)或低壓液相色譜法（LPLC))、薄 層色譜法、NMR (核磁共振）光譜法。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明的診斷或監(jiān)控方法可以包括通過(guò)SELDI T0F或MALDI T0F分析樣品，以 檢測(cè)生物標(biāo)志的存在或水平。這些方法還適合于臨床篩選、預(yù)后、監(jiān)控治療的結(jié)果、鑒定最 可能響應(yīng)特定治療處理的個(gè)體，適合于藥物篩選和開(kāi)發(fā)、和鑒定藥物治療的新靶。
[0141] 鑒定和/或定量分析物生物標(biāo)志可以使用免疫學(xué)方法進(jìn)行，其涉及能夠與生物 標(biāo)志特異性結(jié)合的抗體或其片段。合適的免疫學(xué)方法包括夾心免疫測(cè)定例如夾心ELISA， 其中分析物生物標(biāo)志的檢測(cè)使用兩種抗體進(jìn)行，所述抗體識(shí)別分析物生物標(biāo)志上的不同 表位；放射性免疫測(cè)定（RIA)，直接、間接或競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)，酶免疫測(cè)定 (EIA)，熒光免疫測(cè)定（FIA)，蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀和任何基于顆粒的免疫測(cè)定(例如使用 金、銀或乳膠顆粒，磁性顆粒，或量子點(diǎn)（Q-dots))。免疫學(xué)方法可以例如以微量滴定板或條 形式進(jìn)行。
[0142] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志可以替換為在生物途徑中的生物標(biāo)志上 游或下游發(fā)現(xiàn)的分子、或該分子可測(cè)量的片段。
[0143] 對(duì)于疾病特異性的關(guān)鍵生物標(biāo)志的鑒定對(duì)于診斷程序和治療方案的整合是關(guān)鍵 的。使用預(yù)測(cè)生物標(biāo)志，可以開(kāi)發(fā)適當(dāng)?shù)脑\斷工具例如生物傳感器；相應(yīng)地，在本發(fā)明的方 法和用途中，鑒定和定量可以使用生物傳感器、微分析系統(tǒng)、微工程系統(tǒng)、微分離系統(tǒng)、免疫 色譜法系統(tǒng)或其他合適的分析裝置進(jìn)行。生物傳感器可以并入免疫學(xué)方法用于檢測(cè)一種或 多種生物標(biāo)志、電、熱、磁、光學(xué)(例如全息圖）或聲學(xué)技術(shù)。使用此類(lèi)生物傳感器，能夠檢測(cè) 在生物樣品中發(fā)現(xiàn)的以預(yù)期濃度的一種或多種靶生物標(biāo)志。
[0144] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"生物傳感器"意指能夠檢測(cè)生物標(biāo)志的存在的任何事物。生 物傳感器的實(shí)例在本文中描述。
[0145] 根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以包括能夠與生物標(biāo)志特異性結(jié)合的如本文描述的 配體結(jié)合劑或配體。此類(lèi)生物傳感器可用于檢測(cè)和/或定量本發(fā)明的生物標(biāo)志。
[0146] 本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志可以使用下述進(jìn)行檢測(cè)：并入基于"智能"全息圖的 技術(shù)的生物傳感器，或高頻聲學(xué)系統(tǒng)，此類(lèi)系統(tǒng)特別順應(yīng)"條形碼"或陣列配置。
[0147] 在智遺全息圖傳感器（Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK)中，全息圖像存于 對(duì)與生物標(biāo)志特異性反應(yīng)致敏的薄聚合物膜中。在暴露后，生物標(biāo)志與聚合物反應(yīng)，導(dǎo)致由 全息圖展示的圖像中的改變。測(cè)試結(jié)果讀出可以是光亮度、圖像、顏色和/或圖像位置中的 改變。對(duì)于定量和半定量應(yīng)用，傳感器全息圖可以由眼閱讀，因此去除檢測(cè)設(shè)備的需要。當(dāng) 需要定量測(cè)量時(shí)，簡(jiǎn)單的顏色傳感器可以用于閱讀信號(hào)。樣品的不透明度或顏色不干擾傳 感器的操作。傳感器的形式允許用于同時(shí)檢測(cè)幾種物質(zhì)的多路技術(shù)。可以設(shè)計(jì)可逆和不可 逆?zhèn)鞲衅饕詽M(mǎn)足不同需要，并且連續(xù)監(jiān)控特定目的生物標(biāo)志是可行的。
[0148] 適當(dāng)?shù)?，用于檢測(cè)本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志的生物傳感器組合生物分子識(shí)別 與適當(dāng)方法，以將樣品中的生物標(biāo)志的存在或定量的檢測(cè)轉(zhuǎn)換成信號(hào)。生物傳感器可以適 于"備選場(chǎng)地"診斷測(cè)試，例如在病室、個(gè)體外科室（outsubjects' department)、手術(shù)、家 庭、野外和工作場(chǎng)所中。
[0149] 檢測(cè)本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志的生物傳感器包括聲學(xué)、等離子共振、全息、生 物層干涉測(cè)量法（BLI)和微工程傳感器。印刷的識(shí)別元件、薄膜晶體管技術(shù)、磁聲波諧振器 裝置及其他新的聲電系統(tǒng)可以用于傳感器中，用于檢測(cè)本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志。
