專利名稱：：作為檢測早期免疫激活的標記物的tirc7的制作方法作為檢測早期免疫激活的標記物的TIRC7本發(fā)明涉及通過檢測T細胞免疫應(yīng)答cDNA7(TIRC7)來診斷早期免疫激活的方法。特別地，本發(fā)明提供了作為用于在非侵襲性診斷方法中檢測移植排斥的早期生物標記物的TIRC7，所述診斷方法通過用于在移植后進行監(jiān)測的簡單診斷方法取代活組織檢查干預(yù)(biopsyintervention)。此外，本發(fā)明涉及用于此類i貪斷方法的試劑盒。T細胞激活是涉及多個信號轉(zhuǎn)導途徑和基因表達的連續(xù)性改變從而導致T細胞分化成不同的亞群(即Thl和Th2)的系列過程，所述亞群可通過它們的細胞因子產(chǎn)生模式來區(qū)分并且表征所述細胞免疫應(yīng)答的模式。T細胞應(yīng)答由抗原特異性T細胞受體(TCR)與抗原遞呈細胞用引發(fā)。由通過許多統(tǒng)稱為共刺激信號(Perez，Immunity6(1997)，411-417)的膜蛋白例如CD28/CTLA4和B7、CD40/CD40L、LFA-1和ICAM-1(Lenschow，Science257(1992)，789-792;Linsley，A腿.Rev.Immunol.11(1993)，191-212;Xu，Immunity1(1994)，423-431;Bachraann，Immunity7(1997)，549-557;Schwartz,Cell71(1992)，1065-1068)介導^受體-配體相互作用的網(wǎng)絡(luò)提供另外的信號。這些膜蛋白可以以不同的方式改變T細月包的激活(Bachmann，Immunity7(1997)，549-557)和通過整合由這些分子提供的正信號和負信號來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答(Bluestone，Immunity2(1995)，555-559;Perez,Immunity6(1997)，411-417)。在調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答中有效的許多試劑可干擾T細胞受體(Cosimi，Transplantation32(1981)，535-539)阻斷共刺激信號轉(zhuǎn)導(Larsen，Nature381(1996)，434-438;BlazarJ.Immuno.157(1996)，3250-3259;Kirk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997)，8789-8794;Linsley，Science257(1992)，792-95;Turka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，11102-11105)或抑制這些原始細胞膜觸發(fā)器下游的細胞內(nèi)活化信號(Schreiber和Crabtree,ImmunologyToday13(1992)，136-42)。器官移植和自身免疫性疾病中T細胞激活的治療性預(yù)防目前依賴于干擾下游細胞內(nèi)事件的泛免疫抑制(pan-immu廳upressive)藥物。免疫應(yīng)答的特異性調(diào)節(jié)和檢測(例如移植治療中的)仍然是在免疫學研究中的長期目標。例如，急性排斥(aRx)對腎同種異體移植物的長期結(jié)果具有重大影響，并且其診斷依賴于同種異體移植物活組織檢查的侵襲性方法。新的免疫抑制方案已減少了發(fā)生率但還未消除該問題。此外，現(xiàn)在在門診患者中，在移植后數(shù)周更頻繁地看到aRx。用于預(yù)測aRx的的非侵襲性診斷檢測可改善管理(management)和結(jié)果。因此，存在對早期生物標記物和非侵襲性診斷方法的需要，所述生物標記和非侵襲性診斷方法用于檢測免疫應(yīng)答的激活，特別是對于其中免疫應(yīng)答的激活涉及疾病或病癥例如移植排斥的情況的檢測。通過提供在權(quán)利要求中表征的和下面進一步描述的實施方案實現(xiàn)了對該技術(shù)問題的解決。因此，本發(fā)明涉及診斷早期和/或不希望的免疫應(yīng)答的優(yōu)選的非侵襲性方法，所述方法包括分析T細胞免疫應(yīng)答cDM7(TIRC7)在樣品中的表達。如根據(jù)本發(fā)明使用的，術(shù)語"TIRC7"，也稱為T細胞免疫調(diào)節(jié)劑l(TCIRGl)，是指參與T細胞激活和/或增殖的信號轉(zhuǎn)導的蛋白和，優(yōu)選以可溶性形式存在的、能夠抑制或壓制響應(yīng)混合淋巴細胞培養(yǎng)中的異構(gòu)激活(alloactivation)或響應(yīng)有絲分裂原(當向培養(yǎng)物中外源加入有絲分裂原時)的T細胞增殖的蛋白。體外翻譯的TIRC7蛋白能夠有效地以劑量依賴性的方式抑制響應(yīng)混合淋巴細胞培養(yǎng)中的異構(gòu)激活或響應(yīng)有絲分裂原的T細胞的增殖。TIRC7對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且描述于，尤其是，W099/11782和Utku等人，Immunity9(1998)，509-518和Heinemann等人，Genomics57(1999)，398-406中。核苷酸和氨基酸序列也描述于國際申請W099/11782和Heinemann等人(1999)，同上。因此，本發(fā)明已描述了T和B細胞上的新的細胞表面分子(Utku等人，J.Inmumol.173(2004)，2342-2352)。使用不同動物模型的TIRC7的抗體靶向顯示通過在T細胞上誘導CTLA4和減少CD"的表達對腎臟或心臟同種異體移植物的器官排斥產(chǎn)生了有效的預(yù)防(Utku等人，Immunity9(1998)，509-518;Kumamoto等人，Am.J.Transplant4(2004)，505-154)。根據(jù)本發(fā)明，可確定T細胞免疫應(yīng)答cDNA7(TIRC7)TIRC7在外周血淋巴細胞中在早期免疫激活時表達，在腎移植后在排斥之前和期間在炎性細胞中和在患有已確立的類風濕性關(guān)節(jié)炎的患者的關(guān)節(jié)中持續(xù)被誘導。此外，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)體液例如尿中的TIRC7的表達符合TIRC7表達的組織學檢查；參見實施例1和2。因此，尿中的TIRC7mRNA表達的測量為確定免疫系統(tǒng)的狀態(tài)提供了新的非侵襲性方法。在腎臟移植后對器官排斥的前2天，使用TaqmanPCR方法分析患者的尿中的TIRC7的表達導致發(fā)現(xiàn)TIRC7用作早期生物標記物在早期階段檢測免疫激活(而不使用侵襲性方法例如活組織檢查進行檢測)的有益和有利的用途。在關(guān)于由人體的免疫應(yīng)答引起或攻擊的病癥和疾病的上下文中，這使得可以例如增加或減少各治療的免疫治療劑量，從而最優(yōu)化患者(例如移植物受者)的治療。在該方面，容易理解本發(fā)明的方法也可用于監(jiān)測免疫抑制劑的活性，其中與非治療受試者相比TIRC7的表達的下調(diào)表示被抑制的或非激活的免疫應(yīng)答。換句話說，本發(fā)明也涉及此處描述的用于確定抑制的免疫應(yīng)答的方法。原則上，本發(fā)明的方法可用于其中希望評估免疫應(yīng)答(如果有)的狀態(tài)的任何情況。