專利名稱：一種多熒光染料的激發(fā)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光染料，尤其與多熒光染料的激發(fā)有關(guān)。
背景技術(shù)：
DNA測(cè)序是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的重要技術(shù)，自動(dòng)高速的進(jìn)行DNA測(cè)序是該技 術(shù)追求的主要目標(biāo)之一。1986年，Smith提出了四色熒光標(biāo)記自動(dòng)測(cè)序法四種具有不同 發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料標(biāo)記由聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的一系列終止片段，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺或毛 細(xì)管電泳分離后，采用激光對(duì)分離的DNA片段攜帶的熒光信號(hào)進(jìn)行激發(fā)，檢測(cè)并記錄不同 發(fā)射波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，最后得到序列信息。建立在熒光基礎(chǔ)上的檢測(cè)分析 技術(shù)，由于具有多色分析、快速和使用簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛使用在法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中。在STR (Short Tandem Repeat，短串聯(lián)重復(fù)序列)遺傳標(biāo)記的DNA分型應(yīng)用中，熒光染料與一條PCR (PolymeraseChain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))引物相連接,擴(kuò)增后突光染料摻入目的DNA的 產(chǎn)物。擴(kuò)增后的STR等位基因在凝膠上以譜帶的形式或在電泳圖譜中以峰的形式出現(xiàn)。
突光染料吸收和發(fā)射光譜之間的差異被稱作斯托克斯位移(Stokes shift)。由于 斯托克斯位移的存在，可以使用光學(xué)濾光片把激發(fā)光和發(fā)射光分開(kāi)。每種熒光染料都有其 特定的吸收光譜和發(fā)射光譜，有了合適的光學(xué)濾光片，就可以仔細(xì)地選用那些發(fā)射光譜彼 此分開(kāi)的熒光染料。這種特性容許使用多種熒光染料同時(shí)檢測(cè)幾種不同的DNA分子，用多 色熒光檢測(cè)要比單色熒光檢測(cè)快很多。
最佳熒光染料的選擇需要考慮熒光染料的發(fā)射光譜性質(zhì)和用于檢測(cè)的儀器的性 能之間的關(guān)系，而熒光染料發(fā)射光的強(qiáng)度直接取決于激發(fā)熒光染料的光強(qiáng)，因此，激發(fā)光的 光源對(duì)熒光染料的使用有著十分重要的影響。激光器是一種有效的發(fā)射激發(fā)光的光源，目 前氬離子(Ar+)激光器被廣泛應(yīng)用于可見(jiàn)光譜內(nèi)熒光染料的激發(fā)。氬離子激光器是氣體激 光器，產(chǎn)生的光的波長(zhǎng)有很多種，主要分布在480 520nm之間。氬離子激光器產(chǎn)生光的這 幾種波長(zhǎng)相互補(bǔ)充，整體提高了多種熒光染料的激發(fā)效率和均勻性。但是氬離子激光器的 體積大、功耗大，尤其是成本非常高，因此大大提高了熒光染料激發(fā)的成本，增加了使用者 的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響該技術(shù)的推廣使用。固體激光器制作簡(jiǎn)單、成本低廉，如果能夠使用 固體激光器來(lái)激發(fā)熒光染料，將大大降低熒光染料的激發(fā)成本。但是目前的一種固體激光 器只能發(fā)射一種波長(zhǎng)的光，固體激光器的單一波長(zhǎng)在實(shí)現(xiàn)多色熒光光譜激發(fā)的時(shí)候很難同 時(shí)兼顧每種染料的激發(fā)，因此使得固體激光器很難在熒光染料激發(fā)領(lǐng)域推廣使用。發(fā)明內(nèi)容
本方明的目的是提供一種可使用如固體激光器的低廉光源發(fā)射的光束來(lái)激發(fā)熒 光染料，從而大大降低熒光染料激發(fā)成本，強(qiáng)有力推動(dòng)熒光染料激發(fā)技術(shù)的應(yīng)用普及的多 熒光染料的激發(fā)方法。