[0150] 涉及本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志的鑒定和/或定量的方法可以在臺(tái)式儀器上 進(jìn)行，或可以并入一次性使用的診斷或監(jiān)控平臺(tái)上，其可以用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，例如醫(yī)生 的辦公室中或在個(gè)體的床邊。用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的合適生物傳感器包括具有光或聲閱 讀器的"信用（credit)"卡。生物傳感器可以配置為允許收集數(shù)據(jù)以電子傳輸給醫(yī)生用于 解釋?zhuān)⑶乙虼丝梢孕纬呻娮俞t(yī)學(xué)（e-medicine)的基礎(chǔ)。
[0151] 在本文中描述了用于疾病狀態(tài)的存在的診斷和監(jiān)控的診斷試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方 案中，試劑盒另外含有能夠鑒定和/或定量生物標(biāo)志的生物傳感器。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的 試劑盒可以含有選自下述的一種或多種組分：對(duì)于生物標(biāo)志或生物標(biāo)志的結(jié)構(gòu)/形狀模擬 物特異性的配體結(jié)合劑或配體，一種或多種對(duì)照，一種或多種試劑和一種或多種消耗品；任 選連同依照本文定義的任何方法的試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0152] 用于疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志的鑒定允許整合診斷程序和治療方案。本發(fā)明的生物標(biāo) 志的檢測(cè)可以用于在其參與臨床試驗(yàn)之前篩選個(gè)體。生物標(biāo)志提供指示治療應(yīng)答、未能應(yīng) 答、不利的副作用概況、用藥順應(yīng)程度和足夠的血清藥物水平的實(shí)現(xiàn)的方法。生物標(biāo)志可以 用于提供不利藥物應(yīng)答的警告。生物標(biāo)志可用于開(kāi)發(fā)個(gè)人化治療，因?yàn)閼?yīng)答的評(píng)價(jià)可以用 于細(xì)調(diào)劑量，使開(kāi)出的用藥數(shù)目降到最低，降低獲得有效治療中的延遲且避免不利的藥物 反應(yīng)。因此，通過(guò)監(jiān)控本發(fā)明的生物標(biāo)志，個(gè)體護(hù)理可以精確地量身定制，以匹配由病癥和 個(gè)體的藥物基因組概況確定的需要，生物標(biāo)志因此可以用于滴定最優(yōu)劑量，預(yù)測(cè)陽(yáng)性治療 應(yīng)答且鑒定處于嚴(yán)重副作用的高風(fēng)險(xiǎn)中的那些個(gè)體。
[0153] 基于生物標(biāo)志的測(cè)試提供'新'個(gè)體的第一線評(píng)價(jià)，并且提供使用目前測(cè)量無(wú)法實(shí) 現(xiàn)的準(zhǔn)確且快速診斷的客觀測(cè)量。
[0154] 此外，診斷生物標(biāo)志測(cè)試可用于鑒定患有輕度的或無(wú)癥狀疾病，或可能處于發(fā)生 有癥狀疾病的高風(fēng)險(xiǎn)中的家庭成員或個(gè)體。這允許起始適當(dāng)治療，或預(yù)防措施，例如管理危 險(xiǎn)因素。這些方法公認(rèn)改進(jìn)結(jié)果且可能預(yù)防病癥的明顯發(fā)作。
[0155] 生物標(biāo)志監(jiān)控方法、生物傳感器和試劑盒作為個(gè)體監(jiān)控工具也是極其重要的，以 使得醫(yī)生能夠確定復(fù)發(fā)是否是由于病癥的惡化。如果藥理學(xué)治療被評(píng)價(jià)為不充分的，則治 療可以恢復(fù)或增加；如果適當(dāng)，則可以給予治療中的改變。因?yàn)樯飿?biāo)志對(duì)病癥的狀態(tài)敏 感，所以它們提供藥物治療影響的指示。
[0156] 本發(fā)明現(xiàn)在將參考下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明。
[0157] 實(shí)施例1 從5個(gè)健康個(gè)體、3個(gè)患有結(jié)腸癌的個(gè)體、6個(gè)患有肺癌的個(gè)體和2個(gè)患有胰腺癌的個(gè) 體獲得血清樣品。在馬血清中系列稀釋通過(guò)由Hela細(xì)胞提取的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的商購(gòu)可 得的核小體制劑，其中核小體中的DNA和蛋白質(zhì)是交聯(lián)的用于穩(wěn)定性。根據(jù)Holdenrieder 的方法（*Holdenrieder等人；2001)制備人血中的核小體制劑。這些樣品和制劑通過(guò)本發(fā) 明的方法對(duì)于核小體-EZH2加合物一式兩份地進(jìn)行測(cè)定。生產(chǎn)用于組織培養(yǎng)的商購(gòu)可得的 純馬血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對(duì)照樣品進(jìn)行測(cè)定。
