單核細(xì)胞趨化蛋白2作為結(jié)核性胸水檢測的標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及MCP-2/CCL8蛋白作為鑒別診斷結(jié)核性胸水的標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了MCP-2/CCL8蛋白在制備結(jié)核性胸水鑒別診斷試劑或試劑盒的用途。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測試劑盒。本發(fā)明還提供了檢測或診斷結(jié)核性胸水的方法。
【專利說明】單核細(xì)胞趨化蛋白2作為結(jié)核性胸水檢測的標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和診斷領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種可用于檢測結(jié)核的胸水標(biāo)記物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，結(jié)核病仍是全球發(fā)病率及死亡率最高的感染性疾病。結(jié)核性胸膜炎(Tuberculosis Pleuritis, TP)是機(jī)體處于高敏狀態(tài),對結(jié)核菌及其代謝產(chǎn)物在胸膜出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，是原發(fā)或繼發(fā)結(jié)核累及胸膜的結(jié)果。TP是肺外結(jié)核中是最常見的結(jié)核感染形式之一,僅次于淋巴結(jié)結(jié)核。結(jié)核病人中大約有5%會發(fā)生TP，其往往呈急性發(fā)病，約1/3的患者在I周內(nèi)出現(xiàn)癥狀，2/3的患者在I個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)癥狀。最常見的癥狀是胸膜性疼痛(75%)、干咳(70%)。典型TP的臨床特征為單側(cè)胸腔少到中等量的積液，即結(jié)核性胸腔積液(Tuberculosis PleuralEffusions, TPE)。
[0003]TP如未經(jīng)治療，其自然病程一般為4?16周，其中有43%到65%的病例會在若干年后發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核或肺外結(jié)核。因此正確診斷與治療TP很重要。目前，治療方法主要為抗結(jié)核藥治療，另外輔以糖皮質(zhì)激素及胸水抽吸或引流。TP的確診需要在痰、胸水或胸膜活檢中鑒定出結(jié)核分枝桿菌。影像學(xué)手段及胸腔鏡均有助于診斷TPE。此外，支持診斷的依據(jù)還包括行胸腔穿刺進(jìn)行胸水檢查。胸水檢查包括常規(guī)的理化特性檢查(顏色、PH值、葡萄糖濃度等)、胸水涂片與培養(yǎng)、腺苷脫氨酶(ADA)檢測。胸水涂片與培養(yǎng)因其檢出率低、檢測周期長有很大的局限性。ADA檢測成本低、創(chuàng)傷小、方便快捷，如果胸水中ADA含量>70IU/L則高度提示結(jié)核，反之，如果〈40IU/L則可以基本上可以排除結(jié)核，其敏感度可高達(dá)95%，因此被廣泛采用于TPE的輔助診斷，但是由于某些淋巴細(xì)胞豐富的胸水如:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管肺泡癌、間皮瘤、支原體和衣原體性肺炎、肺吸蟲病、球孢子菌病等胸水ADA往往也會增高，因此該檢測方法的特異度仍存在不足，為此，ADA檢測結(jié)果的分析應(yīng)該結(jié)合臨床所見以及常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果。
[0004]隨著細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的進(jìn)展，胸液積液的免疫學(xué)檢查受到關(guān)注。胸膜腔的炎癥導(dǎo)致胸膜血管通透性的增加，從而產(chǎn)生富含蛋白和細(xì)胞的滲出性胸腔積液。結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液是導(dǎo)致淋巴細(xì)胞性胸腔積液(胸腔積液中淋巴細(xì)胞數(shù)量占白細(xì)胞總數(shù)的50%以上)的常見病因，⑶4+T淋巴細(xì)胞在此過程中占居主導(dǎo)地位。結(jié)核性胸膜炎以Thl反應(yīng)為主，惡性胸腔積液以Th2反應(yīng)為主。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgE和其它抗體參與過敏反應(yīng)；而Thl細(xì)胞主要分泌IFN- Y和IL-2，通過激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。結(jié)核分枝桿菌的感染是一個(gè)復(fù)雜的免疫反應(yīng)的過程，CD4+、CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞是參與結(jié)核性胸膜炎防御反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，可通過分泌特異性IFN-Y介導(dǎo)免疫應(yīng)答。因此，結(jié)核性胸腔積液中表達(dá)高水平的IFN-Y，測定TPE中IFN-Y濃度有助于診斷結(jié)核性胸膜炎，該檢測方法具有較高的靈敏度和特異度，但其診斷價(jià)值仍存有爭議。研究發(fā)現(xiàn)，病變部位還存在招募淋巴細(xì)胞的趨化因子，如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1-α (ΜΙΡ1-α)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、單核細(xì)胞趨化蛋白I (MCP-1)。這些趨化因子可能介導(dǎo)選擇性募集淋巴細(xì)胞到胸腔積液中。雖然，某些細(xì)胞因子如IL-2、TNF-a、IL-1 β及趨化因子如IP_10、MCP_1在結(jié)核性胸腔積液中的表達(dá)水平及診斷價(jià)值有零星報(bào)道，但是目前尚缺乏對胸腔積液中免疫細(xì)胞及免疫分子的系統(tǒng)分析，因此，尚未發(fā)現(xiàn)優(yōu)于IFN-Y的新診斷標(biāo)志物。