通常，所述免疫應(yīng)答由傳染性疾病或炎性疾病誘發(fā)。優(yōu)選地，所述炎性疾病是自身免疫性疾病，例如，牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎或移植排斥。在本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是腎移植排斥或類風濕性關(guān)節(jié)炎。從受試樣品獲得基因樣品(geneticsample)?；驑悠钒怂?，優(yōu)選RNA。例如，在確定TIRC7的表達中，人們可從受試樣品獲得mRNA，并且可將該mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA以進行進一步分析。在另一個實施方案中，mRNA自身用于確定TIRC7的表達。在一些實施方案中，可通過確定基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的水平/存在來確定TIRC7的表達水平，從而消除了對從受試樣品獲取基因樣品的需要?？筎IRC7的多克隆抗體和單克隆抗體以及核酸探針描述于例如W099/11782和Utku等人，Immunity9(1998)，509-518;也參見上面。優(yōu)選地存在足夠的受試樣品以獲得大量足以精確和可靠地確定TIRC7的表達水平的基因樣品。在某些實施方案中，為了獲得代表性取樣可采集多個樣品?？赏ㄟ^^f吏用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何技術(shù)(Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1999);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，由Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis編著(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins編著，1984);論文，MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.);其各自在此引用作為參考)從受試樣品獲得基因樣品，例如核酸樣品?？墒褂肈NA或RM純化技術(shù)從完整的細胞純化核酸。也可使用PCR或需要亞克隆的體內(nèi)技術(shù)擴增基因樣品。在優(yōu)選實施方案中，通過從受試樣品的細胞分離mRM，然后將所述RM反轉(zhuǎn)錄成DM以產(chǎn)生cDNA來獲得基因樣品(Khan等人，Biochem.Biophys.Acta1423(1999)，17-28;在此引用作為參考)。一旦獲得受試樣品，可就TIRC7的存在或不存在對其進行分析?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)進行該分析，所述技術(shù)包括，但不限于，序列測定、PCR、RT-PCR、定量PCR、限制性片段長度多態(tài)性、雜交技術(shù)、Northern印跡法、微陣列技術(shù)、MA微陣列技術(shù)等。在確定TIRC7在受試樣品中的表達水平中，可通過與另一種基因例如熟知的、良好表征的基因或管家基因的表達比較來標準化表達的水平；也參見實施例。為了確定特定免疫應(yīng)答的表型或特征，可使用下面實施例中描述的統(tǒng)計學方法分析來自TIRC7的表達數(shù)據(jù)。也可將分析的數(shù)據(jù)用于選擇/描述(profile)患者以進行特定的治療方案。本發(fā)明的方法中的分析表達包括用于檢測TIRC7的表達的任何定性或定量方法，這些方法中的許多方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。所述方法可包括通過使用定量方法測量TIRC7的表達或通過使用定性方法來分析TIRC7的表達。下面描述用于分析多核苷酸和多肽的非限定性方法。優(yōu)選地，使用指向多核苷酸的方法分析表達。因此，在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，樣品包含核酸，其中通過檢測編碼TIRC7的多核苷酸來分析TIRC7的表達，其中TIRC7的表達的增加表示免疫應(yīng)答的激活。本發(fā)明的方法可包括例如從生物樣品提取核酸的步驟。檢測TIRC7核酸靶基因的存在，即其量(如果存在)或不存在。優(yōu)選地，在檢測前擴增核酸。優(yōu)選擴增方法是使用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。在本發(fā)明的一個實施方案中，PCR進一步包括嵌套PCR。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還可包括制備至少兩對與TIRC7核酸的區(qū)域互補的引物。分析TIRC7的存在的方法也可使用生物芯片，或其他微型高通量技術(shù)。生物芯片例如包括生物陣列(bioarray)的生物芯片的生產(chǎn)和用途在本領(lǐng)域是已知的并且可商購獲得；參見，例如，可從Sigma-Genosys(TheWoodlands,TX);Affymetrix(SantaClara，CA)和FullMoonBiosystems(Sunnyvale,CA)商購獲得的生物陣列。關(guān)于生物芯片和生物陣列的綜述參見，例如，Kallioniemi，Ann.Med.33(2001)，142-147;和Rudert，Curr.Opin.Mol.Ther.2(2000)，633-642)?？墒褂妙愃朴谙旅嬗懻摰挠糜跈z測多核苷酸和多肽的常規(guī)技術(shù)的印跡技術(shù)分析這些生物陣列。用于分析基因表達的其他微流裝置和方法，特別是其中可同時分析一個以上的基因的那些裝置和方法和涉及高通量技術(shù)的裝置和方法，可用于本發(fā)明的方法。使用生物陣列對表達水平的定量測量在本領(lǐng)域也是已知的，并且通常包括此處所述的用于測量表達的常規(guī)方法的改進形式。例如，可通過使用砩光體圖像儀(phospohorimager)和成像軟件測量結(jié)合至微陣列的斑點的放射性標記的探針的磷光體像(phosphorimage)來進行該定量。用于分析生物陣列數(shù)據(jù)例如核酸微陣列數(shù)據(jù)的分析生物信息學方法是可獲得的并且描述于現(xiàn)有技術(shù)中；參見，例如，國際申請綱3/067217。本發(fā)明的方法通常使用分離自皮膚樣品的RNA，包括信使RNA(mRM)。所述RNA可以是單鏈或雙鏈的?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)熟知的最適于將模板反轉(zhuǎn)錄成DNA的酶和條件。備選地，可將RNA接受RNA酶保護測定法。也可使用包含各自的一條鏈的DNA-RM雜交體。也可使用多核苷酸的混合物，或可使用利用相同的或不同的引物在之前的擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的多核苷酸。在其中要擴增多核苷酸序列的情況下，所述多核苷酸序列可以是TIRC7的部分，或最初可以以不連續(xù)的分子形式存在，這樣特定的序列是完整的核酸。待擴增的序列最初不必以純的形式存在；其可以是復(fù)合混合物的小部分。此外，如果RM是獲自樣品的多核苷酸，那么可使用RM酶保護測定法。在該方法中，將標記的反義RNA探針與樣品中互補的多核苷酸雜交。