[0158] ELISA方法如下使用結(jié)合完整核小體的固相抗組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克 隆抗EZH2檢測(cè)抗體：將在0. 1M磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中的抗組蛋白抗體溶液加入微量滴定 孔（100 μ?7孔）中，并且在4°C下溫育過(guò)夜，以用捕獲抗體包被孔。傾倒過(guò)量的抗組蛋白抗 體。將牛血清白蛋白溶液（20g/L)加入孔（200 μ?7孔)中，并且在室溫下溫育30分鐘，以封 閉孔上的過(guò)量蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。傾倒過(guò)量牛血清白蛋白溶液，并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?ν孔，含有1% Tween 20的0. 05Μ TRIS/HC1緩沖液pH 7. 5)洗滌三次。將血清樣品（10 μ?ν 孔）和測(cè)定緩沖液（50 μ?7孔，含有0. 9% NaCl、0. 05%脫氧膽酸鈉和1% Nonidet Ρ40代用品 的0. 05M TRIS/HC1 pH 7. 5)加入在4°C下溫育過(guò)夜的孔中。傾倒血清和測(cè)定緩沖液混合物， 并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入生物素化的抗EZH2檢測(cè)抗體溶液（50 μ?ν孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育90分鐘。傾倒過(guò)量檢測(cè)抗體，并且再次將孔用洗 滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入含有鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶綴合物的 溶液（50 μ?7孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育30分鐘。傾倒過(guò)量綴合物，并且再次將孔 用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入有色底物溶液（100 μ?7孔，2, 2' -連氮雙[3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育20分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)微 量滴定板閱讀器，在405nm的波長(zhǎng)處測(cè)量孔的光密度（0D)。觀察到隨著核小體-ΕΖΗ2加合 物濃度增加而增加顏色的劑量應(yīng)答曲線，其中在不存在核小體加合物的情況下（馬血清）觀 察到低本底信號(hào)。陽(yáng)性ELISA信號(hào)指示通過(guò)ELISA檢測(cè)到的EZH2摻入包含組蛋白和EZH2 的核小體-EZH2加合物內(nèi)，因?yàn)椋╥ )捕獲抗體結(jié)合樣品中的組蛋白，和（ii )檢測(cè)抗體結(jié)合加 合物的EZH2組分。結(jié)果顯示于圖1和2中。
[0159] 實(shí)施例2 從5個(gè)健康個(gè)體、3個(gè)患有結(jié)腸癌的個(gè)體、6個(gè)患有肺癌的個(gè)體和2個(gè)患有胰腺癌的個(gè) 體獲得血清樣品。在馬血清中系列稀釋通過(guò)由Hela細(xì)胞提取的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的商購(gòu)可 得的核小體制劑。根據(jù)Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等人；2001)制備人血中的核 小體制劑。這些樣品和制劑通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)于核小體-HMGB1加合物一式兩份地進(jìn)行 測(cè)定。純馬血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對(duì)照樣品進(jìn)行測(cè)定。
[0160] ELISA方法如下使用結(jié)合完整核小體的固相抗組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克 隆抗HMGB1檢測(cè)抗體：將在0. 1M磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中的抗組蛋白抗體溶液加入微量滴定 孔（100 μ?7孔)中，并且在4°C下溫育過(guò)夜，以用捕獲抗體包被孔。傾倒過(guò)量抗組蛋白抗體。 將牛血清白蛋白溶液（20g/L)加入孔（200 μ?7孔）中，并且在室溫下溫育30分鐘，以封閉 孔上的過(guò)量的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。傾倒過(guò)量牛血清白蛋白溶液，并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔，含有1% Tween 20的0. 05M TRIS/HC1緩沖液pH 7. 5)洗滌三次。將血清樣品（10 μ?7 孔）和測(cè)定緩沖液（50 μ?7孔，含有0. 9% NaCl、0. 05%脫氧膽酸鈉和1% Nonidet Ρ40代用品 的0. 05M TRIS/HC1 pH 7. 5)加入在4°C下溫育過(guò)夜的孔中。傾倒血清和測(cè)定緩沖液混合物， 并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入生物素化的抗HMGB1檢測(cè)抗體溶液（50 μ?