Apex1作為慢性阻塞性肺?。╟opd）的標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種幫助評估慢性阻塞性肺病（=COPD）的體外方法。它公開蛋白質(zhì)APEX1作為COPD標(biāo)志物的用途。而且，它尤其涉及一種用于自衍生自個體的樣品評估COPD的方法，其通過在體外測量所述樣品中的蛋白質(zhì)APEX1來進(jìn)行。
【專利說明】APEX1作為慢性阻塞性肺病(COPD)的標(biāo)志物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種幫助評估慢性阻塞性肺病(=COPD)的體外方法。它公開蛋白質(zhì)APEXl作為COPD標(biāo)志物的用途。而且，它尤其涉及一種用于自衍生自個體的樣品評估COPD的方法，其通過在體外測量所述樣品中的蛋白質(zhì)APEXl來進(jìn)行。
[0002]發(fā)明背景
[0003]慢性阻塞性肺病(COPD)是一種特征在于慢性炎癥和不可逆氣流阻塞及比正常要快的肺功能參數(shù)FEVl下降的疾病。這導(dǎo)致出入肺的氣流受限，引起呼吸短促。該疾病具有兩個主要的病理方面，即慢性支氣管炎(特征在于來自導(dǎo)引氣道的粘液分泌過多)和肺氣腫(特征在于肺泡中的破壞性變化)。在臨床實踐中，CCffD通過它在肺功能測試上的特征性低氣流來定義(Nathell, L., et al., Respiratory Research8 (2007) 89)。與哮喘形成對比，這種限制可逆性較差且通常隨時間變得日益更差。
[0004]CCffD排在1990年全世界死亡主導(dǎo)原因的第六位。由于許多國家的人口統(tǒng)計學(xué)變化和吸煙率的升高，預(yù)計它到2030年成為全世界死亡主導(dǎo)原因的第四位(Mathers, C.D., et al.,PLoS Med.3 (2006) e442)。COPD是美國死亡主導(dǎo)原因的第4位，而且COPD在2007年在美國在衛(wèi)生保健花費和生產(chǎn)力損失方面的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是426億美元。
[0005]COPD是由有害顆?；驓怏w引起的，最常見來自吸煙，它在肺中觸發(fā)異常炎癥應(yīng)答(Rabe, K.F., et al., Am.J.Respir.Crit.Care Med.176 (2007) 532-555 及 Hogg, J.C., etal.，N.Engl.J.Med.350 (2004) 2645-2653)。更大氣道中的炎癥應(yīng)答稱作慢性支氣管炎，當(dāng)人們經(jīng)?？瘸鎏禃r在臨床上做出它的診斷。在肺泡中，炎癥應(yīng)答引起對肺組織的破壞，即稱作肺氣腫的過程。COPD的天然過程特征在于癥狀的偶爾突然惡化(稱作急性加重)，其大多數(shù)由感染或空氣污染引起。
[0006]COPD的許多癥狀由其它呼吸疾病(諸如哮喘、支氣管炎、肺纖維化和結(jié)核)分享。coro診斷的當(dāng)前黃金標(biāo)準(zhǔn)要求肺功能測試(肺活量測定法)，這是一種費時且昂貴的規(guī)程，只能由專科肺內(nèi)科醫(yī)師實施。例如，肺活量測定法測試高度依賴于患者合作和努力，而且在正常情況下重復(fù)至少三次來確保再現(xiàn)性。
[0007]慢性支氣管炎可以通過詢問患者他們是否具有“排痰性咳嗽”(即產(chǎn)生痰的咳嗽)來診斷。
[0008]哮喘與COPD的區(qū)別在于它的致病和治療應(yīng)答，而且因此應(yīng)當(dāng)認(rèn)定為一種不同的臨床實體。然而，一些哮喘患者發(fā)生可逆性較差的氣流限制，這當(dāng)前與coro患者不可辨別，但是出于實用目的作為哮喘來治療。哮喘和COPD在一般群體中的高流行程度導(dǎo)致這兩種疾病實體在許多個體中共存。這表征為顯著的氣流限制和對支氣管擴(kuò)張劑的較大響應(yīng)。在這些患者中，一秒鐘用力呼氣體積(FEVl)沒有回到正常且常常隨時間惡化。
[0009]已知哮喘患者中的CRP血清水平與正常對照相比顯著更高(Fujita，Μ.，etal., Ann.Allergy Asthma Immunol.99(2007)48-53)。CRP 響應(yīng)多種傳染性和炎性狀況而升高，因此它不是COPD特異性的(Donaldson, G.C., Am.J.Respir.Crit.CareMed.175 (2007) 209-210)。因此，CRP沒有達(dá)到關(guān)于對COPD篩選工具要求的診斷精確性的標(biāo)準(zhǔn)。
[0010]當(dāng)前的COPD檢測方法(即肺活量測定法)看來不適合用作一般篩選工具。肺活量測定法非常昂貴、費時且是衛(wèi)生保健系統(tǒng)對篩選大量受試者中的一般和廣泛使用負(fù)擔(dān)不了的。而且，它的結(jié)果強烈依賴于患者的服從。
[0011]本領(lǐng)域中描述了在COPD中也觀察到肺的多個部分中嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞(具體是⑶8+)的增多，這些與氣流限制的程度有關(guān)(Saetta，M.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.157(1998)822-826)。一些患者中可以有嗜酸性粒細(xì)胞的增多，特別是加重期間(Saetta, M.，et al., Am.J.Respir.Crit.Care Med.150(1994) 1646-1652及 Saetta, M., et al., Clin.Exp.Allergy26 (1996) 766-774)。這些炎癥細(xì)胞能夠釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介導(dǎo)物，最值得注意的是白三烯-4、白介素-8和TNF-α。這種炎癥樣式與在支氣管哮喘患者中看到的顯著不同。炎癥變化可持續(xù)到戒煙之后。不知道解釋這種炎癥應(yīng)答在刺激性事件缺失下的永存性的機制。
[0012]如此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供一種簡單且劃算的COPD評估規(guī)程，例如用于鑒定懷疑具有COPD的個體。為了這個目的，必須找到循環(huán)中存在的、在體液(例如血液、血清或血漿)中可檢測的一般COPD標(biāo)志物。
[0013]為了有臨床效用，作為單一標(biāo)志物的新診斷標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)與本領(lǐng)域已知的其它標(biāo)志物相當(dāng)或更好。或者，無論是單獨使用還是與一種或多種其它標(biāo)志物組合使用，新標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致診斷靈敏度或特異性的改進(jìn)。測試的診斷靈敏度或特異性通過它的接受者操作特征(receiver-operating characteristics)得到最好地評估，這會在下文中詳細(xì)描述。
[0014]全血、血清或血漿是臨床程序中樣品的最廣泛使用來源。會有助于可靠coro檢測或提供早期預(yù)后信息的早期COPD標(biāo)志物的鑒定能導(dǎo)致會大大有助于診斷和管理這種疾病的方法。因此，改進(jìn)COPD的體外評估存在迫切的臨床需要。改進(jìn)COPD的早期診斷尤其重要，因為對于在CODP早期階段診斷的患者，肺損害可逆性的機會與那些在進(jìn)展更多的疾病階段診斷的患者相比要高得多。
[0015]本領(lǐng)域需要鑒定COPD疾病狀態(tài)的可靠且直接指標(biāo)(例如替代標(biāo)志物)，用于可靠地辨別COPD的癥狀與上文所述其它呼吸疾病的癥狀，及預(yù)測疾病嚴(yán)重性的變化、疾病進(jìn)展和對藥物的響應(yīng)。
[0016]本發(fā)明的目標(biāo)是調(diào)查是否能鑒定可用于體外評估COPD的生化標(biāo)志物。特別地，本發(fā)明的發(fā)明人調(diào)查了是否能鑒定用于在體液樣品中評估COPD的生化標(biāo)志物。
[0017]發(fā)明概述
[0018]現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)APEXl的使用至少能部分克服當(dāng)前已知的可用于評估COPD的方法的一些問題。