[0005]因此，本領(lǐng)域急需對結(jié)核病具備鑒別診斷意義的標(biāo)志物以及檢測該標(biāo)志物進(jìn)而診斷結(jié)核病的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別診斷結(jié)核性胸水的標(biāo)志物及其在制備結(jié)核性胸水鑒別診斷試劑或試劑盒中的用途。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供鑒別診斷結(jié)核性胸水的檢測試劑盒以及檢測或診斷結(jié)核性胸水的方法。
[0008]在第一方面，本發(fā)明提供MCP-2/CCL8蛋白在制備檢測結(jié)核性胸水的試劑盒或檢測試劑中的用途。
[0009]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述檢測試劑是MCP-2/CCL8蛋白的特異性抗體。
[0010]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述檢測試劑是帶有或不帶有檢測標(biāo)記的單克隆抗體、多克隆抗體或抗血清，或蛋白芯片。
[0011]在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述可檢測標(biāo)記選自下組:生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。
[0012]在第二方面，本發(fā)明提供MCP-2/CCL8蛋白作為結(jié)核性胸水檢測標(biāo)志物的用途。
[0013]在第三方面，本發(fā)明提供一種結(jié)核性胸水檢測的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0014]a)容器，
[0015]b)裝在所述容器內(nèi)的MCP-2/CCL8蛋白的檢測試劑；和
[0016]c)標(biāo)簽或使用說明書，所述標(biāo)簽或使用說明書注明所述試劑盒用于胸水檢測或診斷結(jié)核病以及利用所述檢測試劑檢測結(jié)核病的使用方法。
[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)簽或說明書中注明:
[0018]如果檢測對象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷該對象具有
結(jié)核病。
[0019]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果檢測對象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于25pg/ml,更優(yōu)選高于30pg/ml,則診斷該對象具有結(jié)核病。
[0020]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒中還包括檢測胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴細(xì)胞的含量的試劑。
[0021]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)簽或說明書中還注明:
[0022]如果檢測對象的胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴細(xì)胞的含量高于其他疾病對照，則診斷該對象具有結(jié)核病。
[0023]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述檢測試劑是MCP-2/CCL8蛋白的特異性抗體。
[0024]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述檢測試劑是帶有或不帶有檢測標(biāo)記的單克隆抗體、多克隆抗體或抗血清，或蛋白芯片。[0025]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述可檢測標(biāo)記選自下組:生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。
[0026]在第四方面，本發(fā)明提供一種檢測結(jié)核病的方法，所述方法包括:
[0027]檢測待測對象的胸水樣品中MCP-2/CCL8蛋白的含量，如果檢測的MCP-2/CCL8蛋白含量高于其他疾病對照，則診斷該對象具有結(jié)核病。
[0028]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果檢測的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷
該對象具有結(jié)核病。