為達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案
—種多熒光染料的激發(fā)方法，用于激發(fā)多個(gè)熒光染料，所述多個(gè)熒光染料所需的總激發(fā)光強(qiáng)度為W，每個(gè)熒光染料各自所需的最佳激發(fā)光的波長(zhǎng)分別為X、Y等，同時(shí)采用兩 種以上單色激光束共同對(duì)所述多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)，所述兩種以上單色激光束的總強(qiáng)度 為W，所述兩種以上單色激光束的波長(zhǎng)分別為X、Y等。
進(jìn)一步，使用固體激光器發(fā)射所述單色激光束。
進(jìn)一步，所述多個(gè)熒光染料容置于一毛細(xì)管中。
進(jìn)一步，所述多個(gè)熒光染料分別為FAM、J0E、TAMRA、R0X和Cy5，所述兩種以上單色 激光束分別是波長(zhǎng)為488納米的單色激光束和波長(zhǎng)為514. 5納米的單色激光束，所述兩種 以上單色激光束的總強(qiáng)度為25毫瓦，所述波長(zhǎng)為488納米的單色激光束的強(qiáng)度為10±3毫 瓦，所述波長(zhǎng)為514. 5納米的單色激光束的強(qiáng)度為15±3毫瓦。
進(jìn)一步，所述波長(zhǎng)為488納米的單色激光束的強(qiáng)度為10毫瓦，所述波長(zhǎng)為514. 5 納米的單色激光束的強(qiáng)度為15毫瓦。
進(jìn)一步，所述兩種以上單色激光束通過(guò)光纖合束的方法進(jìn)行合束。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著的進(jìn)步
1、本發(fā)明同時(shí)使用兩種以上單色激光束共同對(duì)多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)，可達(dá)到使 用氬離子激光器多波長(zhǎng)激光組合對(duì)多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)的相同效果，由于每種單色激光 束均可分別通過(guò)固體激光器獲得，比氬離子激光器的多波長(zhǎng)激光的獲得成本低，因此使用 兩種以上單色激光束對(duì)多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)可大大降低光源成本，從而降低熒光染料的 激發(fā)成本，有利于熒光染料激發(fā)技術(shù)的推廣應(yīng)用。
2、本發(fā)明使用10毫瓦的488納米波長(zhǎng)的單色激光束與15毫瓦的514. 5納米波長(zhǎng) 的單色激光束的組合，同時(shí)對(duì)FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五種熒光染料進(jìn)行激發(fā)，實(shí)現(xiàn)FAM、 J0E、TAMRA、R0X和Cy5同時(shí)檢測(cè)，并平衡單一波長(zhǎng)激發(fā)熒光染料光譜的不均勻性，提高光譜 檢測(cè)穩(wěn)定性，還可以調(diào)整組合激光束的能量分布，降低熒光光譜檢測(cè)中對(duì)熒光染料濃度的 依賴程度。


圖1為使用兩種單色激光束同時(shí)激發(fā)熒光染料的結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖標(biāo)記說(shuō)明如下
I組合激光束；
2熒光染料；
3毛細(xì)管；
4熒光染料的發(fā)射光譜；
5 線陣 CCD (Charge-Coupled Device,電荷f禹合兀件)；
6固體激光器；
7計(jì)算機(jī)；
8光纖合束器。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并 不限于此。