[0019]令人驚訝地，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)體外測定樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度容許評估COPD0在這個背景中發(fā)現(xiàn)自個體獲得的此類樣品中所述蛋白質(zhì)APEXl的濃度與蛋白質(zhì)APEXl參照濃度相比升高指示COPD的存在。
[0020]本文中公開一種用于評估COPD的體外方法，其包括通過免疫學(xué)檢測方法測定體液樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度并在評估coro中使用測定得到的結(jié)果，特別是測定得到的濃度。
[0021]本發(fā)明還涉及一種用于在受試者中評估慢性阻塞性肺病(COPD)的體外方法，其包括a)測定樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度，并b)將步驟(a)中測定得到的蛋白質(zhì)APEXl濃度與蛋白質(zhì)APEXl的參照濃度比較，其中高于參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示COPD。
[0022]在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)APEXl在樣品中體外評估COPD中的用途，其中高于蛋白質(zhì)APEXl參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示C0PD。
[0023]還公開包括蛋白質(zhì)APEXl和一種或多種其它COPD標(biāo)志物的標(biāo)志物組在樣品中體外評估COPD中的用途，其中高于蛋白質(zhì)APEXl參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示C0PD。
[0024]在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明評估COPD的體外方法用于區(qū)分COPD與其它類型肺病(優(yōu)選哮喘)的用途。
[0025]在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于實行依照本發(fā)明評估COPD的體外方法的診斷裝置。
[0026]還提供一種用于實施依照本發(fā)明評估COPD的體外方法的試劑盒，其包括特異性測定蛋白質(zhì)APEXl的濃度需要的試劑。
[0027]鑒于下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明別的方面和優(yōu)點會是明顯的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實施例，雖然指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是僅僅作為例示給出，因為根據(jù)此詳細(xì)描述，本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的各種變化和變更對本領(lǐng)域技術(shù)人員會變得明顯。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]令人驚訝地，本發(fā)明的發(fā)明人能夠證明標(biāo)志物蛋白質(zhì)APEXl可用于評估C0PD。由于通過現(xiàn)有技術(shù)方法將肺損害(尤其是C0PD)的各個階段分類的不確定性，完全有可能的是蛋白質(zhì)APEXl將來可能成為評估COPD患者的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一。
[0030]本發(fā)明的方法適合于評估C0PD。發(fā)現(xiàn)了樣品中與正常對照相比升高的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示COPD。
[0031]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中評估慢性阻塞性肺病(COPD)的體外方法，包括:a)測定樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度，并b)將步驟(a)中測定得到的蛋白質(zhì)APEXl濃度與蛋白質(zhì)APEXl的參照濃度比較，其中高于參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示 COPD。
[0032]在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中評估慢性阻塞性肺病(COPD)的體外方法，包括:a)測定體液樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度，并b)將步驟(a)中測定得到的蛋白質(zhì)APEXl濃度與蛋白質(zhì)APEXl的參照濃度比較，其中高于參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示COPD的存在。
[0033]ASC, “含有胱天蛋白酶相關(guān)募集域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白”也稱作“甲基化誘導(dǎo)的沉默的靶物I”(TMSl) (Swiss-PROT:Q9ULZ3)。就本發(fā)明而言，特征在于SEQ ID NO:1中給出的序列，ASC蛋白質(zhì)是一種22kDa蛋白質(zhì)。胱天蛋白酶相關(guān)募集域(CARD)介導(dǎo)銜接蛋白(諸如APAFl (凋亡蛋白酶活化因子I))和參與凋亡的胱天蛋白酶(例如CASP9)的原形式(pro-form)之間的相互作用。ASC是包括CARD的銜接蛋白家族的一個成員。在W02006/105252中顯示了 ASC (=CARD_9)的基因表達(dá)水平指示COPD的診斷。
[0034]ARMET (富含精氨酸的，在早期腫瘤中突變的，ARP, Swiss-PROT ID:P55145)蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用和功能仍然在很大程度上難以捉摸。就本發(fā)明而言，特征在于SEQID N0:2中給出的序列，ARMET蛋白質(zhì)是一種20.3kDa蛋白質(zhì)。ARMET蛋白質(zhì)由179個氨基酸組成且攜帶預(yù)測的信號序列(aal-21)。對應(yīng)的基因位于染色體條帶3p21.1中，而且由 Shridhar 等人首次表征(Shridhar, V., et al., Oncogenel2 (1996) 1931-1939)。該基因高度保守且可見于多種哺乳動物物種，像大鼠、小鼠、牛、和倉鼠。ARMET如此命名是因為初始研究提示ARMET在N端要長出50個氨基酸，攜帶富含精氨酸的區(qū)域(Shridhar,V., et al., Oncogene 12(1996) 1931-1939 ；Shridhar, R., et al., CancerRes.56 (1996) 5576-5578 ；Shridhar, V.，et al.，0ncogenel4 (1997) 2213-2216)。然而，更多最近的研究指示不編碼精氨酸束的更小可讀框的轉(zhuǎn)錄證據(jù)(Tanaka, H.，et al.，Oncol.Rep.7(2000)591-593 ;Mizobuchi, N.，et al., Cell Struct.Funct.32(2007)41-50)。憑借對應(yīng)的蛋白質(zhì)大小修正，初始描述的突變密碼子(ATG50)現(xiàn)在鑒定為初始密碼子。Petrova 等人(Petrova, P., et al., J.Mol.Neurosc1.20 (2003) 173-188)自大鼠中腦 I型星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系的條件化培養(yǎng)基純化了 ARMET基因產(chǎn)物，并將其命名為MANF (中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子)。更多最近的研究證明了 ARMET通過“解折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答”(UPR)(—旦錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中積累就被激活的一種過程)而上調(diào)(Tanaka, H., et al., Oncol.Rep.7 (2000) 591-593 ；Apostolou, A., et al., Exp.CellRes.314(2008)2454-2467)?；谶@項研究，ARMET被表征為UPR的適應(yīng)性途徑的一種新型分泌型介導(dǎo)物。