[0029]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果檢測對象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于25pg/ml,更優(yōu)選高于30pg/ml,則診斷該對象具有結(jié)核病。
[0030]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法還包括檢測胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴細(xì)胞的含量是否升高。
[0031]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1.結(jié)核患者胸水中MCP-2/CCL-8的表達(dá)水平高。(A)應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片篩選結(jié)核患者和非結(jié)核患者的胸水中差異表達(dá)的細(xì)胞因子，并用ELISA方法驗(yàn)證；(B)結(jié)核患者和非結(jié)核患者胸水中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)；(C-D)ELISA測定結(jié)核患者或非結(jié)核患者胸水中IFN-y (C)或MCP-2/CCL8 (D)的蛋白水平；(E) ELISA測定有或無胸水的結(jié)核患者與健康志愿者的外周血中MCP-2/CCL8的蛋白水平；(F)顯示MCP-2/CCL8和IFN- Y的曲線下面積(AUC)的受試者運(yùn)算特征曲線(ROC)。
[0033]圖2.結(jié)核患者胸水中表達(dá)CCR5的⑶4+T細(xì)胞的比例顯著上調(diào)。㈧FACS檢測結(jié)核患者胸水中⑶3+、⑶4+和⑶8+細(xì)胞的代表性圖示；(B)FACS檢測結(jié)核患者胸水中⑶3+、⑶4+和⑶8+細(xì)胞上CCR5表達(dá)的代表性圖示；(C)比較結(jié)核患者和惡性腫瘤患者胸水(n=6)之間表達(dá)CCR5的CD3+、CD4.和CD8.細(xì)胞的百分比，*，ρ〈0.05。
[0034]圖3.806誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞1?^-2/^(^8表達(dá)。(A)實(shí)時(shí)定量PCR檢測用感染復(fù)數(shù)(Multiplicity OfInfection, Μ0Ι)為5的BCG感染所示時(shí)間的鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7中mcp-2/ccl8mRNA的產(chǎn)生；(B)實(shí)時(shí)定量PCR檢測用MOI為5的BCG處理所示時(shí)間的原代腹腔巨噬細(xì)胞中mcp-2/ccl8mRNA的產(chǎn)生；(C)ELISA檢測用MOI為5的BCG感染所示時(shí)間的THP-1 (一種人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系)中MCP-2/CCL8蛋白，**，p〈0.001，*，p〈0.05。
[0035]圖4.p38和PI3K調(diào)節(jié)BCG-誘導(dǎo)的MCP-2/CCL8表達(dá)。⑷用BCG感染所示時(shí)間的巨噬細(xì)胞中信號通路p38、JNK、ERK、Akt、NF- κ B磷酸化的蛋白質(zhì)印跡，數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果；(B)激酶抑制劑 SB203580、SP600125、PD98059、LY294002、BAYl 1-7082 處理后，用MOI為5的BCG感染24h的鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7中MCP_2/CCL8mRNA的實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測；(C)不同的激酶抑制劑 SB203580、SP600125、PD98059、LY294002、BAYl 1-7082處理后，用MOI為5的BCG感染24h的THP-1細(xì)胞中MCP-2/CCL8蛋白的ELISA檢測，**，p〈0.001，木，p〈0.05。
[0036]圖5.BCG通過TLR2誘導(dǎo)MCP-2/CCL8表達(dá)。⑷用MOI為5的BCG感染24h的野生型、TLR2+KCKTLR3+K0及TLR4+K0小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞中mcp-2/ccl8mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR。#，p〈0.0Ol。比較KO小鼠與野生型小鼠中巨噬細(xì)胞經(jīng)BCG感染后mcp-2/ccl8mRNA的表達(dá)。⑶用MOI為5的BCG感染所示時(shí)間的野生型或TLR2K0小鼠的原代腹膜巨噬細(xì)胞中Akt磷酸化的蛋白質(zhì)印跡測定。所示數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性圖示。(C) (B)的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的密度分析。顯示的數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，*，P〈0.05。
