一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒。所述試劑盒包括：抗體芯片，包括基片和在基片表面上固定的16種腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體、兩種陽性對照；腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品混合物，是將16種標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的量混合在一起的凍干混合物；生物素標(biāo)記的腫瘤標(biāo)志物檢測抗體混合物；和熒光素Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素。本發(fā)明所述的試劑盒能夠檢測十六個臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實驗室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點。
【專利說明】一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]21世紀(jì)以來，惡性腫瘤對人類健康的威脅已日趨嚴(yán)重。其致死率僅次于心腦血管疾病，位居第三。腫瘤患者死亡率高的主要原因是不能準(zhǔn)確診斷，準(zhǔn)確診斷與及時治療是防治腫瘤與降低死亡率的最有效方法。
[0003]隨著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，腫瘤患者體內(nèi)某些蛋白質(zhì)會發(fā)生變化，或產(chǎn)生新的與腫瘤關(guān)聯(lián)的異常蛋白。這些能反應(yīng)腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)人們總稱為腫瘤標(biāo)志物。由于腫瘤標(biāo)志物或不存在于正常成人組織而僅見于腫瘤組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，因此通過對這些異常的蛋白質(zhì)的檢測不僅可以用來診斷腫瘤的發(fā)生也可以用來監(jiān)控藥物對腫瘤的治療進(jìn)展，對腫瘤的診治將起到重要作用。用于臨床診斷的腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和細(xì)胞表面腫瘤抗原等6大類。美國FDA批準(zhǔn)了以下血清腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的輔助診斷:甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特異性抗原(fPSA，tPSA)，甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)，β人絨毛膜促性腺激素(HCGb)，和人附睪分泌蛋白4 (HE4)。另外其他常用于臨床診斷的腫瘤標(biāo)志物還包括神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE),降?丐素(PCT),鐵結(jié)合蛋白(Ferritin), β 2 一微球蛋白(beta 2-Microglobin),胃蛋白酶原(Pepsinogen I, 2),和催乳素(Prolactin)等。
[0004]甲胎蛋白(AFP)在胚胎期是功能蛋白，合成于卵黃囊、肝和小腸。AFP是原發(fā)性肝癌的目前比較靈敏、特異的`腫瘤標(biāo)志。睪丸癌、畸胎瘤、胃癌、胰腺癌等患者血清AFP含量可以升高。癌胚抗原(CEA)—度被認(rèn)為是結(jié)腸癌的特異性標(biāo)志物，但以后發(fā)現(xiàn)胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌也有較高表達(dá)。癌抗原CA125是卵巢癌的首選標(biāo)志物，在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤、子宮癌均可增高。附睪分泌蛋白4 (HE4)是卵巢癌第二標(biāo)志物，輔助卵巢癌的診斷。癌抗原CA153是乳腺癌的首選標(biāo)志，另外在肺癌、卵巢癌，肺腺癌、結(jié)直腸癌等均可增高。癌抗原CA19-9為消化道癌相關(guān)抗原，是胰腺癌和結(jié)、直腸癌的標(biāo)志物。前列腺特異性抗原(PSA、f-PSA)是前列腺癌的特異性標(biāo)志物，也是目前少數(shù)器官特異性腫瘤標(biāo)志物之一。神經(jīng)原特異性烯醇化酶NSE是神經(jīng)母細(xì)胞瘤和小細(xì)胞肺癌的標(biāo)記物，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是胎盤產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，主要見于婦科腫瘤和非精原性睪丸癌，其他如乳腺癌、精原性睪丸癌、肺癌、肝癌等有20 -40%的陽性率。鐵結(jié)合蛋白(Ferritin)與白血病、肺癌、乳腺癌有關(guān)?，F(xiàn)被稱為原發(fā)性肝癌的第二血清學(xué)標(biāo)志物，特別是對AFP陰性患者。β 2 一微球蛋白(β 2-microglobulin)臨床上多用于證實淋巴增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤。另外根據(jù)表達(dá)水平的不同還可為骨髓瘤患者分期。降鈣素(PCT)是甲狀腺髓樣癌、肺腺癌及小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物，另外在乳腺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、上頜竇癌、膀胱癌中也有高表達(dá)。[0005]目前常用的腫瘤標(biāo)志物的檢測方法主要包括:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，放射免疫分析(radio immunoassay, RIA),免疫印跡法(western blot),流式細(xì)胞儀(Flow-Cytometry)等。其中，酶聯(lián)免疫吸附法是最普遍的方法,具靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優(yōu)點。但一次試驗只能檢測單一指標(biāo)，通量低、成本高，在多腫瘤標(biāo)志物的檢測中，該方法存在明顯的不足；放射免疫分析(RIA)雖然靈敏度高，是由于具有放射性污染，現(xiàn)在已很少采用；免疫印績法能測定分子的大小，且無非特異的反應(yīng)，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測單一指標(biāo)；流式細(xì)胞儀能在細(xì)胞水平上檢測腫瘤標(biāo)志物的水平，但卻存在低靈敏、低通量、高成本等缺點，且此方法中采用的設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易推廣。