通過核酸酶處理降解剩下的未雜交的單鏈探針。雜交的、雙鏈的探針得到保護從而免受RNA酶的降解。在合適的時間后，收集降解反應(yīng)的產(chǎn)物，然后在凝膠上進行分析(參見例如Ausubel等人，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,section4.7.1(1987))。如此處所用的，"RNA探針"是指能夠與目的樣品中的RNA雜交的核糖核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定和改良對于待測量的多核苷酸是特異性的RNA酶保護測定法，例如，可改變探針的特異性，雜交溫度、核酸的量等。另外，許多商業(yè)試劑盒可商購獲得，例如，RiboQuantTMMulti-ProbeRNAseProtectionAssaySystem(Pharmingen，Inc.，SanDiego，CA)。在另一個實施方案中，可通過印跡法通常為Northern印跡法分析樣品中的多核苷酸。為了進行印跡法，在凝膠上分離多核苷酸，然后用針對目的序列的互補多核苷酸探測。例如，將凝膠上分離的RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，然后用針對一個此處公開的黑色素瘤差異診斷基因(melanomadifferentially-diagnosedgene)的互補DNA進行探觀'J。可對互補探針進行放射性、化學等標記。探針的雜交表示存在目的黑色素瘤?？赏ㄟ^使用放射性標記的探針任意地進行多核苷酸的檢測?？墒褂锰峁┳銐蛐盘柕娜魏畏派湫詷擞?。其他標記包括配體、有色染料和熒光分子(其可用作被標記的配體的特異性結(jié)合對成員)等。通過例如Southern或Northern雜交技術(shù)，可將標記的制劑用于探測多核苷酸。將獲自樣品的核苷酸轉(zhuǎn)移至結(jié)合多核苷酸的濾紙。在對標記的、將與包含靶核酸序列的核苷酸片段雜交的多核苷酸探針進行暴露后，通過放射自顯影法鑒定放射性探針對靶核苷酸片段的結(jié)合(參見GeneticEngineering,第l版.RobertWilliamson,AcademicPress(1981)，pp.72-81)。特定的雜交技術(shù)對于本發(fā)明不是必需的。雜交技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知或容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。由于對雜交技術(shù)進行了改進，因此其可用于本發(fā)明的方法。此處公開了用于本發(fā)明的方法的選擇性與TIRC7雜交的本發(fā)明的探針。在優(yōu)選實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法將探針點在生物陣列上。如此處所用的，術(shù)語"選擇性雜交"或"選擇雜交"是指在中等嚴緊或高嚴緊條件下雜交，以使核苷酸序列優(yōu)先于不相關(guān)的核苷酸序列地與選擇的核苷酸序列結(jié)合，達到足以用于檢測TIRC7的表達的程度。要承認，一定量的非特異性雜交是不可避免的，但卻是可接受的，只要對靶核苷酸序列的雜交具有使其可與非特異性交叉雜交相區(qū)分的充分選擇性，如例如由結(jié)合靶核酸分子的經(jīng)標記的寡核苷酸的量確定的，與除了靶分子外的核酸分子特別是除了靶核酸分子外基本上相似(即，同源)的核酸分子相比，至少大約2倍多的選擇性，通常至少大約3倍多的選擇性，通常至少5倍多的選擇性和特別地至少大約IO倍多的選擇性。可通過經(jīng)驗確定，或可基于例如雜交寡核苷酸和其將雜交的序列的相對GC:AT含量、雜交寡核苷酸的長度和寡核苷酸和其將雜交的序列之間的錯配數(shù)目(如果有的話)估計允許進行選擇性雜交的條件(參見，例如，Sambrook等人，"MolecularCloning:Alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989))。漸進增高的嚴緊條件的實例如下2xSSC/0.1%SDS，在大約室溫下(雜交條件)；0.2xSSC/0.1%SDS,在大約室溫下(低嚴緊條件)；0.2xSSC/0.1%SDS,在大約42'C(中等嚴緊條件)；和0.1xSSC,在大約68'C(高嚴緊條件)?？芍皇褂眠@些條件中的一個條件例如高嚴緊條件進行洗滌，或可以以上面列出的順序使用所述條件的各個條件，例如各自進行10-15分鐘，重復(fù)任何或所有列出的步驟。然而，如上面所提到的，最適條件可發(fā)生變化(取決于涉及的特定雜交反應(yīng))，并且可通過經(jīng)驗進行確定。在其被檢測前可擴增編碼TIRC7的多核苷酸。術(shù)語"擴增的"是指從單個多核苷酸分子產(chǎn)生多拷貝的該核苷酸分子的過程?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物化學方法體外進行多核苷酸的擴增。擴增試劑可以是用于完成引物延伸產(chǎn)物的合成的任何化合物或系統(tǒng)，包括酶。用于該目的的合適的酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I、Taq聚合酶、大腸桿菌DM聚合酶I的Klenow片段、T4DM聚合酶、其他可獲得的DNA聚合酶、聚合酶突變體、逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶和其他酶，包括熱穩(wěn)定的酶(即，在接受提高到足以導致變性的溫度后進行引物延伸的酶)。合適的酶可以以適當?shù)姆绞酱龠M核苷酸的組合，從而形成對于各突變核苷酸鏈是互補的引物延伸產(chǎn)物。通常，合成在各引物的3，末端起始并以5，方向沿模板鏈進行，直至合成終止，產(chǎn)生不同長度的分子。然而可存在使用與上述方法相同的方法，于5，末端起始合成并以其他方向進行的擴增試劑。無論如何，本發(fā)明的方法不限定于此處描述的擴增的實施方案?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的體外擴增的一個方法是例如描述于美國專利4，683，202和4，683，195中的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。術(shù)語"聚合酶鏈式反應(yīng)"是指通過使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和兩個寡核苷酸引物擴增DM堿基序列的方法，一個引物與待擴增的序列的一個末端上的(+)-鏈互補而另一個與在另一末端上的(-)-鏈互補。因為新合成的DNA鏈隨后可用作相同引物序列的額外的模板，引物退火、鏈延伸和解鏈的連續(xù)循環(huán)產(chǎn)生希望的序列的快速和高度特異性的擴增。許多聚方法。例如，可將DNA如下經(jīng)歷熱循環(huán)儀中的30至35個擴增循環(huán)95'C進行30秒、52至60X:進行1分鐘，和72C進行1分鐘，和終延伸步驟在72。C下進行5分鐘。例如另一個例子，可將DNA在熱合成儀中經(jīng)歷35個聚合酶鏈式反應(yīng)循環(huán)在95'C的變性溫度下進行30秒，然后在從54至58。C的范圍內(nèi)改變退火溫度，進行1分鐘，在70匸下進行延伸步驟1分鐘和在70。C下進行終延伸步驟。只要引物能夠與目的多核苷酸雜交，可使用任何合適的方法，例如常規(guī)的磷酸三酯和磷酸二酯法或其自動化實施方案制備用于擴增本發(fā)明的多核苷酸的引物。