[0037]圖6描述了分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-2/CCL8，在結(jié)核胸水中募集表達(dá)CCR5的T淋巴細(xì)胞。分枝桿菌通過TLR2/PI3K/Akt和p38信號通路激活巨噬細(xì)胞中MCP-2/CCL8的釋放。結(jié)核性胸水中高度表達(dá)的MCP-2/CCL8可招募高表達(dá)CCR5 (MCP-2/CCL8所用的初始受體)的CD4+T淋巴細(xì)胞到感染部位。
【具體實(shí)施方式】
[0038]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)MCP-2/CCL8在結(jié)核病人的胸水中明顯高表達(dá)，結(jié)核病人胸水MCP-2/CCL8的敏感性和特異性都是100%，從而MCP-2/CCL8可以作為特異性診斷結(jié)核病人胸水的標(biāo)志物，進(jìn)而作為特異性檢測和診斷結(jié)核病的標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0039]胸水
[0040]本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于本文的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)該知道，本文所用的術(shù)語“胸水”又稱為胸腔積液或胸腔積水，是指由壁層胸膜與臟層胸膜組成的封閉性胸腔內(nèi)，起潤滑作用的很少量液體。
[0041]當(dāng)發(fā)生某種情況影響到胸膜，可使得胸腔內(nèi)液體增多，也就是產(chǎn)生所謂的胸腔積水(積液)。胸水從性質(zhì)上可分為滲出性及漏出性。滲出性的病因很多，歸納起來為兩大類:一類是炎癥性病變所致，如由細(xì)菌、病毒或真菌等感染胸膜引起感染性炎癥，導(dǎo)致胸腔積液，或由于肺栓塞、胰腺炎、結(jié)締組織疾病等非感染性炎癥引起胸腔積液；第二類是腫瘤性的，如腫瘤長在胸膜上或轉(zhuǎn)移侵犯胸膜引起積液，可見于胸膜間皮瘤、肺癌、乳房癌、胃癌等。漏出性胸腔積液的病因，可以是全身性疾病，如低蛋白血癥、過敏性疾病,也可以是某器官的病變，如充血性心力衰竭、肝硬化、肝阿米巴病、胸導(dǎo)管破裂等。
[0042]由于產(chǎn)生胸水的原因很多，現(xiàn)有技術(shù)中，簡單檢測胸水在臨床上不具備鑒別診斷意義。
[0043]MCP-2/CCL8蛋白及其編碼基因
[0044]本文所述的MCP-2/CCL8是炎癥的趨化因子，它是用干擾素和其他促炎細(xì)胞因子旁分泌刺激T-細(xì)胞，或通過與病毒、細(xì)菌和真菌接觸時(shí)的天然免疫而表達(dá)在炎性組織上的細(xì)胞及其浸潤的細(xì)胞，主要是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的趨化因子。它是通過不同的趨化因子受體包括趨化因子受體CCR1，CCR2B和CCR5去趨化、激活不同的細(xì)胞類型像粒細(xì)胞，單核吞噬細(xì)胞。
[0045]在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明蛋白”、“MCP-2/CCL8蛋白”、“MCP-2/CCL8多肽”可互換使用，都指NCBI基因登錄號6355所示的蛋白或多肽(其氨基酸序列為MKVSAALLCLLLMAATFSPQGLAQPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLKP, SEQ ID NO:1)。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的MCP-2/CCL8蛋白。此外，該術(shù)語還應(yīng)包括全長的MCP-2/CCL8蛋白及其片段。本發(fā)明的MCP-2/CCL8蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突變體以及其功能上活性的片段。
[0046]在本發(fā)明中，術(shù)語“MCP-2/CCL8基因”或“MCP-2/CCL8多核苷酸”可互換使用，指具有人MCP-2/CCL8核苷酸序列(NCBI基因登錄號6355)的核酸序列(其核苷酸序列為atgaaggtttctgcagcgcttctgtgcctgctgctcatggcagccactttcagccctcagggacttgctcagccagattcagtttccattccaatcacctgctgctttaacgtgatcaataggaaaattcctatccagaggctggagagctacacaagaatcaccaacatccaatgtcccaaggaagctgtgatcttcaagaccaaacggggcaaggaggtctgtgctgaccccaaggagagatgggtcagggattccatgaagcatctggaccaaatatttcaaaatctga，SEQ ID N0:2)o 需理解的是，當(dāng)編碼相同的氨基酸時(shí)，密碼子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生保守的氨基酸取代時(shí)，核苷酸的變換也是可被接受的。
[0047]在得到MCP-2/CCL8蛋白的氨基酸片段的情況下，可根據(jù)其構(gòu)建出編碼它的核酸序列，并且根據(jù)核苷酸序列來設(shè)計(jì)特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的MCP-2/CCL8核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0048]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0049]此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0050]目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。