ν孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育90分鐘。傾倒過(guò)量檢測(cè)抗體，并且再次將孔用洗 滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入含有鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶綴合物的 溶液（50 μ?7孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育30分鐘。傾倒過(guò)量綴合物，并且再次將孔 用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入有色底物溶液（100 μ?7孔，2, 2' -連氮雙[3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽)，并且在室溫下伴隨輕微攪動(dòng)溫育20分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)微量 滴定板閱讀器，在405nm的波長(zhǎng)處測(cè)量孔的光密度（0D)。觀察到隨著核小體-HMGB1加合物 濃度增加而增加顏色的劑量應(yīng)答曲線，其中在不存在核小體加合物的情況下(馬血清）觀察 到低本底信號(hào)。陽(yáng)性ELISA信號(hào)指示通過(guò)ELISA檢測(cè)到的HMGB1摻入包含組蛋白和HMGB1 的核小體-HMGB1加合物中，因?yàn)椋╥ )捕獲抗體結(jié)合樣品中的組蛋白，和（i i )檢測(cè)抗體結(jié)合 加合物的HMGB1組分。結(jié)果顯示于圖3和4中。
[0161] 在更大型的實(shí)驗(yàn)中，從25位患有結(jié)腸癌的患者、25位患有乳腺癌的患者和24位患 有肺癌的患者獲得血清樣品，以及來(lái)自31個(gè)健康個(gè)體的樣品。樣品就核小體-HMGB1水平 進(jìn)行測(cè)試，使用平均健康結(jié)果加上平均值中的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為截止，對(duì)于結(jié)腸癌、乳腺癌和 肺癌獲得下述結(jié)果： ?結(jié)腸：檢測(cè)到76%的癌癥（25位患者中的19位）和90%特異性(來(lái)自31個(gè)健康樣品 的3個(gè)假陽(yáng)性）； ?乳腺：檢測(cè)到96%的癌癥（25位患者中的24位）和90%特異性(來(lái)自31個(gè)健康樣品 的3個(gè)假陽(yáng)性）；和 ?肺：檢測(cè)到100%的癌癥（24位患者中的24位)和86%特異性(來(lái)自28個(gè)健康樣品的 4個(gè)假陽(yáng)性）； 其中測(cè)量的高于截止水平的核小體-HMGB1加合物水平視為陽(yáng)性結(jié)果，并且較低水平 視為陰性結(jié)果。結(jié)果顯示于圖5中。
[0162] 核小體-HMGB1加合物水平的測(cè)定也以反向形式進(jìn)行，其中將抗HMGB1抗體包被至 孔作為捕獲抗體，并且使抗核小體抗體生物素化且用作檢測(cè)抗體。這種測(cè)定形式也成功地 檢測(cè)到使用的陽(yáng)性對(duì)照中的核小體-HMGB1加合物（0D405nm=l. 15)，但在馬血清或緩沖液 中則沒(méi)有檢測(cè)到(兩者〇D406nm=0. 13)。
[0163] 實(shí)施例3 使用上文實(shí)施例1的方法進(jìn)行核小體-PR ELISA測(cè)定，除了使用的生物素化的抗體定向 結(jié)合孕酮受體（PR)之外。結(jié)果顯示于圖6中。
[0164] 實(shí)施例4 使用使用上文實(shí)施例1的方法進(jìn)行的核小體-AR加合物ELISA測(cè)定，除了使用的生物 素化的抗體定向結(jié)合雄激素受體（AR)之外，測(cè)定得自?xún)蓚€(gè)前列腺癌癥患者的血清樣品以及 陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果顯示于圖7中。
[0165] 實(shí)施例5 通過(guò)上又實(shí)施例1的萬(wàn)法，除了使用的生物素化的抗體足向結(jié)合α形式的雌激素受 體（ERa )之外，使用通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法制備的核小體樣品進(jìn)行核小 體-ERa加合物ELISA測(cè)定。結(jié)果顯示于圖8中。
[0166] 實(shí)施例6 通過(guò)由MCF7細(xì)胞提取的染色質(zhì)消化制備核小體樣品，并且通過(guò)ELISA測(cè)定核小 體_ERi3加合物。測(cè)定通過(guò)類(lèi)似于上文實(shí)施例1的方法的方法進(jìn)行，除了測(cè)定使用不同的抗 核小體抗體和定向結(jié)合β形式的雌激素受體（ERi3)的抗體進(jìn)行之外。該測(cè)定以?xún)煞N不同 形式進(jìn)行。在第一形式中，將抗核小體抗體包被到孔上，并且使抗ERi3抗體生物素化。在 第二形式中，將抗ER0抗體包被到孔上，并且使抗核小體抗體生物素化。在兩種形式中測(cè) 定均是成功的。有趣的是，測(cè)定看起來(lái)在如通常在ChIP法中完成的MCF7染色質(zhì)交聯(lián)時(shí)表 現(xiàn)不那么好。結(jié)果顯示于圖9中。
