專利名稱：一種柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中cema和hema含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及尿液樣本的巰基尿酸測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定尿液中N-乙?；?S-(2-腈基乙基)-L-半胱氨酸(CEMA)和N-乙酰基-S- (2-羥基乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)含量的方法。
背景技術(shù)：
丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a，b-不飽和腈類化合物。它可以通過代謝活化后形成活性更強(qiáng)的環(huán)氧型中間體，進(jìn)一步與體內(nèi)的細(xì)胞大分子的親核中心共價(jià)結(jié)合，從而造成機(jī)體的損傷。體外毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC將其歸為可能的人類致癌物。丙烯腈存在于卷煙煙氣中(7. 8-39.1 11§/支煙)，普通人群可以通過吸入卷煙煙氣接觸丙烯腈，從而增加健康風(fēng)險(xiǎn)。丙烯腈進(jìn)入體內(nèi)后于可以直接或通過代謝活化后于GSH，形成兩種巰基尿酸代謝物CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不僅能提供丙烯腈及其可能的代謝中間物及其與GSH結(jié)合機(jī)制的有關(guān)信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在體內(nèi)的代謝狀況。2007年，Scherer等研究了 CEMA和HEMA等生物標(biāo)志物與抽吸卷煙原型物釋放量之間的關(guān)系，用于評(píng)估接觸風(fēng)險(xiǎn)。柱轉(zhuǎn)換LC-MS/MS方法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種在線前處理并檢測(cè)尿液中代謝物的方法。較早就有研究者將其應(yīng)用于檢測(cè)尿液中低含量的羥基多環(huán)芳烴(OH-PAH)類化合物，此方法采用的一個(gè)修飾的多孔硅膠填充柱在線前處理尿液樣本，純化后的分析物用HPLC檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了低含量的羥基多環(huán)芳烴的在線檢測(cè)。但是定制色譜柱的價(jià)格昂貴，并且此方法還需要一個(gè)液固萃 取過程來(lái)凈化尿液樣本，不能實(shí)現(xiàn)完全的在線分析。Simon等改進(jìn)了上述的柱轉(zhuǎn)換方法，使用一套柱轉(zhuǎn)換-HPLC檢測(cè)了尿液中的3_羥基苯并[a]芘，此系統(tǒng)包含四個(gè)六通閥和三個(gè)預(yù)處理小柱，來(lái)回切換來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品的在線凈化與富集。此方法雖然實(shí)現(xiàn)了尿液樣本的在線純化與富集，但是系統(tǒng)過程復(fù)雜，較多的前處理小柱處理樣本會(huì)降低方法的回收率。2008年，Schettgen將柱轉(zhuǎn)換方法與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，應(yīng)用于檢測(cè)尿液中的苯巰基尿酸。此方法選取了一種較為新穎的限進(jìn)色譜填料小柱，由于此小柱兼具體積排阻色譜和反相色譜的功能，能夠較好的除去尿液基質(zhì)的大分子物質(zhì)和水溶性鹽類，從而降低基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度。2009年，Schettgen應(yīng)用此方法同時(shí)檢測(cè)尿液中的CEMA和1，3-丁二烯的兩種巰基尿酸代謝物。此方法雖然能夠在線的檢測(cè)尿液中的CEMA，但是方法的定量限為I ng/mL，不能滿足普通人群尿液中CEMA含量的檢測(cè)(〈I ng/mL)，并且此柱轉(zhuǎn)換方法需要添加一個(gè)獨(dú)立的單元泵，用于進(jìn)樣和純化樣品流動(dòng)相，而此單元泵不但價(jià)格昂貴，且不能由質(zhì)譜軟件同步控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種采用柱轉(zhuǎn)換LC-MS/MS測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，該方法能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)尿液中CEMA和HEMA的含量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、測(cè)定干擾少。本發(fā)明建立了一種改進(jìn)的柱轉(zhuǎn)換-LC-MS/MS方法測(cè)定尿液中的CEMA和HEMA，該方法無(wú)需額外的獨(dú)立單元泵，整個(gè)儀器系統(tǒng)和分析過程由Analyst操作軟件同步控制。方法靈敏度高，可以有效的除去大分子蛋白，降低基質(zhì)干擾。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的尿液中CEMA和HEMA含量的測(cè)定方法，包括以下工藝步驟