[0035]就本發(fā)明而言，特征在于SEQ ID NO:3中給出的序列，NNMT (煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶；Swiss-PROT:P40261)蛋白質(zhì)是一種29.6kDa蛋白質(zhì)且具有5.56的等電點。NNMT催化煙酰胺和其它吡啶的N-甲基化。這種活性對于多種藥物和異型生物質(zhì)化合物的生物轉(zhuǎn)化是重要的。已經(jīng)報告了該蛋白質(zhì)在肝中優(yōu)勢表達(dá)且位于胞質(zhì)中。NNMT已經(jīng)自來自人肝的cDNA克隆且含有792個核苷酸的可讀框，其編碼264個氨基酸的蛋白質(zhì)，計算分子量為
29.6kDa (Aksoy, S.，et al.，J.Biol.Chem.269 (1994) 14835-14840)。文獻(xiàn)中關(guān)于該酶在人COPD中的潛在作用知道得很少。觀察到NNMT在COPD患者的骨骼肌細(xì)胞中的更高mRNA表達(dá)(Am.J.0f Respiratory and Critical Care Medicine Vol.181(N0.8)，798-805)。在一項研究中已經(jīng)顯示了 NNMT是肺癌(LC)的有用生物標(biāo)志物(J.0f Cancer Res.and Clin.0ne.136(9) (2009) 1223-1229)。在所述研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NNMT的血清水平在LC患者中比在COPD患者和健康供體中要顯著更高。
[0036]就本發(fā)明而言，特征在于SEQ ID NO:4中給出的序列，F(xiàn)lap內(nèi)切核酸酶-1蛋白(=FEN1，F(xiàn)EN-1)，Swiss-PROT ID:P39748是一種380個氨基酸的核蛋白，分子量42.6kDa。人 FENl 的編碼區(qū)是由 Murray 在 1994 年(Murray, J.M., et al., Mol.Cell.Biol.14(1994)4878-4888)自一種新克隆的序列預(yù)測的?；诮湍竿滴飏ad2的功能，提議在高保真染色體分離中及在UV誘導(dǎo)的DNA損害的修復(fù)中的功能。因為這些是染色體完整性中的基本過程，所以作者還提議該蛋白質(zhì)涉及癌癥避免。稍后由Hiraoka等 A(Hiraoka L.R., et al., Genomics25(1995)220-225)和 Taylor 等 A(Taylor, T.D., et al., Nature440 (2006) 497-500)鑒定了人染色體 11 上的基因座。FENl 的功能及其與DNA的相互作用已經(jīng)成為眾多研究的焦點(Robins，P.，et al.，J.Biol.Chem.269(1994)28535-28538 ；Shen,B.，et al.，J.Biol.Chem.271 (1996)9173-9176 ；Hasan, S., et a 1.,Mol.Ce 1 1 7 (2001) 1221-1231 ；Qiu, J., et a 1., J.Biol.Chem.277 (2002) 24659-24666 及 Sakurai, S.，et al.，EMBO J.24 (2005) 683-693)。已經(jīng)證明了在DNA代謝中的數(shù)項酶功能，包括切割當(dāng)DNA聚合酶遭遇下游Okazaki片段5’端時通過置換合成而生成的5’ -懸垂flap結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核酸酶活性。另外，F(xiàn)ENl還擁有針對帶缺刻或帶缺口的雙鏈DNA的5’至3’外切核酸酶活性，而且展現(xiàn)RNA酶H活性。Shen等人(Shen, B., et al., BioEssays27 (2005) 717-729)或 Liu 等人(Liu, Y.，et al., Annu.Rev.Biochem.73(2004)589-615)綜述了這些。
[0037]就本發(fā)明而言，AP內(nèi)切核酸酶(APEX1，APEX-1) (Swiss-Prot.P27695)特征在于SEQ ID NO:5中給出的序列。未加工的前體分子由318個氨基酸組成且具有35.6kDa的分子量。APEXl涉及DNA修復(fù)且切除DNA鏈的無嘌呤或無嘧啶位點。此類無堿基位點自發(fā)地或經(jīng)由化學(xué)劑或通過清除特定異常堿基的DNA糖基化酶相對頻繁生成。
[0038]AP位點是能阻止正常DNA復(fù)制的前誘變損害，因此細(xì)胞含有鑒定和修復(fù)此類位點的系統(tǒng)(Barzilay，G.,and Hickson, 1.D.，Bioessaysl7 (1995) 713-719)。闡明了 3D 結(jié)構(gòu)，而且鑒定了涉及內(nèi)切核酸酶活性的氨基酸(Barizilay, G., et al., Nature StructuralBiology2 (1995) 561-567 ；Gorman, M.A.，et al.,EMBO Journal 16 (1997)6548-6558 ；Beernink, P.，et al.，J.Mol.Biol.307 (2001) 1023-1034)。APEXl 還是多種轉(zhuǎn)錄因子(諸如c-Fos、c-Jun, NF-KB和HIF-1)的氧化還原調(diào)節(jié)劑。這種活性似乎獨立于內(nèi)切核酸酶活性。兩種功能位于該蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域上(Barzilay，G.,and Hickson, 1.D.，Bi0essaysl7 (1995) 713-719)。蛋白質(zhì)激酶C對APEXl的磷酸化提高氧化還原活性，而未憐酸化形式涉及 DNA 修復(fù)(Yacoub, A.，et al., Cancer Res.57 (1997) 5457-5459)。Rush 等A (Rush, J., et al., Nature Biotech.23 (2005) 94-101)鑒定了一個磷酸化位點，Y261 (依照 Swissprot 序列)。
[0039]就本發(fā)明而言,表面表達(dá)蛋白酶(Seprase),也稱作成纖維細(xì)胞激活蛋白(=FAP),是一種具有明膠酶和二肽基肽酶活性的170kDa糖蛋白，由兩個相同的單體Seprase單兀組成(Pineiro-Sanchez, M.L.，et al., J.Biol.Chem.272 (1997) 7595-7601 ；Park, J.Ε., et al.，J.Biol.Chem.274(1999)36505-36512)。人膜結(jié)合 S印rase 蛋白的單體包含760個氨基酸且顯示于SEQ ID N0:6。人S印rase預(yù)測具有成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的頭4個N端殘基，接著是21個殘基的跨膜域，然后是734個殘基的胞外C端催化域(Goldstein, L.A., et al., Biochim.Biophys.Acta.1361 (1997) 11-19 ；Scanlan, M.J., etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91 (1994) 5657-5661 )。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道人 Seprase 蛋白的一種較短形式，即可溶性Seprase或循環(huán)抗纖溶酶切割酶(=APCE) (Lee, K.N.，etal.，Bloodl03 (2004) 3783-3788 ；Lee, K.N.，et al.，Bloodl07 (2006) 1397-1404)，其包含來自Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號Q12884的氨基酸位置26-760?？扇苄許eprase的二聚體是一種l60kDa糖蛋白，由兩個相同的單體可溶性Seprase蛋白單元組成。Pifieiro-Sinchez-等