在生物識(shí)別技術(shù)中需要用到熒光染料作為標(biāo)記物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)和使用的熒光染料 的光譜帶寬都在20nm以上，在熒光染料選擇與組合設(shè)計(jì)中，為了提高檢測(cè)通量，通常采用 多熒光染料組合進(jìn)行物質(zhì)特征分析。由于不同熒光染料的吸收光譜的波長(zhǎng)各不相同，對(duì)應(yīng) 的受激發(fā)射的發(fā)射光譜的波長(zhǎng)也不相同，為了改善不同熒光染料發(fā)射光譜強(qiáng)度分布的不均 勻性，本發(fā)明提出一種使用兩種以上單色激光束組合激發(fā)多熒光染料的方法。在該方法中， 在已知多個(gè)熒光染料所需的總激發(fā)光強(qiáng)度為W，每個(gè)熒光染料各自所需的最佳激發(fā)光的波 長(zhǎng)分別為X、Y等的條件下，同時(shí)采用兩種以上單色激光束共同對(duì)上述多個(gè)熒光染料進(jìn)行激 發(fā)，該兩種以上單色激光束的總強(qiáng)度為W，該兩種以上單色激光束的波長(zhǎng)分別為X、Y等。本 方法適用醫(yī)療、化學(xué)化工、生物制藥、法醫(yī)分析等涉及到毛細(xì)管陣列分析的高通量微量分析 技術(shù)的領(lǐng)域。
如圖1所示，本發(fā)明采用兩個(gè)固體激光器6分別發(fā)射出兩種單色激光束，該兩種單 色激光束經(jīng)過(guò)光纖合束器的合束作用后組合為用于激發(fā)的組合激光束1，多個(gè)熒光染料2 容置于一毛細(xì)管3中，組合激光束I穿過(guò)毛細(xì)管3，并激發(fā)毛細(xì)管3中的熒光染料2，熒光染 料2受激發(fā)后發(fā)射光譜4被線陣CCD5采集，線陣CCD5將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)后，發(fā)送到計(jì) 算機(jī)7，計(jì)算機(jī)7對(duì)該信號(hào)進(jìn)行分析，并得出檢測(cè)結(jié)論。目前，激光器一般包括氣體激光器、 液體激光器、固體激光器、半導(dǎo)體激光器、自由電子激光器等幾種。本發(fā)明中，固體激光器 6的制作成本低廉，可大大降低本發(fā)明多熒光染料激發(fā)方法的成本，便于多熒光染料激發(fā)技 術(shù)的推廣應(yīng)用。
下面通過(guò)一個(gè)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的多熒光染料激發(fā)方法作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 由于熒光染料吸收光譜和發(fā)射光譜的依賴關(guān)系，要想找到同時(shí)激發(fā)多種熒光染料的激光器 就要首先獲得該多種熒光染料的吸收光譜。下面以FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五種染料 為例進(jìn)行說(shuō)明。
在單獨(dú)采用488納米單一波長(zhǎng)激光器激發(fā)上述五種熒光染料時(shí)，F(xiàn)AM染料激發(fā)強(qiáng) 度變化不大，而其他四種染料的激發(fā)強(qiáng)度都降低了。在單獨(dú)采用514. 5納米單一波長(zhǎng)激光 器單獨(dú)激發(fā)上述五種熒光染料時(shí)，F(xiàn)AM激發(fā)強(qiáng)度減弱非常厲害，Cy5激發(fā)強(qiáng)度也有所減弱， 而其他三種熒光染料的激發(fā)強(qiáng)度都增強(qiáng)了。在采用488納米波長(zhǎng)和514. 5納米波長(zhǎng)激光束 組合后對(duì)上述五種熒光染料進(jìn)行激發(fā)時(shí)，該兩單色激光束可以采用光纖合束或其他方式進(jìn) 行合束，已達(dá)到組合效果。該兩單色激光束合束后的激光總強(qiáng)度還是25毫瓦(該強(qiáng)度為上 述五種熒光染料激發(fā)光的最佳激發(fā)強(qiáng)度)，但是488納米波長(zhǎng)單色激光束的強(qiáng)度為10毫瓦， 514. 5納米波長(zhǎng)單色激光束的強(qiáng)度為15毫瓦，此時(shí)對(duì)上述五種熒光染料的激發(fā)可以得到最 優(yōu)的效果。用兩個(gè)固體激光器以上述的強(qiáng)度比例組合發(fā)射激發(fā)光束，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多熒光染 料的激發(fā)，將本發(fā)明的方法應(yīng)用到STR檢測(cè)中，將很大程度上解決目前用氣體激光器發(fā)射 激光帶來(lái)的體積大、價(jià)格高的問(wèn)題，同時(shí)也可以解決用單一固體激光器發(fā)射激光帶來(lái)的多 熒光染料激發(fā)不均勻的問(wèn)題。