用于在經(jīng)修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的一個方法描述于美國專利4，458，066中。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度、緩沖液和核苷酸組成。引物必須在用于擴增的誘導劑存在的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的引物對于待擴增的核苷酸序列的各鏈是互補的。術(shù)語"互補"是指引物在允許用于聚合作用的試劑起作用的條件下必定與其各自的鏈雜交，換句話說，與側(cè)翼連接序列互補的引物與該側(cè)翼連接序列雜交并且允許核苷酸序列的擴增。優(yōu)選地，被延伸的引物的3，末端具有與互補的側(cè)翼連接鏈完全堿基配對的互補性?？墒褂门c本公開內(nèi)容結(jié)合的已知的方法開發(fā)用于差異表達的TIRC7的引物和探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道也可用于增加靶核酸的拷貝數(shù)的各種擴增方法。可在溶液中或在結(jié)合至固體支持物后，通過用于檢測特定核酸序列的任何方法例如另一種聚合酶鏈式反應(yīng)、寡聚物限制性(Saiki等人,Bio/Technology3(1985)，1008-1012)、等位基因特異的寡核苷酸(allele-specificoligonucleotide)(AS0)探針分析(Conner等人，Proc.Natl,Acad.Sci.USA80(1983)，278)、寡核苷酸連接分析法(OLA)(Landegren等人，Science241(1988)，1077)、RNA酶保護測定法等對本發(fā)明的方法中檢測的多核苷酸進行進一步評估、檢測、克隆、序列測定等。已對用于DNA分析的分子技術(shù)進行了綜述(Landegren等人，Science242(1988)，229-237)。在DNA擴增后，可在不使用放射性探針的情況下，通過Southern印跡分析檢測反應(yīng)產(chǎn)物。在該方法中，例如，擴增從組織或受試者獲得的少量包含多核苷酸的DNA樣品，并通過Southern印跡技術(shù)進行分析。通過高水平的擴增信號促進非放射性探針或標記的使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，一個三磷酸核苷被放射性標記，從而允許通過放射自顯影術(shù)直接看到擴增產(chǎn)物。在中一個實施方案中，對擴增引物進行熒光標記并將其通過電泳系統(tǒng)跑膠。通過激光檢測顯現(xiàn)擴增產(chǎn)物，然后進行計算機輔助圖形顯示，從而無需放射性信號。本發(fā)明的方法可包括實時定量PCR測定法，例如Taqman測定法(Holland等人，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,88(1991)，7276);也參見實施例2。可在設(shè)計用于進行該測定的儀器例如可從AppliedBiosystems(FosterCity，CA)商購獲得的儀器上進行所述測定?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法設(shè)計用于該測定的引物和探針。根據(jù)本發(fā)明的方法，可使用包含分離的產(chǎn)物的凝膠的簡單目測法分析TIRC7。例如，對凝膠進行染色以使分離的多核苷酸可見，許多染料對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。然而，也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法，例如掃描光密度儀、計算機輔助掃描與定量以及其他方法。根據(jù)本發(fā)明用于檢測TIRC7的方法可選擇地使用TIRC7基因的多肽產(chǎn)物的檢測。在這點上，樣品(如此處所述的)可用作分離多肽的來源。特定多肽的測量可用作免疫系統(tǒng)相關(guān)性疾病的檢測、分期、診斷、監(jiān)控、預(yù)測或輔助治療的方法。例如在采集樣品后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過ELISA定量多肽。針對特定多肽的單克隆抗體可用于(例如以液相或結(jié)合至固相栽體的形式)免疫測定法以檢測TIRC7多肽。此外，可以各種方法可檢測地標記這些免疫測定中的單克隆抗體?？墒褂脝慰寺】贵w的免疫測法。此類免疫測定法的實例是放射免疫測定法(RIA)和三明治(免疫測定)分析法。可使用以正向、反向或同步模式進行的免疫測定法(包括對生理樣品的免疫組織化學測定)進行使用單克隆抗體進行的多肽抗原的檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，或可容易地識別其他免疫測定形式而無需過度的實驗。優(yōu)選地，可將識別TIRC7的主要(第三)細胞外結(jié)構(gòu)域的抗體(參見圖1或W099/11782)用于本發(fā)明的診斷方法中。特別有用的抗TIRC7抗體描述于國際申請W003/054018和WO03/054019中。術(shù)語"免疫測定分析法"或"三明治免疫測定法"包括同步三明治、正向三明治和反向三明治免疫測定法。本領(lǐng)域技術(shù)人員明確地理解這些術(shù)語。本領(lǐng)域技術(shù)人員也認識到本發(fā)明的抗體可用于目前已知的或可在將來發(fā)展的測定法的其他變種和形式中。這些變體和形式希望包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？蓪慰寺】贵w結(jié)合至許多不同的載體和用于檢測TIRC7多肽的存在。熟知的載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然的和經(jīng)修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。對于本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可以是可溶性的或不溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于結(jié)合單克隆抗體的其他合適的載體，或能夠使用常規(guī)實驗確定此類栽體。當TIRC7多肽存在于生物學液體中時可用單克隆抗體檢測。在進行測定中，可希望在溫育培養(yǎng)基中包含某些"封閉劑"(通常與標記的可溶性抗體一起加入)。加入"封閉劑"以確保非特異性蛋白對存在于實驗樣品中的抗TIRC7免疫球蛋白不產(chǎn)生交叉連接或破壞固相支持物上的抗體或放射標記的指示劑抗體從而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。因而"封閉劑"的選擇可實質(zhì)性地增加測定的特異性。已發(fā)現(xiàn)許多與用于測定的種類或亞類相同的種類或亞類(同種型)的非相關(guān)(即，非特異性)抗體(例如，IgGl、IgG2a、IgM等)可用作"封閉劑"。為了保持適當?shù)撵`敏度同時還抑制由樣品中相互發(fā)生交叉反應(yīng)的蛋白導致的不想要的干擾，"封閉劑"的濃度(通常1-100lag/ml)可以是非常重要的。如前面所述，樣品優(yōu)選是體液，例如，尿、淋巴、腹水、腦脊髓液、滑膜液、胸膜(腔)積液、痰、糞便、眼淚、汗、膿等。