[0006]定量抗體芯片是基于夾心法ELISA技術(shù)，能讓研究者準(zhǔn)確、及時確定多種腫瘤標(biāo)志物的濃度，兼具ELISA方法的高靈敏度、特異性和芯片的高通量檢測的優(yōu)點。該技術(shù)是利用一對能與標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體來進(jìn)行檢測，捕獲抗體(一抗)先固定在玻片上，加入臨床樣本后進(jìn)行孵育，目標(biāo)標(biāo)志物被捕獲。加入生物素標(biāo)記的二抗，它可以區(qū)分出目標(biāo)標(biāo)志物的不同類型。加入鏈霉親和素標(biāo)記的Cy3等效染料后，利用激光掃描可視化，可以檢測標(biāo)志物-抗體-生物素復(fù)合物。與傳統(tǒng)的ELISA不同，采用的定量抗體芯片試劑通過在玻璃表面排列各種特異性標(biāo)志物捕獲抗體，可以在一個實驗中檢測多種腫瘤標(biāo)志物。該高通量高密度的抗體芯片技術(shù)，能用極其微量的標(biāo)本，同時檢測出成千上萬個蛋白質(zhì)。這種技術(shù)優(yōu)越于其它能同時檢測多個蛋白質(zhì)的技術(shù)，具有靈敏度高，高效高速，需求標(biāo)本量極低，成本低且能在普通實驗室使用的優(yōu)點。
[0007]除此以外，由于同一腫瘤可含有一種或多種標(biāo)志物，而不同或同種腫瘤的不同組織類型既可有共同的也可有不同的標(biāo)志物。因此，選擇一些特異性較高的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合測定某一腫瘤，有利于提高腫瘤檢測的敏感性和特異性。大量研究表明多腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)聯(lián)合檢測可以提高對腫瘤診斷的敏感性和特異性。例如CEA，CA125，NSE三項聯(lián)檢可以提高肺癌檢測的特異性；CA199、CEA、CA242、AFP、CA125和CA153聯(lián)合檢測是篩檢原發(fā)性肝癌的優(yōu)化組合，而CA 199、CEA、CA242、CA125、AFP、NSE對胃癌的檢測具有較重要的臨床應(yīng)用價值。另外CA199、CA125、CEA、AFP、PSA聯(lián)合檢測也可提高卵巢癌的診斷效果。CEA、CA 19-9聯(lián)檢可以提高結(jié)腸癌的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高通量、高靈敏度、高特異性和低成本的用于多腫瘤診斷的抗體試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒能夠檢測十六個臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實驗室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點。本發(fā)明在臨床診斷上的應(yīng)用有利于更快更準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)腫瘤，動態(tài)觀察腫瘤標(biāo)志物的血清學(xué)表達(dá)情況，有望用于腫瘤的篩查診斷，確診腫瘤的參考基線，健康人群的體檢，腫瘤治療療效的預(yù)測評估，腫瘤不同治療方法的選擇參考。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒，包括:抗體芯片，包括基片和在基片表面上固定的16種腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體、兩種陽性對照；腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品混合物，是將16種標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的量混合在一起的凍干混合物；生物素標(biāo)記的腫瘤標(biāo)志物檢測抗體混合液；和熒光素Cy3標(biāo)記的鏈霉未和素。
[0010]在實際操作中，將凍干的腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品混合物復(fù)溶后經(jīng)梯度稀釋制備成系列不同腫瘤標(biāo)志物濃度的混合液，用來制作多重夾心ELISA方法腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0011]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測芯片的進(jìn)一步特征，所述抗體芯片的基片是由活性環(huán)氧基團(tuán)包被的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片，用2X8孔可拆卸型框架把玻片分割成16個互不干擾的點樣小區(qū)；所述16種腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體是采用非接觸性點樣方式固定在每個點樣小區(qū)內(nèi)，每種特異性抗體、陽性對照均重復(fù)點樣四次，以致在每個點樣小區(qū)內(nèi)形成8X9矩陣的微陣列。