人(見上文)發(fā)現(xiàn)升高的S印rase表達(dá)與人黑素瘤和癌瘤細(xì)胞的侵入性表型有關(guān)聯(lián)。Henry等人(Henry, L.R.，et al.，Clin.Cancer Res.13(2007) 1736-1741)描述了具有高水平基質(zhì)Seprase的人結(jié)腸腫瘤患者更有可能具有攻擊性疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的潛在發(fā)生。
[0040]就本發(fā)明而言，人二肽基肽酶IV (=DPPIV),也稱作⑶26，是一種IlOkDa細(xì)胞表面分子。人DPPIV蛋白的氨基酸序列包含766個氨基酸且顯示于SEQ ID NO:7(Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號P27487)。它含有內(nèi)在二肽基肽酶IV活性，自在第三個氨基酸位置具有脯氨酸或丙氨酸的肽選擇性消除N端二肽。它與多種胞外分子相互作用，而且還涉及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。人DPPIV的多功能活性取決于細(xì)胞類型和胞內(nèi)或胞外條件，它們影響它作為蛋白水解酶、細(xì)胞表面受體、共刺激相互作用蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)物的作用。人DPPIV具有較短的胞質(zhì)域(氨基酸位置1-6)、跨膜區(qū)(氨基酸位置7-28)、和具有內(nèi)在二肽基肽酶IV(DPPIV)活性的胞外域(氨基酸位置29-766)。人可溶性二肽基肽酶IV (=可溶件DPPIV)氨基酸序列包含來自Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號P27487的氨基酸位置29-766?？扇苄訢PPIV的二聚述是一種170kDa糖蛋白，由兩個相同的單體可溶性DPPIV單元組成。
[0041]就本發(fā)明而言可溶性DPPIV/Seprase蛋白質(zhì)復(fù)合物” (=DPPIV/Seprase)指可溶性DPPIV同二聚體(170kDa)和可溶性Seprase同二聚體(160kDa)形成的可溶性復(fù)合物,分子量330kDa。在某些條件下，這種復(fù)合物可形成具有660kDa分子量的雙重復(fù)合物。
[0042]對熟練技術(shù)人員顯而易見的，本發(fā)明不應(yīng)解釋為限于SEQ ID N0:5之全長蛋白質(zhì)APEXl0本發(fā)明還涵蓋蛋白質(zhì)APEXl的生理或人造片段、蛋白質(zhì)APEXl的次級修飾、以及蛋白質(zhì)APEXl的等位變體。多肽的變體由相同基因編碼，但是它們的等電點(=PI)或分子量(=MW)或二者可以不同，例如由于可變mRNA或前mRNA加工。變體的氨基酸序列與對應(yīng)標(biāo)志物序列95%或更多相同。人造片段優(yōu)選涵蓋合成或通過重組技術(shù)生成的肽，其至少包含一個有診斷興趣的表位，由自SEQ ID NO: 5中公開的序列衍生的至少6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸組成。此類片段可有利地用于生成抗體或用作免疫測定法中的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0043]看來現(xiàn)有技術(shù)不知道體液中蛋白質(zhì)APEXl的存在或水平在評估COPD中具有診斷效用。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)且能確立升高的蛋白質(zhì)APEXl濃度(自衍生自個體的體液樣品測定)指示C0PD。
[0044]除非另外指明，本發(fā)明的實施會采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。文獻(xiàn)中完整解釋了此類技術(shù)，諸如 Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, secondedition, (1989) ；Gait, M.J., (ed.) Oligonucleotide Synthesis(1984) ；Freshney, R.1., (ed.), Animal Cell Culture (1987) ；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1987)及定期更新；Mullis, et al., (eds.)PCR:The Polymerase Chain Reaction(1994)。
[0045]除非另有定義，本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普通理解相同的含義。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology andMolecular Biology, 2nd ed., J.ffiley&Sons, New York, N.Y.(1994) ；March, AdvancedOrganic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed., Johnffiley&Sons, New York, N.Y.(1992) ；Lewin, B., Genes V, published by Oxford UniversityPress (1994), ISBN0-19-8542879 ；Kendrew, J., et al., (eds.), The Encyclopedia ofMolecular Biology, published by Blackwell Science Ltd.(1994)，ISBN0-632-02182-9 ;及 Meyers, R.A.，(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference, published by VCH Publishers, Inc.(1995)，ISBN1-56081-5698)給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了對本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。
[0046]如本文中使用的，下面的每項術(shù)語具有此部分中與其有關(guān)的意義。
[0047]冠詞“一個”和“一種”在本文中用于指一個/種或超過一個/種(即至少一個/種)該冠詞的語法對象。舉例而言，“一種標(biāo)志物”表示一種標(biāo)志物或超過一種標(biāo)志物。術(shù)語“至少”用于指示任選可以存在一個/種或超過一個/種別的對象。[0048]表述“一個/ 種或多個 / 種”指 1-50，優(yōu)選 1-20，還優(yōu)選 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、
或15個/種。
[0049]如本文中使用的，術(shù)語“標(biāo)志物”或“生化標(biāo)志物”指作為靶物用于分析個體的測試樣品的分子。在一個實施方案中，此類分子靶物的例子是蛋白質(zhì)或多肽。用作本發(fā)明中的標(biāo)志物的蛋白質(zhì)或多肽包括所述蛋白質(zhì)的天然存在變體以及所述蛋白質(zhì)或所述變體的片段，特別是免疫學(xué)可檢測片段。免疫學(xué)可檢測片段優(yōu)選包含所述標(biāo)志物多肽的至少6、7、
8、10、12、15或20個連續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，例如，在炎癥期間，由細(xì)胞釋放的或胞外基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)可能受到損傷，而且可能被降解或切割成此類片段。某些標(biāo)志物以無活性形式合成，其隨后可以通過蛋白水解來活化。正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，蛋白質(zhì)或其片段也可以作為復(fù)合物的一部分存在。就本發(fā)明而言，此類復(fù)合物也可以用作標(biāo)志物。另外/或者，標(biāo)志物多肽或其變體可以攜帶翻譯后修飾。優(yōu)選的翻譯后修飾是糖基化、?；⒒蛄姿峄?。