最優(yōu)選地，所述樣品是尿；也參見實施例2。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測受試者的可疑的免疫應(yīng)答的非侵襲性方法。所述方法包括分析樣品(優(yōu)選來自第一時間點和第二時間點的尿液)中TIRC7的表達，和比較第一時間點和第二時間點的表達。時間點可包括任何時間間隔，但通常為至少2周，和更通常至少l個月的間隔。對于某些實施方案，時間點是2個月、3個月、6個月、l年或2年的間隔?？稍谌魏螖?shù)目的時間包括2、3、4、5個等時間點釆集樣品。可使用用于比較數(shù)據(jù)點以評估數(shù)據(jù)中的差異的已知的統(tǒng)計學方法(包括基于時間的統(tǒng)計學方法例如控制繪圖(controlcharting))進行來自不同時間點的表達分析數(shù)據(jù)的比較。可通過將表達水平與截斷值比較或通過比較表達水平的改變以確定它們是否超過截斷改變值(例如百分比改變截斷值)來按時間順序鑒定TIRC7。優(yōu)選在給定的患者中進行上述方法至少2次。在檢測后，可將在給定的患者中看到的結(jié)果與統(tǒng)計學上顯著的正?；颊吆褪茉嚮颊叩膮⒄战M比較。這樣，可能使確定的TIRC7的表達水平與各種臨床狀態(tài)或疾病預(yù)后發(fā)生相聯(lián)。該實施方案特別適合用于監(jiān)控因為例如移植目的而具有被抑制的免疫系統(tǒng)的患者。一些人必須服用免疫抑制藥以預(yù)防轉(zhuǎn)移的器官的排斥或因為他們患有其中免疫系統(tǒng)攻擊身體自身組織的疾病(自身免疫性疾病)；其他人可需要放射治療以治療另一種形式的癌癥。因為這些原因，服用免疫抑制藥或接受放射治療的所有人應(yīng)當每隔一定時間進行TIRC7表達的檢查。因此，本發(fā)明的方法對于這些患者群體特別有利。在其他實施方案中，本發(fā)明的方法特別適合用于在疾病進展期間監(jiān)控自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥。因為TIRC7蛋白的量似乎與疾病的狀態(tài)相關(guān)，在正進行醫(yī)學治療的患者中的TIRC7的檢測可用于治療方法進程的預(yù)后。因此，本發(fā)明的方法包括在遭受例如多發(fā)性硬化癥、脈管炎(vasculititis)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的胂瘤的患者中檢測TIRC7的表達以診斷和更明確地監(jiān)控疾病的進展或消退。更優(yōu)選地，被用于采集樣品以分析TIRC7的表達的體液是溶液(liquor)或血清。此外，TIRC7抗體例如上文中描迷的抗體(特別是其中這些抗體被標記的抗體)的使用是優(yōu)選的。然而，也涉及基于此處描述的技術(shù)的核酸的使用。當然本實施方案特別適合用于定制藥物劑量和施用方案，因為依賴于本發(fā)明的方法的結(jié)果，可施用更高或更低的藥物濃度。例如，如果分別檢測到大量的TIRC7核酸和蛋白，那么可施用更高濃度的藥物和/或以更短的間隔施用藥物。因此，本發(fā)明的方法在避免超劑量和劑量不足地施用給定的藥物中是特別有利的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的方法的試劑盒，其包括一種或多種選擇性結(jié)合TIRC7的核酸或抗體探針或引物；和任意地包4舌檢測工具(means)。也可將寡核苷酸引物點在試劑盒中提供的生物陣列上。該試劑盒可包括皮膚樣品收集裝置和選擇性結(jié)合TIRC7的探針。這樣的試劑盒也可包括經(jīng)劃分從而以封閉限制的方式接受一個或多個容器例如瓶子、試管等的載體工具，容器包含用于本方法的分開的組分(element)的一種組分。如果存在，第二容器可包含裂解緩沖液?？蛇x擇地，試劑盒可包含計算機類型的芯片，在該芯片上，通過電流實現(xiàn)細胞的裂試劑盒也可具有包含探針或引物的容器或包含報告子的容器，所述探針或引物用于可被標記的或可不被標記的靶核酸序列的擴增或與其雜交，所述報告子是例如結(jié)合至報告分子(例如酶、熒光或放射性核素標記)的生物素結(jié)合蛋白(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)。術(shù)語"可檢測標記的脫氧核糖核苷酸"是指與用于檢測脫氧核糖核苷酸的可檢測標記結(jié)合的脫氧核糖核苷酸。例如，可檢測標記可以是放射性標記的核苷酸或共價結(jié)合至核苷酸的小分子(其中所述小分子被良好表征的大分子識別)。這些小分子的實例是被抗生物素蛋白結(jié)合的生物素和被抗甲狀腺素抗體結(jié)合的甲狀腺素。標記的其他方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，包括酶、熒光化合物、化學發(fā)光化合物、發(fā)磷光化合物和生物發(fā)光化合物。試劑盒可包括一種或多種引物對，所述引物對包括選擇性地在一條鏈上結(jié)合TIRC7基因的上游的正向引物，和選擇性地在互補鏈上結(jié)合TIRC7基因的上游的反向引物。隨著新標記被鑒定，可開發(fā)顯示與不同的種族集團或性別、不同的地理分布、不同的疾病分期、不同的特異性程度或不同的敏感性程度最佳作用的不同組合。也可開發(fā)對于治療方案對疾病進展的效果是凈爭別靈敏的標^己纟且合。例3口，已由Kotsch等人，在Transplantation77(2004)，1866-1875中報導了早期和延遲的急性腎同種異體移植物排斥中的增加的顆粒溶素mRM表達，其中描述于第1867和1868頁的材料和方法明確地在此引用作為參考。可在手術(shù)、低體溫癥、免疫治療、細胞因子治療、基因治療、放射治療或化學治療后監(jiān)控患者以確定特定的治療是否有效。因此，本發(fā)明通常涉及此處公開的方法用于確定與免疫應(yīng)答的病癥或早期激活相關(guān)的疾病的風險和/或分期的用途。根據(jù)本發(fā)明的方法診斷的疾病的其他實例包括，但不限于，免疫系統(tǒng)病癥例如炎癥、光化性角化病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、阿狄森氏病、成人呼吸窘迫綜合征、變態(tài)反應(yīng)、強直性脊柱炎、淀粉樣變病、貧血、動脈硬化、哮喘、動脈粥樣硬化、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、支氣管炎、滑嚢炎、膽嚢炎、肝硬化、接觸性皮炎、克羅恩病、異位性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺氣腫、胎兒母紅血球增多癥、結(jié)節(jié)性紅斑、萎縮性胃炎、腎小球腎炎、古德帕斯徹氏綜合征、痛風、突眼性曱狀腺腫、橋本甲狀腺炎、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、肝炎、嗜伊紅細胞增多癥、腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome)、發(fā)作性淋巴細胞減少伴淋巴細胞毒素(episodiclymphopeniawithlymphocytotoxins)、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、心肌或心包炎癥(myocardialorpericardialinflammation)、骨髓纖維化、