[0012]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測芯片的進(jìn)一步特征，所述的抗體芯片是將100 -1OOOpl的含0.02-20ng特異性抗體的PBS緩沖液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)點樣于所述玻片上，控制點樣溫度為70-75F，濕度為40-45%，將點樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，第二天真空抽氣干燥2小時。干燥后的玻片裝上配套的16孔框架把一張玻片分割成16個互不干擾的小區(qū)。用粘性膜封閉框架后，把整張芯片用不透氣的小袋封裝然后于2°C到8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]將100-1000pl的含0.02_2ng的特異性的抗體的PBS緩沖液(含有
0.01-10g/100ml牛白蛋白)用全自動點樣儀點樣于玻片上。生物素標(biāo)記的牛IgG作為陽性對照。每種抗體和兩種不同濃度的陽性對照在每個芯片中都有四次的重復(fù)。每張玻片上有16個相同的芯片點陣。將點樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，然后在干燥器中抽氣干燥2小時。干燥后的玻片裝上配套的16孔框架把一張玻片分割成16個互不干擾的小區(qū)。用粘性膜封閉框架后，把整張芯片用不透氣的小袋封裝后于2°C到8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0014]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測芯片的進(jìn)一步特征，以兩種不同濃度的生物素標(biāo)記的小牛IgG作為陽性對照和作為不同微陣列間的標(biāo)準(zhǔn)化參照系。
[0015]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測芯片的進(jìn)一步特征，所述特異性抗體為選自針對如下16種腫瘤標(biāo)志物的抗體:甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特異性抗原fPSA和tPSA，神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)，降鈣素(PCT),鐵結(jié)合蛋白(Ferritin)、β2—微球蛋白(beta 2-Microglobin)、β人絨毛膜促性腺激素(HCGb)、胃蛋白酶原(Pepsinogen I和2)、甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)、催乳素(Prolactin)和人附睪分泌蛋白4 (HE4)。
[0016]本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒通過類似于夾心法ELISA的檢測方法，用含Cy3通道的激光掃描儀對反應(yīng)結(jié)束的玻片進(jìn)行掃描成像，選用合適的激光掃描參數(shù)使芯片上最高信號接近飽和，所得圖像存儲為tiff文件。然后用芯片讀數(shù)軟件將每個點的熒光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)碼信號。通過梯度稀釋的腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)碼信號繪制每個腫瘤標(biāo)志物的信號與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每個腫瘤標(biāo)志物在未知樣品中的濃度。
[0017]本發(fā)明所述的用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒，具有以下特點和優(yōu)點:
[0018](I)在芯片的組成上，本發(fā)明采用活性環(huán)氧基團(tuán)包被的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片，實驗表明，活性環(huán)氧基團(tuán)包被的玻片可以更有效地吸附包被抗體在芯片的表面，并且使抗體的穩(wěn)定性增加。
[0019](2)在芯片的點樣前采用特定的框架結(jié)構(gòu)，優(yōu)化了芯片點陣，使得樣本可批量檢測，操作簡便，樣本用量小，互不交叉污染。
[0020](3)在芯片的制備工藝上，控制溫度為70-75F，濕度為40_45%，這樣的芯片可以改善點樣的形態(tài)，使抗體在玻片上的分布更加均勻。同時，室溫的過夜靜置有利于抗體更有效地固定在玻片上。除此以外，真空抽氣干燥2小時并用抗水蒸氣的塑料小袋抽氣密封并于4°C保存。實驗表明，用這種方法所保存的芯片使得抗體更有效地固定在芯片表面，并有效地增加芯片保存的穩(wěn)定性。
[0021](4)在芯片微陣列的點陣上，本發(fā)明采用不同濃度的雙陽性對照，并考慮同時使用兩者的不同強度信號來標(biāo)準(zhǔn)化不同的微陣列。實驗表明，本發(fā)明可以明顯地改善芯片的敏感度和重復(fù)性。
[0022]采用本發(fā)明的多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測抗體芯片試劑盒，能夠同時檢測出十多種腫瘤的十六項常用臨床診斷腫瘤標(biāo)志物，實現(xiàn)了多樣本多指標(biāo)的聯(lián)合檢測，克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實驗室推廣和規(guī)模化等優(yōu)點。這些檢測指標(biāo)可用于人群普查，有利于建立基線資料。監(jiān)測這些指標(biāo)的變化有利于準(zhǔn)確診斷病種，給與相應(yīng)的措施。尤其是對于惡性腫瘤，準(zhǔn)確診斷，及時治療，將大大提高治愈率，減低醫(yī)療費用。
【具體實施方式】
[0023]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實施例1:抗體芯片點樣條件的確定。
[0025]1、捕獲抗體的點樣濃度:將捕獲抗體在不同的緩沖液中(無菌水，PBS緩沖液，含不同濃度牛白蛋白的PBS，含不同濃度甘油的PBS緩沖液等)以2x的濃度稀釋，用非接觸性點樣儀點在芯片表面，然后用夾心ELISA方法比較它的活性和穩(wěn)定性。實驗表明，用含有