[0050]如本文中使用的，術(shù)語“標(biāo)記物”指任何能夠經(jīng)直接或間接檢測產(chǎn)生信號的物質(zhì)。
[0051]對于直接檢測，可以自任何已知可檢測標(biāo)志物基團(tuán)選擇適合在本發(fā)明中使用的標(biāo)記基團(tuán)或標(biāo)記物，但不限于色原體、熒光、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如吖啶酯或二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane))、電化學(xué)發(fā)光化合物、催化劑、酶、酶的底物、染料、熒光染料(例如熒光素、香豆素、若丹明、β惡嗪、試鹵靈、花青及其衍生物)、膠態(tài)金屬和非金屬顆粒、和有機聚合物膠乳顆粒。標(biāo)記基團(tuán)的其它例子是發(fā)光金屬復(fù)合物(諸如釕或銪復(fù)合物)、酶(例如用于ELISA)、和放射性同位素。
[0052]例如，間接檢測系統(tǒng)包括用生物親和結(jié)合對的第一配偶標(biāo)記的檢測試劑(例如檢測抗體)。合適的結(jié)合對的例子是半抗原或抗原/抗體、生物素或生物素類似物(諸如氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素)/親合素或鏈霉親合素、糖/凝集素、核酸或核酸類似物/互補核酸、及受體/配體(例如類固醇激素受體/類固醇激素)。優(yōu)選的第一結(jié)合對成員包括半抗原、抗原和激素。尤其優(yōu)選半抗原，像地高辛和生物素及其類似物。通常標(biāo)記此類結(jié)合對的第二配偶(例如抗體、鏈霉親合素、等)以容許直接檢測，例如通過上文所述標(biāo)記物。
[0053]術(shù)語“評估慢性阻塞性肺病”或“評估C0PD”用于指示依照本發(fā)明的方法單獨地或與其它標(biāo)志物或變量一起會例如幫助內(nèi)科醫(yī)師建立或確認(rèn)COPD的缺失或存在。例如，該方法對于建立或確認(rèn)COPD的缺失或存在會是有用的。
[0054]就本發(fā)明而言，“C0PD標(biāo)志物”指作為單一標(biāo)志物或與標(biāo)志物APEXl組合，在評估COPD中對調(diào)查中的診斷問題添加有關(guān)信息的標(biāo)志物。對于評估C0PD，如果在給定特異性時的靈敏度或在給定靈敏度時的特異性分別可以通過將所述標(biāo)志物納入已經(jīng)包括標(biāo)志物APEXl的標(biāo)志物組(標(biāo)志物組合)來改進(jìn)，那么該信息認(rèn)定是有關(guān)的或具有附加價值。優(yōu)選地，靈敏度或特異性的改進(jìn)在P=0.05,0.02,0.01或更低的顯著性水平上分別是統(tǒng)計顯著的。
[0055]如本文中使用的，術(shù)語“樣品”或“測試樣品”指出于體外評估目的自個體獲得的生物學(xué)樣品。在本發(fā)明的方法中，在本發(fā)明的一個實施方案中，樣品或患者樣品可以包括任何體液。優(yōu)選的樣品是體液，諸如血清、血漿、或全血，血清或血漿是最優(yōu)選的。
[0056]在體外在適宜樣品中測定蛋白質(zhì)ΑΡΕΧ1，特別是蛋白質(zhì)APEXl的可溶性形式。優(yōu)選地，樣品衍生自人受試者，例如COPD患者或有COPD風(fēng)險的人或懷疑具有COPD的人。還優(yōu)選在血清或血漿樣品中測定蛋白質(zhì)APEXI。
[0057]如本文中使用的，術(shù)語“參照樣品”指自表觀健康個體的參照群提供的、用于體外評估目的的生物學(xué)樣品。如本文中使用的，術(shù)語“參照濃度”指在表觀健康個體的參照群中
建立的值。
[0058]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，會將依照本發(fā)明方法的步驟(a)的測量結(jié)果與參照濃度比較。此類參照濃度可以使用陰性參照樣品、陽性參照樣品、或包括一種或超過一種這些類型對照的混合參照樣品來測定。陰性參照樣品優(yōu)選會包括來自不吸煙者、沒有診斷COPD的對照吸煙者、哮喘的樣品或其各種組合。陽性參照樣品優(yōu)選會包括來自有診斷COPD的受試者的樣品。
[0059]無論如何，表述“將測定得到的濃度與參照濃度比較”僅僅用于進(jìn)一步例示對熟練技術(shù)人員顯而易見的內(nèi)容。在對照樣品中建立參照濃度。對照樣品可以是內(nèi)部或外部對照樣品。在一個實施方案中，使用內(nèi)部對照樣品，即在測試樣品中以及在自同一受試者采集的一份或多份其它樣品中評估標(biāo)志物水平以確定所述標(biāo)志物的水平是否存在任何變化。在另一個實施方案中，使用外部對照樣品。對于外部對照樣品，將自個體衍生的樣品中標(biāo)志物的存在或量與其在已知患有給定狀況或已知有給定狀況風(fēng)險的個體或已知沒有給定狀況的個體(即“正常個體”)中的存在或量比較。例如，可以將患者樣品中的標(biāo)志物水平與已知與特定coro過程相關(guān)的水平比較。通常，直接或間接地將樣品的標(biāo)志物水平與診斷關(guān)聯(lián)起來，而且例如使用標(biāo)志物水平來確定個體是否有coro風(fēng)險?；蛘?，例如，可以將樣品的標(biāo)志物水平與已知與COPD患者中對治療的響應(yīng)、COPD的診斷、選擇針對COPD的適宜藥物的指導(dǎo)、判斷疾病進(jìn)展風(fēng)險、或跟蹤COPD患者相關(guān)的標(biāo)志物水平比較。根據(jù)目的診斷用途，選擇適宜的對照樣品并在它們中為標(biāo)志物建立對照或參照值。熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會，在一個實施方案中，自年齡匹配的且沒有混淆疾病的參照群體獲得此類對照樣品。正如熟練技術(shù)人員也會清楚的，在對照樣品中建立的絕對標(biāo)志物值會依賴于所使用的測定法。優(yōu)選使用來自100名表征較好的個體(來自適宜參照群體)的樣品來建立對照(參照)值。還優(yōu)選參照群體可以選擇成由20、30、50、200、500或1000名個體組成。健康個體代表用于建立對照值的一種優(yōu)選參照群體。
[0060]術(shù)語“測量”或“測定”優(yōu)選包括定性、半定量或定量測量。在本發(fā)明中，在體液樣品中測量蛋白質(zhì)APEX1。在一個優(yōu)選實施方案中，測量是半定量測量，即測定蛋白質(zhì)APEXl的濃度是否高于或低于截留值。正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，在是(存在)或否(缺失)測定法中，測定法靈敏度通常設(shè)置成與截留值匹配。
[0061]例如，使用在對照組或?qū)φ杖后w中為蛋白質(zhì)APEXl測定的值來建立截留值或參照范圍。高于此類截留值或在其較高端在參照范圍以外的值認(rèn)定為升高的或指示COPD的存在。
[0062]在一個實施方案中，建立固定的截留值。選擇此類截留值來匹配感興趣的診斷問題。
[0063]在一個實施方案中，截留設(shè)置為導(dǎo)致特異性90%，還優(yōu)選截留設(shè)置為導(dǎo)致特異性95%，或者還優(yōu)選截留設(shè)置為導(dǎo)致特異性98%。
[0064]在一個實施方案中，截留設(shè)置為導(dǎo)致靈敏度90%，還優(yōu)選截留設(shè)置為導(dǎo)致靈敏度95%,或者還優(yōu)選截留設(shè)置為導(dǎo)致靈敏度98%。
[0065]在一個實施方案中，使用在對照組或?qū)φ杖后w中為蛋白質(zhì)APEXl測定的值來建立參照范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，如果測定值高于參照范圍的90%百分位，那么認(rèn)為蛋白質(zhì)APEXl的濃度是升高的。在又一些優(yōu)選實施方案，如果測定值高于參照范圍的95%百分位、96%百分位、97%百分位或97.5%百分位，那么認(rèn)為蛋白質(zhì)APEXl的濃度是升高的。
[0066]例如，高于截留值的值可以指示COPD的存在。例如，低于截留值的值可以指示COPD的缺失。
[0067]在又一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)APEXl的測量是定量測量。在又一些實施方案中，將蛋白質(zhì)APEXl的濃度與根本的診斷問題關(guān)聯(lián)起來。
