胃癌靶向量子點及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬納米生物材料領(lǐng)域，涉及胃癌靶向量子點及其制備方法和在腫瘤檢測中的應用，本發(fā)明采用CdTe近紅外量子點為顯像材料，與胃癌單克隆抗體CC49結(jié)合，制成能夠特異性結(jié)合胃癌細胞并熒光成像的免疫熒光探針。本發(fā)明利用量子點在生物體內(nèi)具有良好的生物相容性，能夠隨循環(huán)系統(tǒng)運行，制得靶向量子點對胃癌細胞進行免疫熒光成像，并將進一步檢測在胃癌動物模型的腫瘤轉(zhuǎn)移部位與腫瘤細胞結(jié)合，激發(fā)后發(fā)射熒光，使腫瘤細胞顯像，從而達到腫瘤檢測的目的。本發(fā)明的靶向量子點基于其生物體毒性較小，具有潛在的臨床應用價值。
【專利說明】胃癌靶向量子點及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米生物材料領(lǐng)域，涉及胃癌靶向量子點及其制備方法和在腫瘤檢測中的應用，尤其涉及一種胃癌免疫熒光探針及其制備方法和在胃癌細胞熒光成像中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道，近50年來全世界胃癌的發(fā)病率有了一定程度的下降，但其仍然是一種嚴重危害人類健康的疾病。在各種癌癥中，胃癌發(fā)病率高居第四位，在日本、韓國、朝鮮、中國等亞洲國家甚至高達0.080% ;其死亡率則居第二位，僅次于肺癌，達85 %。目前，外科手術(shù)治療是臨床治療胃癌的重要手段。但是臨床實踐胃癌手術(shù)中的腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的清掃均是“盲目”進行的，其中，不論是西方學者主張的Dl淋巴清掃手術(shù)(即手術(shù)中切除原發(fā)病灶及周圍足夠范圍的正常胃壁，并清掃第一站淋巴結(jié))，還是日本學者主張的D2淋巴清掃手術(shù)(即術(shù)中結(jié)扎血管后將相應區(qū)域的淋巴結(jié)徹底清除)，或者D3淋巴結(jié)清掃術(shù)(清除包括肝十二指腸韌帶、腸系膜上動脈、腹主動脈旁、甚至膈肌及縱膈淋巴結(jié))都只是對規(guī)定區(qū)域的淋巴結(jié)進行清掃，并不能根據(jù)病人的個體化差異，明確地對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行清除，由此，淋巴結(jié)的過度清掃或殘留時有發(fā)生。因而腫瘤細胞的追蹤顯像成為了胃癌手術(shù)中淋巴結(jié)清掃術(shù)的關(guān)鍵。鑒于上述臨床實踐中存在的問題，對探索一種能夠在人體內(nèi)追蹤標記胃癌細胞的標記探針提出了迫切的需求。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)對胃癌細胞的顯像研究中使用較多的顯像材料有傳統(tǒng)的有機染料和放射性同位素等，但是傳統(tǒng)的生物活體染料(如2%專利藍染料、1%異硫藍染料等)或放射性同位素(如99m锝標記的錫膠體或硫膠體等)在活體腫瘤顯像應用中都存在著很大的缺陷，如在標記活體淋巴結(jié)時顏色很難辨別、一旦染料外滲則很難看清染色的淋巴結(jié)、有較高的假陰性率等；而放射性同位素因其存在穿透效應(shine-through effect),可導致發(fā)光淋巴結(jié)與同位素注射處組織互相混淆，且同位素對醫(yī)生和病人均存在放射性損害。
[0004]納米晶體熒光標記材料量子點又稱半導體量子點或半導體納米微晶體，其具有獨特的光學特性。斯托克位移(Stoke' s shift)為激發(fā)波長和發(fā)射波長峰值的差值，斯托克位移較大可以避免發(fā)射譜與激發(fā)譜的重疊，從而提高在免疫熒光檢測的靈敏度。有機熒光染料斯托克位移較小，檢測時發(fā)射光易與激發(fā)光光譜范圍發(fā)生重疊，導致檢測假陽性率增高，而近紅外量子點光譜范圍窄(約為有機染料光譜1/3)，增加了其斯托克位移(約為200-300nm)，提高了在應用過程中的靈敏度。有機染料發(fā)射光譜通常位于450-550之間，在此范圍內(nèi)，生物醫(yī)學標本如膠原蛋白、P卜啉、黃素等通常有很強的自發(fā)熒光背景，所以標記熒光通常被強的組織自發(fā)熒光所淹沒，在生物熒光成像的應用中有很多限制。