[0167] 實(shí)施例7 通過(guò)上文實(shí)施例6的方法，使用通過(guò)*Holdenrieder等人；2001的方法制備的核小體 樣品進(jìn)行核小體H2AZ-ERi3加合物ELISA測(cè)定，其中將抗ERi3抗體包被到孔上，除了使用 的生物素化的抗體定向結(jié)合組蛋白變體H2AZ，使得僅檢測(cè)含有H2AZ的核小體-ER β加合物 子集之外。使用該方法，其中核小體或核小體組分結(jié)合劑定向結(jié)合特定表觀遺傳信號(hào)結(jié)構(gòu)， 能夠檢測(cè)僅含有該表觀遺傳信號(hào)的特定核小體加合物子集。結(jié)果顯示于圖10中。
[0168] 實(shí)施例8 從12個(gè)健康個(gè)體、3個(gè)患有結(jié)腸癌的個(gè)體、6個(gè)患有乳腺癌的個(gè)體、3個(gè)患有肺癌的個(gè) 體和4個(gè)患有胰腺癌的個(gè)體獲得血清樣品。根據(jù)Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等 人；2001)制備人血中的核小體制劑并在馬血清中連續(xù)稀釋。這些樣品和制劑通過(guò)本發(fā)明 的方法對(duì)核小體-ER3加合物一式兩份地進(jìn)行測(cè)定。生產(chǎn)用于組織培養(yǎng)的商購(gòu)可得的純馬 血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對(duì)照樣品進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定使用上文實(shí)施例1 的方法進(jìn)行，除了使用的檢測(cè)抗體針對(duì)雌激素受體（ERi3 )之外。使用計(jì)算為平均健康結(jié)果 加上平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的截止，3個(gè)結(jié)腸癌樣品中的2個(gè)、6個(gè)乳腺癌樣品中的3個(gè)、3個(gè) 肺癌樣品中的2個(gè)和4個(gè)胰腺癌樣品中的4個(gè)對(duì)于核小體-ERi3加合物發(fā)現(xiàn)是陽(yáng)性的。結(jié) 果顯示于圖11中。
[0169] 實(shí)施例9 使用上文實(shí)施例6的方法進(jìn)行核小體-雌激素受體-類(lèi)固醇雌激素 ELISA測(cè)定，除了 使用的檢測(cè)抗體針對(duì)類(lèi)固醇雌激素之外。該測(cè)定因此僅檢測(cè)另外含有類(lèi)固醇激素的核小 體-雌激素受體加合物。
[0170] 實(shí)施例10 使用類(lèi)似于上文實(shí)施例的方法進(jìn)行核小體-雌激素受體-雌激素加合物ELISA測(cè)定， 除了下述之外：測(cè)定在對(duì)有機(jī)溶劑是抗性的微量滴定板或管中進(jìn)行，在抗核小體抗體在孔 表面上捕獲核小體-雌激素受體加合物后，傾倒孔的液體內(nèi)含物，并且加入二乙醚以溶解 捕獲的加合物中存在的任何類(lèi)固醇。將醚轉(zhuǎn)移至另一個(gè)孔或管并干燥。將干燥提取物再 溶解于測(cè)定緩沖液中，并且使用用于雌激素分析的經(jīng)典競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定方法測(cè)定雌激素濃 度。該測(cè)定因此僅檢測(cè)另外含有雌激素的核小體-雌激素受體加合物。
[0171] 實(shí)施例11 使用上文實(shí)施例10的萬(wàn)法進(jìn)彳丁核小體-視黃酸受體-視黃酸ELISA測(cè)足，除了使用的 類(lèi)固醇競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定針對(duì)視黃酸之外。該測(cè)定因此僅檢測(cè)另外含有類(lèi)固醇視黃酸的核小 體-視黃酸受體加合物。
[0172] 實(shí)施例12 進(jìn)行類(lèi)似于實(shí)施例1-10中所述的那些核小體加合物測(cè)定，除了使用的固相包被抗體 針對(duì)5-甲基胞苷之外。這些測(cè)定因此僅檢測(cè)核小體-激素受體加合物和另外與甲基化DNA 相關(guān)的核小體-激素受體-激素復(fù)合加合物。
[0173] 參考文獻(xiàn) Allen 等人4 A simple method for estimating global DNA methylation using tjisulfile PCR of repetitive DNA eiemenls^ Nucleic Acids Research: 32(3) e38DOI: 10^1093/nar/gnh032, 2004 Bawden A., Detection of histone modification in ceil-free nucleosomes^ WO 2005/019826, 2005 Cao tf Λ. Rote of Histone H3 Lysine 27 Methylaiion in Polycomb-Group Silencing SCIENCE 298, 1039-1043, 2002 Dai'*$ 人，Detedicm erf Post-translattonal Modifications on Native iniact Nucleosornes by ELISA^ http://wwwj〇￥exom/delaits^php?id=2593 doi; 10 3791/2593 J Vis Exp 50 (2011) Esleller, Cancer epigeoomics; DNA methylomes and Nslooe-modificalion maps Nature Reviews Genetics: 8, 286-298. 