[0068]在某些設(shè)置中，自已經(jīng)確認(rèn)COPD的患者提供的樣品可用作陽性對照樣品，而且優(yōu)選與要調(diào)查的樣品平行測定。在此類設(shè)置中，陽性對照樣品中標(biāo)志物蛋白質(zhì)APEXl的陽性結(jié)果指示測試規(guī)程在技術(shù)水平上起作用。
[0069]正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，任何此類評估在體外進(jìn)行。之后丟棄樣品(測試樣品)。樣品僅僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，而且不將樣品的材料轉(zhuǎn)移回患者的身體中。典型地，樣品是體液樣品，例如血清、血漿、或全血。
[0070]依照本發(fā)明的方法基于自個體獲得的液體或體液樣品且基于此類樣品中蛋白質(zhì)APEXl的體外測定。如本文中使用的，“個體”指單個人或非人生物體。如此，本文中描述的方法和組合物適用于人和獸疾病二者。優(yōu)選地，個體、受試者、或患者指人類。
[0071]優(yōu)選地，在體外通過使用特異性結(jié)合劑自液體樣品特異性測定標(biāo)志物蛋白質(zhì)APEXl。
[0072]在依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，測定蛋白質(zhì)APEXl的濃度。在一個實施方案中，在體外通過使用特異性結(jié)合劑自樣品特異性測定標(biāo)志物蛋白質(zhì)APEXl的濃度。
[0073]特異性結(jié)合劑是例如蛋白質(zhì)APEXl的受體、結(jié)合蛋白質(zhì)APEXl的凝集素、針對蛋白質(zhì)APEXl的抗體、針對蛋白質(zhì)APEXl的肽抗體(peptidebody)、雙特異性雙重結(jié)合劑或雙特異性抗體形式。特異性結(jié)合劑對它的對應(yīng)靶分子至少具有IO7Vmol的親和力。特異性結(jié)合劑對它的祀分子優(yōu)選具有108l/mol或還優(yōu)選109l/mol的親和力。
[0074]正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，術(shù)語特異性用于指示樣品中存在的其它生物分子沒有顯著結(jié)合對SEQ ID NO:5之蛋白質(zhì)APEXl序列特異性的結(jié)合劑。優(yōu)選地，對靶分子以外的生物分子的結(jié)合水平所導(dǎo)致的結(jié)合親和力至多是對靶分子的親和力的只有10%或更少、只有5%或更少、只有2%或更少或只有1%或更少。優(yōu)選的特異性結(jié)合劑會滿足上述親和力以及特異性最小標(biāo)準(zhǔn)二者。
[0075]特異性結(jié)合劑的例子是肽、肽模擬物、aptamer、spiegelmer、darpin、錨蛋白重復(fù)蛋白、Kunitz型域、抗體、單域抗體(參見Hey, T., et al.,.TrendsBiotechnol.23(2005)514-522)和單價抗體片段。
[0076]在某些優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合劑是多肽。
[0077]在某些優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合劑是抗體或單價抗體片段，優(yōu)選自單克隆抗體衍生的單價片段。
[0078]單價抗體片段包括但不限于Fab、Fab’ _SH、單域抗體、FvjP scFv片段,如下文提供的。[0079]術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，而且明確覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、自至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性。在某些優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合劑是抗體或單價抗體片段，優(yōu)選自單克隆抗體衍生的單價片段。
[0080]“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，而且可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在一些實施方案中，將抗體純化至(I)根據(jù)例如Lowry法的測定，抗體重量超過95%，且在一些實施方案中，重量超過99%，(2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍(lán)或銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常會通過至少一個純化步驟來制備。
[0081]“天然抗體”通常指由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫化物連接的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變域(VH)，接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(VL)，而且在另一端具有一個恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。
[0082]抗體的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以稱作“VH”。輕鏈的可變域可以稱作“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點。
[0083]術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于整個抗體可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)(HVR)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取β-片層構(gòu)象，通過形成環(huán)連接且在有些情況中形成β -片層結(jié)構(gòu)一部分的三個HVR連接。每條鏈中的HVR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與來自另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, FifthEdition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。恒定域不直接參與抗體對抗原的結(jié)合，但是展現(xiàn)多種效應(yīng)器功能，諸如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性中的參與。
[0084]根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K )和拉姆達(dá)(λ )。
[0085]根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可分入不同的類。免疫球蛋白有五大類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而且這些中的數(shù)種可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是公知的，而且一般性描述于例如 Abbas, et al., Cellular and Mol.1mmunology, 4th ed., ff.B.Saunders, C0.(2000)?？贵w可以是通過抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價或非共價聯(lián)合而形成的更大融合分子的一部分。[0086]術(shù)語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非下文定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)e區(qū)的抗體。
[0087]“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成的多特異性抗體。