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、胰腺炎、真性紅細胞增多癥、多發(fā)性肌炎、牛皮痺、萊特爾(氏)綜合征、類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、舍格倫綜合征、全身性過敏反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼齊、系統(tǒng)性硬化病、原發(fā)性血小板增多癥、血小板減少性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎、眼葡萄膜炎、沃納綜合征、癌癥的并發(fā)癥(complicationsofcancer)、血、液透牙斤、和體夕卜循環(huán)、夕卜Y另和造血性癌癥(hematopoieticcancer)包括淋巴瘤、非白血性白血病、和骨髓瘤；生殖病癥例如催乳素產(chǎn)生性病癥、不孕癥包括輸卵管疾病、排卵缺陷(ovulatorydefects)和子宮內(nèi)膜異位、動情周期的打斷、月經(jīng)周期的打斷、多嚢性卵巢綜合征、卵巢過度刺激綜合征、子宮內(nèi)膜或卵巢腫瘤、子宮肌瘤、自身免疫性疾病、異位妊娠、和畸形發(fā)生、乳腺癌、纖維嚢性乳房疾病、和乳溢、精子發(fā)生的破壞、畸形精子生理學、睪丸癌、前列腺癌、良性前列腺增生(癥)、前列腺炎、佩羅尼氏病、陽痿、男性乳腺癌、和男子女性型乳房；神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如癲癇、缺血性腦血管疾病、中風、腦肺瘤、阿爾茨海默病、皮克氏病、亨丁頓舞蹈癥、癡呆、帕金森病和其他錐體外障礙洗眼杯疾病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化和其他神經(jīng)元病癥、進行性神經(jīng)性肌萎縮、色素性視網(wǎng)膜炎、遺傳性共濟失調(diào)、多發(fā)性硬化癥和其他脫髓鞘性病、細菌引起的腦膜炎和病毒性腦膜炎、腦膿腫、硬腦膜下積膿、硬膜外膿腫、化膿性顱內(nèi)血松性靜脈炎(suppurativeintracranialthrombophlebitis)、脊髓炎和脊神經(jīng)根炎、濾過性毒菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、朊病毒病包括庫魯病、克羅伊茨費爾特-雅各布病，痘攣性假性硬化、和Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征、致命性家族性失眠癥、神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)和新陳代謝疾病、神經(jīng)纖維瘤病、結(jié)節(jié)性硬化、小腦視網(wǎng)膜的成血管細胞瘤病、腦三叉神經(jīng)綜合征(encephalotrigeminalsyndrome)、智力發(fā)育障礙和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他發(fā)育病癥、腦性麻痹、神經(jīng)骨骼病癥、自主神經(jīng)系統(tǒng)病癥、腦神經(jīng)病癥、脊髓疾病、肌營養(yǎng)不良和其他神經(jīng)肌肉障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)病癥、皮肌炎和多發(fā)性肌炎、遺傳性、代謝性、內(nèi)分泌和中毒性肌病、重癥肌無力、周期性麻痹、精神紊亂(精神紊亂)包括情緒、焦慮和精神分裂性障礙、靜坐不能(akathesia)、健忘癥、緊張癥、糖尿病神經(jīng)病變、遲發(fā)性運動障礙、張力障礙、偏執(zhí)型精神病、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和圖雷特(氏)精神障礙；細胞信號轉(zhuǎn)導病癥包括內(nèi)分泌病癥例如由損傷導致的下丘腦和腦下垂體的病癥例如原發(fā)性腦腫瘤、腺瘤、妊娠相關(guān)梗塞、垂體摘除術(shù)、動脈瘤、血管畸形、血栓癥、感染、免疫病癥和由頭部創(chuàng)傷引起的并發(fā)癥；垂體功能亢進相關(guān)病癥包括肢端肥大癥、巨大癥(giantism)、和通常由良性腺瘤引起的不適當抗利尿激素(ADH)分泌(SIADH)的綜合征；曱狀腺功能減退相關(guān)病癥包括甲狀腺腫、粘液(性)水胂、細菌感染相關(guān)性急性甲狀腺炎；甲狀旁腺功能亢進相關(guān)病癥包括Conn病(慢性骨痂增生)；胰臟病癥例如I型或II型糖尿病和相關(guān)的并發(fā)癥；腎上腺相關(guān)病癥例如超常增生、癌，或腎上腺皮質(zhì)腺瘤、堿中毒相關(guān)高血壓；性腺類固醇激素相關(guān)病癥例如在婦女中，異常催乳素的產(chǎn)生、不孕、子宮內(nèi)膜異位、月經(jīng)周期的干擾、多嚢卵巢病、高催乳素血癥、單一性促性腺激素缺乏癥、閉經(jīng)、乳溢、兩性同體、多毛癥和男性化、乳腺癌，和，在經(jīng)絕后的婦女中，骨質(zhì)疏松癥；和，在男性中，萊迪希細胞缺乏、男性更年期、和生殖細胞不發(fā)育癥、萊迪希細胞腫瘤相關(guān)性腺機能亢進病癥(hypergonadaldisordersassociatedwithLeydigcel1tumors)、雄性激素受體缺乏相關(guān)性雄激素抗性(androgenresistanceassociatedwithabsenceofandrogenreceptors)、5a-還原酶的綜合征、和男子女性型乳房；和細胞增殖病癥例如光化性角化病、血管硬化、動脈粥樣硬化、滑嚢炎、肝硬化、肝炎、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、骨髓纖維化、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、真性紅細胞增多癥、牛皮癬、原發(fā)性血小板增多，和癌癥包括腺癌、非白血性白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌，和，特別地，腎上腺、膀胱、骨、骨髓、腦、乳腺、宮頸、膽嚢、神經(jīng)中樞、胃腸道、心臟、腎、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、曱狀旁腺、陰莖、前列腺、涎腺、皮膚、脾臟、睪丸、胸腺、甲狀腺和子宮的癌癥。在其他方面，本發(fā)明涉及治療劑(優(yōu)選免疫抑制劑)用于預(yù)防或治療受試者的上述疾病的任一種的的用途，其中根據(jù)本發(fā)明的診斷方法，所述受試者經(jīng)檢測為陽性。本發(fā)明的描述和實施例公開和包括了這些和其他實施方案。使用例如電子設(shè)備可從公共圖書館和數(shù)據(jù)庫檢索到關(guān)于根據(jù)本發(fā)明使用的任何一種材料、方法、用途和化合物的其他文獻。例如可利用由在美國國立衛(wèi)生研究院的美國國家生物技術(shù)信息中心和/或美國國立醫(yī)學圖書館擁有的公共數(shù)據(jù)庫"聯(lián)機醫(yī)學文獻分析與檢索系統(tǒng)(Medline)"。其他數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址，例如為歐洲分子生物學實驗室(EMBL)的部分的歐洲生物信息研究所(EBI)的數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且也可通過使用國際互聯(lián)網(wǎng)檢索引擎獲得。