2007 Feinberg |ti Vogelstein, Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature: 301, 89-92, 1983 ful!grabe,'| 4,Histoneonco-modifications^ Oncogene: 30, 3391-3403, 2011 Gertiiz ^f'A.The dynamics of HMG protein-chromatin interactions in living ceils. Biochem Cel! BioL 8?. 127-137. 2009 Gartzmann $人，Sensitive Detection of Cotoreetal Cancer in Peripheral Blood by Septn 9 DNA Methylation Assay PLoS ONE 3(11): e3759-doi: 10,1371 /journa I ^ pone.0003T59, 2008 Herranz |il Esteiler, DNA methylation and histone modifications in subjects wiih cancer; potential prognostic and therapeutic iargets^ Methods Mol Biol,361:25-62, 2007 Hervouetl 人，Disruption of Dr?mt1/PCNA/LfHRF*Unteractions Promotes Tumorigenesis from Human and Mice Glial Celts PLoS ONE 5(8}: e11333. doi: 10.1371/journal pone.0011333, 2010 Holdenfieder *5:人，Nudeosomes in serum of subjecls wtth benign and malignant diseases. Ini J. Cancer (Pred Oncol.}; 95, 114-120, 2001 ?HoWenrieder 等人，Nucleosornes in Serum as a Marker for Cell Death, CBn Chem Lab Mecf. 39(7). 596-605. 2001 Hoidenfieder-? A. Cell-Free DNA in Serum and Plasma: Comparison of ELISA and Quantitative PCR. Clinical Chemistnsf： 51(8). 1544-1546,2--5 Holdenrieder Slieber, Clinical use of circulating nudeosomes. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences; 46(1); 1-24? 2009 Ricte fll B?etmsky, Easy detection of chromatin bindirtg proteins bf the histone association assay. Biol Proced Online, 7(1). 60-69.2005 Rodfiguez-Paredes |I! Esteller, Cancer epigenetics reaches mainstream oncology^ Nature Medicine: 17(3), 330-339, 2011 Salgamelf Λ?Αη EUSA for defection of apoptosis, Nucleic Acids Research, 25(3), 680-681. 1997 Sims 1 人，HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer. Amu, Ret Immunol. 28, 367-338, 2010 Stoetzer^f A., Circulating nucteosomes and biomarkers of immunogerifc cel! death as predictwe and prognostic markers in cancer patients undergoing cytotoxic therapy. Expert Opin Biol Ther. 12(Suppl. 1): S217-S224, 2012 Tang If 人，High-mobity Group Box 1 [HMGB1] and Cancer- Biochim BSophys Ada 17990-2) 131, 2010 Urbonaviciijte 人，Induction erf inflammatory and immune responses by HMGB1 - nucleosome complexes: implications for the pathogenesis of SLE J Exp Med, 205<13》，3007-3018, 2008 Urbonavidute fll Voll, High-mobility group box 1 represents a potential marker of disease and novel therapeutic target in systemic lupus erythematosus. J Internal Medicine, 270, 309-318, 2011 van Mieuwenhu_人.Time between onset oi apoptosis and release of nudeosomes from apoptotic cells: putative implications for sysytemic lupus eiythemalosus, Ann Rheum Dis; 62; 10-14, 2003 Yoshida fll Shimura, Isolation of norrtston? chromosomal protein from calf thymus^ Bioctiirriica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure; 263(3), 690-695, 1972