[0088]用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱作“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點)和一個剩余的“Fe”片段(其名稱反映它易于結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F (ab’)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。
[0089]“Fv”是包含完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價聯(lián)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(ScFv)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價連接，使得輕和重鏈能在與雙鏈Fv種類的結(jié)構(gòu)類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中聯(lián)合。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個HVR相互作用，在VH-VL 二聚體表面上定義一個抗原結(jié)合位點。六個HVR —起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異性的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力比完整結(jié)合位點要低。
[0090]Fab片段包含重和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈恒定域和重鏈第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的區(qū)別在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab’)2抗體片段最初是作為成對Fab’片段(在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸)生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。
[0091]“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈中。一般地，scFv多肽在VH與VL結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見例如PlueckthunjIn:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg andMoore (eds.)，Springer-Verlagj New York (1994)pp.269-315。
[0092]術(shù)語“雙抗體”(diabody)指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連接的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并創(chuàng)建兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整地描述于例如 EP0404097 ；W01993/01161 ；Hudson, et al., Nat.Med.9 (2003) 129-134 ；及 Hol linger, et al., PNAS USA90 (1993) 6444-6448。三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)也描述于 Hudson, et al., Nat.Med.9 (2003) 129-134。
[0093]如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的抗體個體相同，除了可以以微小量存在的可能的突變，例如天然存在突變。如此，修飾語“單克隆”指示抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型地包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括自眾多多肽序列選擇單一靶物結(jié)合多肽序列的過程獲得的。例如，選擇過程可以是自眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆、或重組DNA克隆)的集合選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體、等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型地包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢還在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
[0094]特異性結(jié)合劑優(yōu)選是與SEQ ID NO:5反應(yīng)性的抗體。
[0095]對于本發(fā)明中公開的成就，可以使用來自各種來源的抗體?？梢允褂糜糜讷@得抗體的標(biāo)準(zhǔn)方案以及現(xiàn)代備選方法。用于生成抗體的備選方法包括例如使用合成或重組肽(它們呈遞APEXl的臨床有關(guān)表位)進(jìn)行免疫接種?；蛘?，可以使用DNA免疫接種(也稱作DNA疫苗接種)。明顯地，可以使用來自不同物種(例如家兔、綿羊、山羊、大鼠或豚鼠)的單克隆抗體或多克隆抗體。因為單克隆抗體可以以任何要求量及恒定特性生成，所以它們代表開發(fā)用于臨床程序的測定法中的理想工具。
[0096]正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，蛋白質(zhì)APEXl現(xiàn)在已經(jīng)鑒定為可用于評估COPD的標(biāo)志物。多種免疫診斷規(guī)程可用于達(dá)到與本發(fā)明的成就相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。
[0097]對于測定蛋白質(zhì)APEX1，將自個體獲得的樣品與針對APEXl的特異性結(jié)合劑一起在適合于結(jié)合劑APEXl復(fù)合物形成的條件下在體外溫育。不需要規(guī)定此類條件，因為熟練技術(shù)人員無需任何創(chuàng)造性努力就能容易地鑒定此類適宜的溫育條件。測定結(jié)合劑APEXl復(fù)合物的量，并用于評估C0PD。正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，有多種方法測定特異性結(jié)合劑APEXl復(fù)合物的量，在有關(guān)教科書中都有詳細(xì)描述(參見例如Tijssen，P.，supra或 Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K.(eds.) , Immunoassay, AcademicPress,Boston (1996))。
[0098]免疫測定法是熟練技術(shù)人員公知的。相關(guān)教科書中匯總了用于實行此類測定法的方法以及實際應(yīng)用和規(guī)程。相關(guān)教科書的例子是Tijssen, P.，Preparation ofenzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In:Practice andtheory of enzyme immunoassays, pp.221—278，Burdonj R.H.and v.Knippenbergj P.H.(eds.), Elsevier, Amsterdam (1990)及 Methods in Enzymologyj Colowickj S.P., andCaplanj N.0.(eds.)，Academic Press關(guān)于免疫學(xué)檢測方法的多個卷，尤其是卷70、73、74、84、92 和 121。
[0099]在一個實施方案中，本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合蛋白質(zhì)APEXl的抗體在依照本發(fā)明的方法中的用途。
[0100]在一個實施方案中，在依照本發(fā)明的方法中在免疫測定法規(guī)程中測量蛋白質(zhì)APEXl。