在Berks,TIBTECH12(1994)，352-364中提供了生物技術(shù)學的專利信息的綜述和用于回顧搜索和最新文獻通報的專利信息的相關(guān)來源的縱覽。在整個本說明書的內(nèi)容中引用了幾份參考資料。所有引用的參考資料(包括在整個本申請中引用的文獻來源、發(fā)行的專利、公布的專利申請書和廠商的詳述、技術(shù)說明書等)的內(nèi)容明確地在此引用作為參考；然而，不承認引用的任何資料對于本發(fā)明確實是現(xiàn)有技術(shù)。上面的公開內(nèi)容通常描述了本發(fā)明。可通過參考下列特定的實施例獲得更完全的理解，所述實施例在此處只是為了說明而提供的，從而不希望限定本發(fā)明的范圍。實施例下面的實施例進一步舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)當解釋為以任何方式限定本發(fā)明的范圍。常規(guī)方法例如此處所用的方法的詳細描述可見于引用的文獻中；也參見"TheMerckManualofDiagnosisandTherapy",第17版，由Beers和Berkow(Merck&Co.,Inc.2003)除非另外指出，本發(fā)明的實踐將使用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、轉(zhuǎn)基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，所述技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。分子遺傳學和基因工程中的方法通常描述于當前版本的MolecularCloning:ALaboratoryManual,(Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress);DMCloning,第I和II巻(Glover編著，1985);OligonucleotideSynthesis(Gait編著，1984);NucleicAcidHybridization(Hames和Higgins編著，1984);TranscriptionAndTranslation(Hames和Higgins編著，1984);CultureOfAnimalCells(Freshney和Alan,Liss，Inc.,1987);GeneTransferVectorsforMammalianCells(Mi1ler和Calos，編著，)；CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology,第3版(Ausubel等人，編著，)；和Recombinant腿Methodology(Wu，編著，AcademicPress)。GeneTransferVectorsForMammalianCells(Mi1ler和Calos，編著，1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsInEnzymology,第154和155巻(Wu等人，編著，)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);論文，MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.，N.Y.);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker,編著，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I至IV巻(Weir和Blackwel1，編著，1986)。本公開內(nèi)容中提及的用于基因操作的試劑、克隆載體和試劑盒可從商業(yè)售主例如BioRad、Stratagene、Invitrogen和Clontech商購獲得。細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)基收集中的一般技術(shù)概述于LargeScaleMammalianCellCulture(Hu等人，Curr.Opin.Biotechnol.8(1997)，148);Serum-freeMedia(Kitano，Biotechnology17(1991)，73);LargeScaleMammalianCellCulture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)，375);和SuspensionCultureofMammalianCells(Birch等人，BioprocessTechnol.19(1990),251);ExtractinginformationfromcDNAarrays,Herzel等人，CHAOS11，(2001)，98-107。圖1:在移植中作為診斷標記物的TIRC7。使用來自腎移植患者的尿樣品進行TaqmanPCR分析的結(jié)果(平均值=0，131，標準差=0,115，n==IO)與無排斥事件的移植患者的尿樣的分析結(jié)果(平均值=0，017,標準差=0，015，n=10)的比較。*靈敏度假定受試者具有疾病，試驗結(jié)果為陽性的概率-通過TP/(TP+FN)估計。**特異性假定受試者不具有疾病，試驗結(jié)果為陰性的概率-通過TN/(TN+FP)估計。實施例舉例說明本發(fā)明。實施例1:作為用于免疫激活的早期檢測的診斷標記物的TIRC7本實驗的目的是檢查TIRC7在各種組織中的表達，從而分析其作為生物標記在早期診斷不希望的免疫應(yīng)答的可能作用。因此，在移植后在人腎同種異體移植的排斥期間，使用特異性單克隆抗體(mAb)檢查TIRC7蛋白在已確立的類風濕性關(guān)節(jié)炎UA)的患者的關(guān)節(jié)組織和滑膜液中以及健康志愿者的靜息和激活的外周血淋巴細胞(PBL)中的表達。通過免疫組織學，在急性排斥的活組織檢查確認的診斷后，使用FITC標記的抗TIRC7mAb通過免疫組織學方法在腎臟同種異體移植物受者(所述受者用基于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑免疫抑制進行治療)的臨床活組織檢查中檢測TIRC7的表達。將從患有類風濕性關(guān)節(jié)(RA)的患者分離的關(guān)節(jié)組織接受使用直接FITC標記的抗-TIRC7mAb的免疫組織化學檢查。使用抗TIRC7mAb對用同種異體抗原激活的PBL進行流式細胞檢測分析。使用多克隆TIRC7特異性抗體在CD4+和CD8+T細胞上確定TIRC7蛋白的表達。用綴合的mAb(CD28,CD45R0)對細胞進行染色，然后通過FACScalibur流式細胞測定儀分析樣品。免疫熒光顯微鏡顯示，從在使用各種試劑(釣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑；FK506/環(huán)孢素A(CyA)、甲基潑尼松龍(MP)和麥考酚酸莫酯(CC))的免疫抑制劑組合療法下具有急性排斥的患者獲得的人組織的淋巴細胞強烈地表達TIRC7(n-5)，而正常腎不顯示任何TIRC7表達。TIRC7mAb染色顯示在獲自膝關(guān)節(jié)樣品的組織中和來自獲自具有已確立的RA的患者的關(guān)節(jié)液的單核細胞中，TIRC7蛋白的表達強烈上調(diào)。在使用對照抗體進行染色的所有實驗中未觀察到染色。