【權(quán)利要求】
1. 核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標(biāo)志用于診斷癌癥、自身免疫疾病或炎性 疾病的用途。
2. 如權(quán)利要求1中限定的用途，其中所述生物標(biāo)志用于診斷癌癥。
3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中限定的用途，其中所述核小體-蛋白質(zhì)加合物包括染 色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。
4. 如權(quán)利要求2中限定的用途，其中所述核小體-蛋白質(zhì)加合物包括高速泳動(dòng)族蛋白。
5. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述染色質(zhì)修飾酶是組蛋白乙?；⑷ヒ阴；⒓?基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、蘇素化、去蘇素化或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 酶。
6. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述核受體是雌激素受體、雄激素受體、孕酮受 體、甲狀腺激素受體、糖皮質(zhì)激素受體或視黃酸受體。
7. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述激素是甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素或類(lèi)固醇激 素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮質(zhì)類(lèi)固醇或視黃酸。
8. 用于檢測(cè)樣品中核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法，其包括下述步驟： (i) 使所述樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使所述核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合 的蛋白質(zhì)； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與所述樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為所述樣品中核小體加合物的存在的量度。
9. 用于檢測(cè)樣品中核小體加合物的存在的方法，其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使所述核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組 分； (iii) 檢測(cè)或定量所述第二結(jié)合試劑與所述樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類(lèi)結(jié)合的存在或程度作為所述樣品中核小體加合物的存在的量度。
10. 如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9中限定的方法，其中所述核小體加合物包括促炎蛋白、 高速泳動(dòng)族蛋白、多梳蛋白、染色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。
11. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述高速泳動(dòng)族蛋白是HMGB1。
12. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述染色質(zhì)修飾酶是EZH2。
13. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述激素受體是雌激素受體、雄激素受體、孕酮 受體、甲狀腺激素受體或視黃酸受體。
14. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述激素是甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素或類(lèi)固醇 激素，包括雌激素、雄激素、孕激素或視黃酸。
15. 如權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述核小體或核小體組分結(jié)合劑定 向結(jié)合特定表觀遺傳信號(hào)結(jié)構(gòu)，使得僅檢測(cè)含有所述表觀遺傳信號(hào)結(jié)構(gòu)的核小體加合物的 特定子集。
16. 如權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述結(jié)合試劑是抗體、抗體片段或 適體。
17. 如權(quán)利要求8-16中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述樣品是生物流體。