[0101]在又一個實施方案中，在酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)中檢測蛋白質(zhì)APEX1。
[0102]在又一個實施方案中，在夾心式測定法(夾心型測定法形式)中檢測蛋白質(zhì)APEX1。在此類測定法中，在一側(cè)上使用第一特異性結(jié)合劑捕捉蛋白質(zhì)APEX1，并在另一側(cè)上使用第二特異性結(jié)合劑(其經(jīng)過標(biāo)記從而直接或間接可檢測)。夾心型測定法形式中使用的特異性結(jié)合劑可以是特異性針對蛋白質(zhì)APEXl的抗體。一方面，可以使用不同捕捉和標(biāo)記抗體(即識別APEXl多肽上不同表位的抗體)實行檢測。另一方面，也可以用針對蛋白質(zhì)APEXl的同一表位的捕捉和標(biāo)記抗體實行夾心型測定法。在這個實施方案中，只可以檢測蛋白質(zhì)APEXl的二和多聚體形式。在一個實施方案中，在定性(APEX1的存在或缺失)或定量(測定APEXl的量)免疫測定法中使用針對蛋白質(zhì)APEXl的抗體。
[0103]在又一個實施方案中，依照本發(fā)明的方法基于APEXl的測量，其中采用與至少兩種非交疊表位反應(yīng)性的至少兩種抗體在夾心式免疫測定法中實施所述APEXl測量。
[0104]在又一個實施方案中，在競爭性測定法中檢測蛋白質(zhì)APEXl。在此類測定法形式中，使用特異性結(jié)合SEQ ID NO:5之APEXl的結(jié)合劑。在混合物中，添加至混合物的經(jīng)過標(biāo)記的APEXl和樣品中包含的APEXl競爭結(jié)合特異性結(jié)合劑?？梢砸勒諛?biāo)準(zhǔn)規(guī)程測量此類競爭的程度。
[0105]可以使用特異性ELISA體外測定測試樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度，如上文早已描述的。使用這種測定法形式，發(fā)明人顯示了來自已經(jīng)通過經(jīng)典方法(例如肺活量測定法)診斷為具有COPD的患者的 樣品可以與來自表觀健康個體的樣品辨別開。本申請的實施例部分中顯示了結(jié)果。
[0106]令人驚訝地，本發(fā)明的發(fā)明人能夠檢測體液樣品中的蛋白質(zhì)APEX1。甚至更加令人驚訝地，他們能夠證明此類自個體獲得的液體樣品中蛋白質(zhì)APEXl的存在可以與CCffD關(guān)聯(lián)起來。在評估CCffD中利用標(biāo)志物APEXl不需要組織和活檢樣品。認(rèn)為測量(例如小等分試樣)簡單體液樣品中蛋白質(zhì)APEXl的水平在COPD領(lǐng)域是非常有利的。
[0107]在一個優(yōu)選實施方案中，用血清作為樣品材料來實施依照本發(fā)明的方法。在又一個優(yōu)選實施方案中，用血漿作為樣品材料來實施依照本發(fā)明的方法。在又一個優(yōu)選實施方案中，用全血作為樣品材料來實施依照本發(fā)明的方法。
[0108]在又一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)APEXl作為標(biāo)志物分子自液體樣品(自個體獲得)體外評估COPD的用途。
[0109]診斷的理想情形會是其中單一事件或過程會引起呼吸疾病的情況，像例如在傳染病中。在所有其它情況中，正確診斷會是非常困難的，尤其當(dāng)沒有完全了解疾病的病因時，正如COPD的情況。正如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，對于給定的多因素疾病(像例如C0PD)，沒有以100%特異性和同時100%靈敏度做出診斷的生化標(biāo)志物。而是說，使用生化標(biāo)志物以某種可能性或預(yù)示值評估根本的診斷問題，例如疾病的存在、缺失、或嚴(yán)重性。因此，在例行臨床診斷中，一般在評估根本的疾病中一起考慮各種臨床癥狀和生物學(xué)標(biāo)志物。熟練技術(shù)人員完全熟悉例行用于計算要評估的診斷問題的相對風(fēng)險或可能性的數(shù)學(xué)/統(tǒng)計方法。在例行臨床實踐中，內(nèi)科醫(yī)師在診斷、治療、和管理根本的疾病時一般一起考慮各種臨床癥狀和生物學(xué)標(biāo)志物。
[0110]CCffD患者傳統(tǒng)上用支氣管擴(kuò)張劑或類固醇來治療，并通過肺活量測定法檢查氣流阻塞的可逆性。如果可逆性小于15%，且特別是如果他們具有較長吸煙史，那么他們會分類為COTO患者。
[0111]用于診斷COPD的ATS (美國胸學(xué)會)標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0112].FEV1/FVC 比〈0.7
[0113].對于吸入式B2激動劑，〈15%可逆性，F(xiàn)EV1<70%預(yù)測:
[0114].2周口服潑尼松龍試驗-FEVl可逆性小于15%
[0115]?吸煙史
[0116]FEVl指自最大吸氣位置開始且受試者做出最大努力，一秒鐘自肺排出的空氣的體積。FEV1%指作為用力肺活量(FVC)的百分比表述的FEV1。FVC指自最大吸氣位置，受試者做出最大努力，自肺排出的空氣的總體積。FEVl可以使用肺活量計測量呼氣頭一秒鐘呼出空氣的體積來測量。
[0117]表I中顯示COPD依照ATS (美國胸學(xué)會)/歐洲呼吸學(xué)會2004的肺活量測定法分類。當(dāng)前ATS分類系統(tǒng)中不再使用ATS COPDO期。
[0118]表1:
【權(quán)利要求】
1.一種用于在人受試者中評估慢性阻塞性肺病(COPD)的體外方法，其包括 a)測定血清、血漿、或全血樣品中蛋白質(zhì)APEXl的濃度，并 b)將步驟(a)中測定得到的蛋白質(zhì)APEXl濃度與蛋白質(zhì)APEXl的參照濃度比較，其中高于參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示C0PD。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中在免疫測定法規(guī)程中測量蛋白質(zhì)APEX1。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中該免疫測定法規(guī)程是酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)。
4.依照權(quán)利要求2和3的方法，其中在夾心式測定法形式中測量APEXl。
5.依照權(quán)利要求2和3的方法，其中在競爭性測定法形式中測量APEXl。
6.蛋白質(zhì)APEXI在人血清、血漿、或全血樣品中體外評估COPD中的用途，其中高于蛋白質(zhì)APEXl參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示C0PD。
7.包括蛋白質(zhì)APEXl和一種或多種其它COPD標(biāo)志物的標(biāo)志物組在人血清、血漿、或全血樣品中體外評估COPD中的用途，其中高于蛋白質(zhì)APEXl參照濃度的蛋白質(zhì)APEXl濃度指示 COPD。
8.依照權(quán)利要求7的標(biāo)志物組的用途，其中該一種或多種其它COPD標(biāo)志物選自蛋白質(zhì)ASC、ARMET, NNMT, FENl 和表面表達(dá)蛋白酶(Seprase )。
9.依照權(quán)利要求8的標(biāo)志物組的用途，包括蛋白質(zhì)APEXl和蛋白質(zhì)NNMT。
10.依照權(quán)利要求8的標(biāo)志物組的用途，包括蛋白質(zhì)APEX1、NNMT和表面表達(dá)蛋白酶(Seprase)0
11.依照權(quán)利要求8的標(biāo)志物組的用途，包括蛋白質(zhì)APEX1、NNMT、表面表達(dá)蛋白酶(Seprase)和 ASC。
12.依照權(quán)利要求1至5任一項的方法用于區(qū)分COPD與其它類型肺病，優(yōu)選哮喘的用途。
13.一種用于實行依照權(quán)利要求1至5任一項的方法的體外診斷醫(yī)學(xué)裝置。
14.一種用于實施依照權(quán)利要求1至5任一項的方法的試劑盒，其包括特異性測定蛋白質(zhì)APEXl的濃度需要的試劑。
【文檔編號】G01N33/68GK103430027SQ201280012534
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月11日
【發(fā)明者】M-L.哈格曼, J.卡爾, J.雷德林格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司