本發(fā)明使用10毫瓦的488納米波長(zhǎng)的單色激光束與15毫瓦的514. 5納米波長(zhǎng)的 單色激光束的組合，同時(shí)對(duì)FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五種熒光染料進(jìn)行激發(fā)，實(shí)現(xiàn)FAM、 J0E、TAMRA、R0X和Cy5同時(shí)檢測(cè)，并平衡單一波長(zhǎng)激發(fā)熒光染料光譜的不均勻性，提高光譜 檢測(cè)穩(wěn)定性，還可以調(diào)整組合激光束的能量分布，降低熒光光譜檢測(cè)中對(duì)熒光染料濃度的 依賴程度。
本發(fā)明并不限于上述實(shí) 施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的任何變形、改進(jìn)、替換均落入本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種多熒光染料的激發(fā)方法，用于激發(fā)多個(gè)熒光染料，所述多個(gè)熒光染料所需的總激發(fā)光強(qiáng)度為W，每個(gè)熒光染料各自所需的最佳激發(fā)光的波長(zhǎng)分別為X、Y等，其特征在于， 同時(shí)采用兩種以上單色激光束共同對(duì)所述多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)，所述兩種以上單色激光束的總強(qiáng)度為W，所述兩種以上單色激光束的波長(zhǎng)分別為X、Y等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多熒光染料的激發(fā)方法，其特征在于，使用固體激光器發(fā)射所述單色激光束。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多熒光染料的激發(fā)方法，其特征在于，所述多個(gè)熒光染料容置于一毛細(xì)管中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多熒光染料的激發(fā)方法，其特征在于，所述多個(gè)熒光染料分別為FAM、JOE、TAMRA, ROX和Cy5，所述兩種以上單色激光束分別是波長(zhǎng)為488納米的單色激光束和波長(zhǎng)為514. 5納米的單色激光束，所述兩種以上單色激光束的總強(qiáng)度為25毫瓦， 所述波長(zhǎng)為488納米的單色激光束的強(qiáng)度為10±3毫瓦，所述波長(zhǎng)為514. 5納米的單色激光束的強(qiáng)度為15±3毫瓦。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多熒光染料的激發(fā)方法，其特征在于，所述波長(zhǎng)為488納米的單色激光束的強(qiáng)度為10毫瓦，所述波長(zhǎng)為514. 5納米的單色激光束的強(qiáng)度為15毫瓦。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的多熒光染料的激發(fā)方法，其特征在于，所述兩種以上單色激光束通過(guò)光纖合束的方法進(jìn)行合束。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多熒光染料的激發(fā)方法，用于激發(fā)多個(gè)熒光染料，多個(gè)熒光染料所需的總激發(fā)光強(qiáng)度為W，每個(gè)熒光染料各自所需的最佳激發(fā)光的波長(zhǎng)分別為X、Y等，同時(shí)采用兩種以上單色激光束共同對(duì)多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)，兩種以上單色激光束的總強(qiáng)度為W，兩種以上單色激光束的波長(zhǎng)分別為X、Y等。本發(fā)明同時(shí)使用兩種以上單色激光束共同對(duì)多個(gè)熒光染料進(jìn)行激發(fā)，可大大降低光源成本，從而降低熒光染料的激發(fā)成本，有利于熒光染料激發(fā)技術(shù)的推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103063628SQ20121053879
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者陳學(xué)亮, 李彬, 張濤, 賈二惠, 龐曉東, 趙怡鶴, 趙穎, 王守山 申請(qǐng)人:公安部第一研究所, 北京中盾安民分析技術(shù)有限公司