0.01-10g/100ml牛白蛋白PBS緩沖液稀釋捕獲抗體具有最好的線性率和穩(wěn)定性。
[0026]2、點樣的條件控制:在室溫下把捕獲抗體直接點在玻片表面時，捕獲抗體的點容易產(chǎn)生空心點，而且不同抗體點活性差異較大，并且在最后生成的圖像往往發(fā)現(xiàn)會有拖尾現(xiàn)象。本發(fā)明控制點樣溫度為70-75F，濕度為40-45%時所點的抗體點具有最好的形狀，并且發(fā)現(xiàn)將點樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，第二天真空抽氣干燥2小時，然后把整張芯片用不透氣的小袋封裝，用這種方法制備的玻片捕獲抗體具有最佳的活性并且可以在4°C至少穩(wěn)定六個月以上。
[0027]實施例2:本發(fā)明所述的用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒的制備。
[0028]為了檢測樣品中是否存在相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，制備固定有針對于如下腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體的玻片:甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19 — 9，癌抗原CA153，前列腺特異性抗原(fPSA和tPSA)，神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)，降鈣素(PCT),鐵結(jié)合蛋白(Ferritin), β 2—微球蛋白(beta 2-Microglobin), β人絨毛膜促性腺激素(HCGb)，胃蛋白酶原(Pepsinogen I和2)，甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin),催乳素(Prolactin)和人附睪分泌蛋白4 (HE4)。
[0029]1、抗體的來源:
[0030]采用針對表I中所列蛋白質(zhì)的特異性抗體，抗體的用途、來源、濃度均在表I詳細(xì)說明。所有的檢測抗體均用Pierce長臂生物素標(biāo)記試劑盒(Cat#131093)標(biāo)記。具體方法如下:將待標(biāo)記的檢測抗體在大量的IxPBS緩沖液(I毫升抗體在I升的PBS)中透析三次，每次至少6小時。測定抗體濃度后按每毫克抗體加入80微克生物素DMSO溶液，混勻，在室溫下反應(yīng)4小時。用PBS溶液對生物素標(biāo)記的抗體進(jìn)行透析，去除游離的生物素并標(biāo)定生物素標(biāo)記的檢測抗體濃度。
[0031]表1特異性抗體名稱，抗體的用途、來源、濃度信息
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種用于多種腫瘤診斷的抗體芯片試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 抗體芯片，包括基片和在基片表面上固定的16種腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體、兩種陽性對照； 腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品混合物，是將16種標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的量混合在一起的凍干混合物； 生物素標(biāo)記的腫瘤標(biāo)志物檢測抗體混合物；和 熒光素Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體芯片試劑盒，其特征在于:所述抗體芯片的基片是由活性環(huán)氧基團(tuán)包被的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片，用2X8孔可拆卸型框架把玻片分割成16個互不干擾的點樣小區(qū)；所述16種腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體是采用非接觸性點樣方式固定在每個點樣小區(qū)內(nèi)，每種特異性抗體、陽性對照均重復(fù)點樣四次，以致在每個點樣小區(qū)內(nèi)形成8X9矩陣的微陣列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體芯片試劑盒，其特征在于:所述的抗體芯片是將100-1OOOpl的含0.02-20ng特異性抗體的PBS緩沖液點樣于所述玻片上，該PBS緩沖液含有0.01-10g/100ml牛白蛋白，控制點樣溫度為70-75F，濕度為40_45%，將點樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，第二天真空抽氣干燥2小時；干燥后的玻片裝上配套的16孔框架把一張玻片分割成16個互不干擾的小區(qū)；用粘性膜封閉框架后，把整張芯片用不透氣的小袋封裝然后于2-8°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體芯片試劑盒，其特征在于:兩種陽性對照是采用不同濃度的生物素標(biāo)記的小牛IgG，并作為不同微陣列間的標(biāo)準(zhǔn)化參照系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性抗體為選自針對如下16種腫瘤標(biāo)志物的抗體:甲胎蛋白AFP，癌胚抗原CEA，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特異性抗原fPSA和tPSA，神經(jīng)原特異性烯醇化酶NSE，降鈣素PCT，鐵結(jié)合蛋白、β2 —微球蛋白、β人絨毛膜促性腺激素、胃蛋白酶原、甲狀腺球蛋白、催乳素和人附睪分泌蛋白4。
【文檔編號】G01N33/574GK103869068SQ201210552429
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】黃若磐, 毛應(yīng)清 申請人:廣州瑞博奧生物科技有限公司, 廣州華南生物芯片研究中心