[0051]通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的MCP-2/CCL8蛋白或多肽。一般來說有以下步驟:
[0052]I)用本發(fā)明的編碼人MCP-2/CCL8蛋白或多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0053]2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0054]3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0055]本發(fā)明中，MCP-2/CCL8多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
[0056]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含MCP-2/CCL8編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0057]此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0058]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0059]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞等。
[0060]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0061]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0062]在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 ο
[0063]特異性抗體
[0064]在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明抗體”和“MCP-2/CCL8的特異性抗體”可互換使用。
[0065]本發(fā)明還包括對人MCP-2/CCL8蛋白或多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人MCP-2/CCL8基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人MCP-2/CCL8基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人MCP-2/CCL8蛋白的分子，也包括那些并不影響人MCP-2/CCL8蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人MCP-2/CCL8基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
[0066]本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利N0.4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
[0067]本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人MCP-2/CCL8基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人MCP-2/CCL8蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見 Kohler 等人，Nature256;495, 1975;Kohler 等人，F(xiàn).ur.T.Tmmunol.6:511, 1976; Kohler 等人,Eur.T.Jmmun ο 1.6:292, 1976; Hammerling 等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人MCP-2/CCL8蛋白功能的抗體以及不影響人ANGPTL4蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ANGPTL4基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人MCP-2/CCL8基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
[0068]抗人MCP-2/CCL8蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測標(biāo)本(尤其是血清樣本)中的人MCP-2/CCL8蛋白。
[0069]檢測方法
[0070]本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)胸水中的MCP-2/CCL8蛋白可以作為特異性檢測和診斷結(jié)核病的標(biāo)志物，進(jìn)而提供了結(jié)核病的檢測方法，所述方法包括利用MCP-2/CCL8蛋白檢測試劑檢測待測患者胸水中的MCP-2/CCL8蛋白含量，如果與其他疾病對照相比，該含量升高，則所述待測患者具有結(jié)核病。
[0071]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果檢測的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷
該對象具有結(jié)核病。
[0072]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法還包括檢測胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴細(xì)胞的含量相比于其他疾病對照是否升高。
[0073]檢測試劑盒
[0074]本發(fā)明還提供用于在胸水中檢測MCP-2/CCL8蛋白，進(jìn)而診斷結(jié)核病的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0075]a)容器，
[0076]b)裝在所述容器內(nèi)的MCP-2/CCL8蛋白的檢測試劑；和
[0077]b)標(biāo)簽或使用說明書，所述標(biāo)簽或使用說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷結(jié)核病以及利用所述檢測試劑檢測結(jié)核病的使用方法。
[0078]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)簽或說明書中注明:
[0079]如果檢測對象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷該對象具有
結(jié)核病。
[0080]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒中還包括檢測胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴細(xì)胞的含量的試劑。
[0081]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)簽或說明書中還注明:
[0082]如果檢測對象的胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴細(xì)胞的含量高于正常對照，則診斷該對象具有結(jié)核病。
[0083]在具體的實(shí)施方式中，所述檢測試劑是MCP-2/CCL8蛋白的特異性抗體。
[0084]本發(fā)明人利用所述診斷試劑盒，已完成實(shí)驗(yàn)128例，其中確診結(jié)核病人75例，確診非結(jié)核病人(對照病人)53例，診斷結(jié)果如表2所示，敏感性為93.33%，特異性為94.8%。
[0085]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0086]1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)胸水中的MCP-2/CCL8在檢測結(jié)核病中的應(yīng)用；
[0087]2.本發(fā)明的MCP-2/CCL8蛋白可以作為特異性診斷結(jié)核病人胸水的標(biāo)志物；
[0088]3.本發(fā)明的MCP-2/CCL8蛋白可以作為特異性檢測和診斷結(jié)核病的標(biāo)志物；
[0089]4.利用本發(fā)明的MCP-2/CCL8蛋白檢測結(jié)核病的敏感性和特異性都極高。[0090]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0091]實(shí)驗(yàn)材料與方法
[0092]細(xì)胞培養(yǎng)基及試劑
[0093]小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 (ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州)及THP-1細(xì)胞(人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞系，ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州)均用補(bǔ)加了 10%小牛血清(FBS)及抗生素(50U/mL青霉素和50 μ g/mL鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞在用Mtb刺激前需用50ng/mL的PMA(Sigma公司)預(yù)處理24h以誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。
[0094]RPMI1640, DMEM、FBS、青霉素及鏈霉素均購自上海Invitrogen公司。PI3K 抑制劑(LY294002)，p-ERK 抑制劑(PD980259), p-JNK ?φ 制劑(SP600125)，ρ-ρ38 抑制劑(SB203580)及 NF-κ B 抑制劑(ΒΑΥ11-7082)均購自 Enzo LifeSciences (Farmingdale, NY)?？贵w p_AKT、p-p38、p-ERK、p-JNK、p-p65 及肌動(dòng)蛋白均購自Cell Signaling Technology (Beverly, MA) ? 聚乙烯(PE)或異硫氰酸突光素(FITC)標(biāo)記的 CD3、CD4、CD8 及 CCR5 抗體均購自 ebioscience (San Diego, CA)。 [0095]細(xì)菌