a、收集志愿者尿液。b、樣品前處理尿液在室溫下解凍，混合均勻。準(zhǔn)確移取0.5 mL的尿液，加入20 ii L的甲酸和10 ii L混合內(nèi)標(biāo)，加入470 ii L的50 mM的甲酸銨水溶液(甲酸調(diào)節(jié)到pH=2. 5),混勻后在10000 rpm的條件下離心5 min。取上清液過0. 22 u m的聚醚砜水相濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析。C、利用甲醇配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的CEMA和HEMA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，CEMA的線性回歸方程為y =0. 0372x +0.0489，HEMA的線性回歸方程為y = 0. 0291x + 0.0144，其中Y代表分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，X表示尿液中目標(biāo)分析物的濃度。相關(guān)系數(shù)大于0. 999，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。在本發(fā)明中，所述混合內(nèi)標(biāo)為氘代內(nèi)標(biāo)，氘代內(nèi)標(biāo)濃度為I Pg/mL。本發(fā)明中選取了限進(jìn)色譜材料色譜柱LiChrospher RP-8 ADS 24X4 mm(25 Mm)和Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1X150 mm, 3.5 Mm)色譜柱，流動(dòng)相A :0. 1% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B :乙腈；采用梯度洗脫，分析時(shí)間為25 min，進(jìn)樣量為2 u L。梯度洗脫條件如表1:
表I梯度洗脫以及柱切換條件
權(quán)利要求
1.一種柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，其特征在于 包括以下工藝步驟 a、收集志愿者尿液； b、樣品前處理尿液在室溫下解凍，混合均勻，準(zhǔn)確移取0.5 mL的尿液，加入20 iiL的甲酸和10 UL混合內(nèi)標(biāo)，加入470 ML的50 mM的甲酸銨水溶液(甲酸調(diào)節(jié)到pH=2. 5)，混勻后在10000 rpm的條件下離心5 min,取上清液過0. 22 u m的聚醚砜水相濾膜,進(jìn)LC-MS/MS分析； C、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制用甲醇配制不同濃度的CEMA和HEMA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的CEMA和HEMA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，CEMA的線性回歸方程為y =0. 0372x +0.0489，HEMA的線性回歸方程為y = 0. 0291x + 0.0144，其中Y代表分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，X表示尿液中目標(biāo)分析物的濃度，相關(guān)系數(shù)大于0. 999，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，其特征在于混合內(nèi)標(biāo)為氘代內(nèi)標(biāo)，氘代內(nèi)標(biāo)濃度為I呢/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，其特征在于在LC-MS/MS測(cè)定中，選取限進(jìn)色譜材料色譜柱LiChrospher RP-8 ADS 24X4 mm (25 Mm)和Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1X150 mm, 3.5 U m)色譜柱，流動(dòng)相 A :0. 1% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B :乙腈；采用梯度洗脫，分析時(shí)間為25 min，進(jìn)樣量為2 u L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3述的柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，其特征在于梯度洗脫條件如表1: 表I梯度洗脫以及柱切換條件
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA的方法，其特征在于串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器的條件電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子掃描方式；噴霧電壓(IS) -4400V,霧化氣(Gasl):55 psi，氣簾氣壓力(CUR):35 psi，輔助霧化氣(Gas2):50 psi，離子源溫度(TEM) :530。C，進(jìn)口電壓(EP) :-10 V，出口電壓(CXP) :_10 V，駐留時(shí)間100 ms。
全文摘要
一種柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a、收集志愿者尿液，b、樣品前處理，c、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制，d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。本發(fā)明的特點(diǎn)是樣品經(jīng)離心后直接引入液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出尿液中CEMA和HEMA的含量水平。本發(fā)明為全新的尿液中CEMA和HEMA含量的測(cè)定方法，可以減化樣品前處理步驟；采用氘代標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)定量分析物；串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103063776SQ20121058819
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者侯宏衛(wèi), 張小濤, 田永峰, 劉彤, 陳歡, 韓書磊, 胡清源 申請(qǐng)人:國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心