18. 如權(quán)利要求8-17中任一項(xiàng)中限足的萬(wàn)法，其中所述樣品是血液或血清或血漿。
19. 如權(quán)利要求8-18中任一項(xiàng)中限定的用于檢測(cè)細(xì)胞中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存 在的方法，其包括下述步驟： (i) 從細(xì)胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解所述染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體； 和 (iii) 如權(quán)利要求8-18中任一項(xiàng)的方法中限定的，檢測(cè)或測(cè)量所述核小體加合物的存 在。
20. 用于檢測(cè)或診斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測(cè)或測(cè)量個(gè)體的體液中的核 小體加合物；和 (ii)使用檢測(cè)到的所述核小體加合物水平來(lái)鑒定所述個(gè)體的疾病狀態(tài)。
21. 用于評(píng)價(jià)動(dòng)物或人個(gè)體對(duì)醫(yī)學(xué)治療的適合性的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測(cè)或測(cè)量所述個(gè)體的體液中 的核小體加合物；和 (ii)使用檢測(cè)到的所述核小體加合物水平作為選擇所述個(gè)體的合適治療的參數(shù)。
22. 用于監(jiān)控動(dòng)物或人個(gè)體的治療的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測(cè)或測(cè)量所述個(gè)體的體液中 的核小體加合物； (ii) 在一個(gè)或多個(gè)場(chǎng)合重復(fù)所述個(gè)體的體液中的核小體加合物的檢測(cè)或測(cè)量； (iii) 使用檢測(cè)到的所述核小體加合物水平中的任何改變作為所述個(gè)體的狀況中的任 何改變的參數(shù)。
23. 如權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)中限定的方法，其中檢測(cè)或測(cè)量所述核小體加合物作 為一組測(cè)量之一。
24. 如權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)中限定的方法，其用于在患有實(shí)際或可疑癌癥、良性腫 瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、傳染病、膿毒癥、中風(fēng)或心肌梗塞的個(gè)體中。
25. 如權(quán)利要求8-24中任一項(xiàng)中限定的方法，其用于檢測(cè)激素-激素受體-核小體復(fù) 合加合物。
26. 如權(quán)利要求25中限定的方法，其中所述激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物包含 甲狀腺素-甲狀腺激素受體-核小體復(fù)合加合物、三碘甲狀腺原氨酸-甲狀腺激素受體-核 小體復(fù)合加合物、視黃酸-視黃酸受體-核小體復(fù)合加合物、雄激素-雄激素受體-核小體 復(fù)合加合物或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物。
27. 如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26中限定的方法，其包括定向結(jié)合所述激素的抗體或其 他結(jié)合劑。
28. 如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26中限定的方法，其包括從抗體捕獲的激素-激素受 體-核小體復(fù)合加合物中提取所述激素的步驟，隨后為定量步驟。
29. 鑒定核小體加合物生物標(biāo)志用于檢測(cè)或診斷動(dòng)物或人個(gè)體中的疾病狀態(tài)的方法， 其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測(cè)或測(cè)量所述個(gè)體的體液中 的核小體加合物； (ii) 檢測(cè)或測(cè)量健康個(gè)體或?qū)φ諅€(gè)體的體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對(duì)照個(gè)體中檢測(cè)到的水平之間的差異，來(lái)鑒定核小體加合物是否 可用作所述疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志。
30. 生物標(biāo)志，其由如權(quán)利要求29中限定的方法鑒定。
31. 用于檢測(cè)核小體加合物的試劑盒，其包括對(duì)于所述加合物或其組成部分中的蛋白 質(zhì)、或所述加合物或其組成部分中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異性的配體或結(jié)合劑， 連同依照權(quán)利要求3-28中限定的任何一種方法的所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104067125SQ201280060149
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月7日
【發(fā)明者】J.V.米卡萊夫, M.E.?？巳R斯頓, M.赫佐格 申請(qǐng)人:新加坡意志私人有限公司