[0096]牛分枝桿菌BCG (購自中國獸藥監(jiān)察局)于37 °C，用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)作搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為Middlebrook7H9加入0.05%吐溫-80和10%過氧化氫酶葡萄糖酸蛋白(OADC)濃縮油(Becton Dickinson, Sparks, MD)。細(xì)菌懸液在 2500g 離心 IOmin,沉淀物用含 2mM 左旋谷氨酰胺、0.1mM非必須氨基酸、ImM丙酮酸鈉及20mM碳酸氫鈉(Gibco BRL, LifeTechnologies, Grand Island, NY) (CRPMI)的 RPMI1640 重懸，經(jīng) 27-號針破壞菌團(tuán) 2 次。取ImL置于-80°C至少I天，后將該培養(yǎng)液用含有10%0ADC的Middlebrook7Hll培養(yǎng)基(BectonDickinson C0., Sparks, MD)以連續(xù)稀釋法進(jìn)行稀釋。
[0097]動(dòng)物及腹腔巨噬細(xì)胞的分離
[0098]將TLR2+，TLR3+ 及 TLR4+ 突變小鼠(獲自 Jackson Laboratory, US)和 C57BL/6小鼠回交8代，C57BL/6小鼠作對對照小鼠。所有的小鼠均飼養(yǎng)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的小鼠均為6~8周齡。腹腔巨噬細(xì)胞用下述方法進(jìn)行分離。給小鼠腹膜內(nèi)注射2mL4%巰基醋酸鹽培養(yǎng)基(FTG)。3天后，用預(yù)冷的PBS以腹腔灌洗法獲取細(xì)胞，鋪板2h待細(xì)胞貼壁，然后更換RPMI1640培養(yǎng)基，同時(shí)除去未貼壁的細(xì)胞。貼壁單層細(xì)胞24h后作為原代腹腔巨噬細(xì)胞使用。BCG刺激前12h更換無胎牛血清但含1%抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)，用以將FBS的影響降到最低。所有的細(xì)胞均培養(yǎng)于5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱。
[0099]對象
[0100]該研究項(xiàng)目經(jīng)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院批準(zhǔn)，所有樣本提供者的知情同意書均已獲得。88位含胸水病患(年齡39.9±8.4歲)確診為結(jié)核患者，(通過胸水中結(jié)核菌的培養(yǎng)陽性或胸膜組織活檢確診)。所有的結(jié)核患者均為入住上海市肺科醫(yī)院的病人，均是人體免疫缺損病毒(HIV)抗體陰性，TB化學(xué)治療之后，所有病患的胸水消退，臨床癥狀減輕。在樣品收集時(shí)所有病患均未接受TB藥物、激素或者其他非激素類抗炎藥物治療。70位病患(年齡42.9±5.4歲)已從病因?qū)W(如惡性腫瘤、肺炎及PAH)上證明為非結(jié)核型胸水，其樣本收集作為對照組。
[0101]PE和血清分離及ELISA分析
[0102]TB和非TB患者的胸水在住院24h后通過標(biāo)準(zhǔn)的胸腔穿刺術(shù)收集在肝素鋰抗凝采血管中。獲得IOmL周邊血并離心處理，收集上清用ELISA法檢測MCP-2/CCL8和Y -干擾素。
[0103]細(xì)胞因子的蛋白芯片分析
[0104]PE中細(xì)胞因子的濃度用RayBio人類炎癥抗體陣列3 (貨號AAH-1NF-G3-8)檢測。玻璃芯片封閉好后，將IOOyL PE樣本直接加入子陣列中，用抗體孵育，之后用生物素化的抗體混合物孵育，再用帶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育。之后用AxonGenePix (發(fā)射頻率532nm)掃描該孔板以檢測熒光信號，熒光強(qiáng)度值用相應(yīng)分析軟件分析得到。
[0105]RNA的制備，反轉(zhuǎn)錄PCR及實(shí)時(shí)定量PCR
[0106]用TRIzol試劑將總RNA分離出后，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)。MCP-2/CCL8進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)的引物為正向引物5' -TCTACGCAGTGCTTCTTTGCC-3' (SEQ ID NO: 3)和反向引物 5' -AAGGGGGATCTTCAGCTTTAGTA-3' (SEQ ID N0:4)。實(shí)時(shí)定量PCR用Applied Biosystems7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)及SYBRk'綠色實(shí)時(shí)PCR主混合物(Τ0Υ0Β0)進(jìn)行。所有PCR試驗(yàn)均為3個(gè)平行組，且每組試驗(yàn)均重復(fù)至少3次。
[0107]流式細(xì)胞術(shù)
[0108]病患中得到的PE在IOOOg下離心5min,細(xì)胞沉淀用紅細(xì)胞裂解液重懸,用以除去紅細(xì)胞，之后用含3.7%PFA的PBS洗2次。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)記的⑶3，⑶4，⑶8和CCR5。樣本在流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)中處理24h以染色，并用BD CFlow Plus軟件分析。
[0109]巨噬細(xì)胞感染、激酶抑制劑處理及免疫印跡分析
[0110]用MOI為5的M.bovisBCG刺激腹腔巨噬細(xì)胞，隨后在冰上用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30min，后在12000g、4°C離心lOmin。收集上清加入SDS上樣緩沖液煮沸。相應(yīng)分子量的蛋白用SDS-PAGE在還原條件下分離并轉(zhuǎn)移到NC膜上。用ECL試劑顯色。