在人PBL上，TIRC7主要在對CD4+45RO+28+和CD8+45RO+28+激活的前1個小時內(nèi)被誘導但在CD28-陰性T細胞上較少，表明TIRC7主要在靜息記憶T細胞上表達但在原態(tài)(naive)T細胞和效應(yīng)/記憶T細胞上表達較少。這些實驗表明，在靜息記憶T細胞的體外激活后TIRC7被強烈上調(diào)但在原態(tài)(CD45R0-)和效應(yīng)器/記憶(CD28-)T細胞上上調(diào)較少并且在體內(nèi)，在患有類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者中和在被排斥的腎組織中也如此?？傊?，這些研究表明TIRC7可能適合用于記憶T細胞的耙向和作為免疫激活的診斷標記。實施例2:體液中用于診斷移植排斥的TIRC7的檢測為了調(diào)查在體液中是否可檢測到TIRC7的表達，如果可檢測到，是否檢測到的TIRC7的表達水平可表示免疫應(yīng)答的狀態(tài)，進行本實驗。特別地，本研究的目的是分析TIRC7作為檢測排斥的早期生物標記物物的功能作用，以使能夠用簡單的診斷代替活組織檢查干預(yù)來進行移植后監(jiān)控。因此在移植后在人腎同種異體移植的排斥期間使用特異性單克隆抗體OnAb)在腎移植后的患者的尿中檢查TIRC7的表達。從經(jīng)歷組織學上確認的急性排斥的患者獲得腎活檢樣品(n=5)。從被診斷為已建立的RA的患者獲得關(guān)節(jié)組織和液體單核細胞(fluidmononuclearcells)。用經(jīng)FITC標記的抗TIRC7的mAb對這些組織進行免疫組織學染色。外周血淋巴細胞獲自健康志愿者。用促分裂原培養(yǎng)細胞。隨后用綴合的mAb(CD4、CD8、CD16、CD19、CD28、CD45R0和抗-TIRC7mAb)染色，然后用FACScalibur流式細胞儀進行分析。對于mRNA表達分析，在10.000rpm和4C下對尿離心15分鐘。用1mL磷酸鹽緩沖鹽水洗滌沉淀，然后在14.000rpm下在4X:下離心7分鐘。棄去上清液，使用RNeasyTM試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從沉淀分離總RNA。如近年來由Kotsch等人，Transplantation77(2004),1866-1875所描述的進行cDNA合成和實時RT-PCR。簡而言之，使用ABIPRISM-7700DS系統(tǒng)(AppliedBiosystems)和40個循環(huán)(在95°C下進行15秒的變性和在60°C下進行60秒的退火-延伸)測量IP-10的mRNA。將組蛋白mRNA的基因表達用于式2—a"提供的標準化。使用PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems)設(shè)計所有引物和探針并在InstituteofMedicalImmunology,UniversitatsmedizinChari"，Ber1in確認其的有效性。在Tx后對17個具有aRx事件的患者就個體動態(tài)IP-10mRNA表達分析總共120個尿樣品。通過與來自參照組的raRNAIP-10表達值的算術(shù)平均值(所這值基于來自26個具有穩(wěn)定腎功能患者的85份尿樣品)相比設(shè)定排異反應(yīng)患者的2-a"值(2—脇t法)；參見Kotsch等人(2004),同上。將規(guī)范的來自對照患者的數(shù)據(jù)進一步用于建立2a-置信度。如圖1中所示，從分離自排斥反應(yīng)之前2天具有腎移植的患者的尿中的cDNA看出，TIRC7被誘導。這些結(jié)果表明TIRC7可用作在尿中檢測排異反應(yīng)的早期生物標記物，從而第一次使TIRC7成為檢測早期免疫激活的有用的非侵襲性診斷標記。權(quán)利要求1.診斷早期和/或不希望的免疫應(yīng)答的非侵襲性方法，所述方法包括分析樣品中T細胞免疫應(yīng)答cDNA7(TIRC7)的表達，其中TIRC7的上調(diào)表明存在免疫應(yīng)答的激活。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答由傳染性疾病或炎性疾病誘發(fā)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述疾病是牛皮癉、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎或移植排斥。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述疾病是腎移植排斥或類風濕性關(guān)節(jié)炎。6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中確定蛋白的轉(zhuǎn)錄活性或量。7.權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中樣品包含核酸，和其中通過檢測其編碼性核苷酸來分析TIRC7的表達。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述核酸包含RNA，并且通過分析TIRC7的RNA水平來分析表達。9.權(quán)利要求7或8的任一項，其中通過將核酸應(yīng)用于生物陣列來分析TIRC7的表達。10.權(quán)利要求7至9中任一項的方法，其中核酸是mRNA，并且使用實時逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)擴增所述核酸。11.權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中所述樣品是體液的樣12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述樣品是尿。13.用于權(quán)利要求1至12中任一項的方法的試劑盒，其包括一種或多種選擇性結(jié)合TIRC7的核酸或抗體探針或引物；和任意地包括檢測工具。14.權(quán)利要求13的試劑盒，其還包括從細胞分離和純化mRNA所必需的試劑、用于cDNA的制備的酶和試劑和/或用于核酸的放射化學或發(fā)色團標記的酶和試劑。15.權(quán)利要求13或14的試劑盒，其中所述試劑盒提供作為生物陣列或基因芯片的部分的探針。16.權(quán)利要求1至12中任一項的方法用于確定與免疫系統(tǒng)的病癥或早期激活相關(guān)的疾病的風險和/或分期的用途。17.免疫抑制劑用于預(yù)防或治療權(quán)利要求2至5中任一項定義的疾病的用途，其中根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法檢測遭受或懷疑發(fā)生所述疾病的受試者。全文摘要本發(fā)明提供了通過檢測T細胞免疫應(yīng)答cDNA7(TIRC7)來診斷早期免疫激活的方法。特別地，描述了作為在非侵襲性診斷方法中用于檢測移植排斥的早期生物標記物的TIRC7，所述非侵襲性診斷方法用簡單的診斷方法取代活組織檢查干預(yù)以進行移植后的監(jiān)控。此外，提供了用于此類診斷方法的試劑盒。例如，在腎移植后的尿樣品中檢測TIRC7。文檔編號C07K14/705GK101268373SQ200680022255公開日2008年9月17日申請日期2006年5月17日優(yōu)先權(quán)日2005年5月17日發(fā)明者N·烏特庫申請人:塞爾艾克特制藥有限公司