[0111]統(tǒng)計(jì)分析
[0112]所有的數(shù)據(jù)均表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。每組偏差通過t值檢驗(yàn)分析。當(dāng)P值小于0.05時(shí)表不其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。
[0113]實(shí)施例
[0114]實(shí)施例1.檢測結(jié)核病人胸水中MCP-2/CCL8的表達(dá)
[0115]為了理解肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)理，本發(fā)明人進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片分析來檢測結(jié)核患者胸水和非結(jié)核患者，包括癌癥、肺炎、肺動(dòng)脈高壓患者胸水之間40個(gè)不同細(xì)胞因子的表達(dá)(圖1A，表 I)。1-309/CCL1、RANTES/CCL5、MCP-2/CCL8、IL-8/CXCL8、MIG/CXCL9、MCP-1/CCL2、IFN- Y和TOGF-BB八個(gè)細(xì)胞因子濃度在結(jié)核患者胸水中顯著提高(圖1B)。在13個(gè)結(jié)核患者和12個(gè)非結(jié)核患者中用ELISA檢測這些細(xì)胞因子的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)IFN-Y在結(jié)核患者胸水中高表達(dá)(圖1C)。同時(shí)，MCP-2/CCL8在結(jié)核患者胸水中也高表達(dá)(圖1D)，而MCP-2/CCL8在結(jié)核病人血清中低表達(dá)(圖1E)。這些結(jié)果表明MCP-2/CCL8聚集在結(jié)核病人的胸水中。然后，發(fā)明人分析MCP-2/CCL8在結(jié)核患者胸水和其他病因胸水中的診斷價(jià)值。應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者胸水中MCP-2/CCL8的曲線下面積為(AUC)為1，IFN- Y的AUC為0.987。對應(yīng)的MCP-2/CCL8的截?cái)帱c(diǎn)為22.78pg/ml, IFN- Y的截?cái)帱c(diǎn)為14.75pg/ml，結(jié)核患者胸水MCP-2/CCL8的敏感性和特異性都是100%。
[0116]因此，MCP-2/CCL8是特異性診斷結(jié)核病人胸水的候選標(biāo)記。
[0117]表1.結(jié)核患者和非結(jié)核患者胸水中細(xì)胞因子豐度的蛋白質(zhì)陣列分析
【權(quán)利要求】
1.MCP-2/CCL8蛋白在制備檢測結(jié)核性胸水的試劑盒或檢測試劑中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述檢測試劑是MCP-2/CCL8蛋白的特異性抗體。
3.MCP-2/CCL8蛋白作為結(jié)核性胸水檢測標(biāo)志物的用途。
4.一種結(jié)核性胸水檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: a)容器， b)裝在所述容器內(nèi)的MCP-2/CCL8蛋白的檢測試劑；和 c)標(biāo)簽或使用說明書，所述標(biāo)簽或使用說明書注明所述試劑盒用于胸水檢測或診斷結(jié)核病以及利用所述檢測試劑檢測結(jié)核病的使用方法。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)簽或說明書中注明: 如果檢測對象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷該對象具有結(jié)核病。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括檢測胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴細(xì)胞的含量的試劑。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)簽或說明書中還注明: 如果檢測對象的胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴細(xì)胞的含量高于其他疾病對照，則診斷該對象具有結(jié)核病。
8.如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑是MCP-2/CCL8蛋白的特異性抗體。
9.一種檢測結(jié)核病的方法，其特征在于，所述方法包括: 檢測待測對象的胸水樣品中MCP-2/CCL8蛋白的含量，如果檢測的MCP-2/CCL8蛋白含量高于其他疾病對照，則診斷該對象具有結(jié)核病。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，如果檢測的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，則診斷該對象具有結(jié)核病。
【文檔編號】G01N33/68GK103884845SQ201210559258
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】戈寶學(xué), 劉海鵬, 劉忠華 申請人:同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院