有研究開始關(guān)注近紅外量子點在動物體內(nèi)的分布，將單純的量子點注射后觀察其動物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的移行和各器官中的分布，但迄今尚未見有關(guān)近紅外量子點修飾后其對腫瘤細胞的追蹤和顯像的報道，尤其未涉及胃癌領(lǐng)域。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種胃癌靶向量子點及其制備方法，具體涉及一種能夠與胃腺癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合的靶向量子點及其制備方法。尤其涉及一種胃癌免疫熒光探針及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的進一步目的是提供所述的胃癌靶向量子點在腫瘤檢測中的應用，尤其是用于胃癌動物模型中腫瘤細胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的顯像。
[0007]本發(fā)明提供了能夠與胃癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合并對其進行免疫熒光成像的靶向量子點，對胃癌細胞在體外成像的能力進行了描述，結(jié)果顯示其對胃癌細胞免疫熒光顯像的效果良好，具有在胃癌動物模型中進行胃癌細胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)顯像的前景。
[0008]本發(fā)明利用量子點在生物體內(nèi)具有良好的生物相容性，能夠隨循環(huán)系統(tǒng)運行的特點，采用近紅外納米量子點為載體，結(jié)合胃癌腫瘤細胞單克隆抗體CC49，制成胃癌腫瘤細胞靶向量子點探針，在體外對腫瘤細胞進行熒光標記，確定該探針可以與胃癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合。
[0009]更具體的，本發(fā)明采用CdTe近紅外量子點為顯像材料，與胃癌單克隆抗體CC49結(jié)合，制成能夠特異性結(jié)合胃癌細胞并熒光成像的免疫熒光探針。
[0010]本發(fā)明中，胃癌細胞單克隆抗體CC49和CdTe近紅外量子點按4 ；1的比例接合。
[0011]本發(fā)明中，所述的CC49抗體是能夠特異性識別胃癌細胞表面抗原TAG-72的單克隆抗體；胃癌細胞表面抗原TAG-72是一種高分子糖蛋白，分子量介于220KD和400KD之間，表達于多種惡性腫瘤細胞表面或胞內(nèi)，如卵巢癌，肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，在胃癌人群中的表達率高達75%。
[0012]本發(fā)明中的胃癌靶向量子點可通過抗原抗體反應，與胃癌細胞發(fā)生結(jié)合，通過量子點的激發(fā)熒光達到胃癌細胞免疫熒光成像的目的。
[0013]更具體的，本發(fā)明提供了一種胃癌免疫熒光探針，其通過下述方法和步驟制備，
[0014]I)制備近紅外CdTe量子點
[0015]首先制備NaHTe溶液:將NaBH4溶于去離子水中，冰浴狀態(tài)下通平穩(wěn)氮氣流30min，除去溶液中的氧氣，然后加入碲粉(Te)，繼續(xù)通入氮氣，制成淡紫色NaHTe溶液；
[0016]其次制備CdC12-MPA溶液:2mmol CdC12加入去離子水中，加入3.6mmol MPA，用2mol/L NaOH調(diào)溶液pH值至9 ；
[0017]最后制備CdTe量子點=NaHTe溶液與CdC12_MPA溶液混合后攪拌，將此前軀體溶液加入到反應釜中，放入185 V烘箱中反應，粗產(chǎn)物用乙醇沉淀洗滌后，40 °C真空烘干備用；
[0018](2)制備胃癌腫瘤細胞靶向量子點
[0019]在CdTe量子點水溶液中加入EDC(l-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)的水溶液，室溫反應，反應液中CdTe: EDC: NHS =I: 100: 100 ;半小時后加入抗體IgG，反應液中CdTe:抗體=I: 4，繼續(xù)反應后停止，用超濾管(look)離心分離，產(chǎn)物分散在PBS (pH = 7.4)溶液中，冰箱保存；
[0020]本發(fā)明進行了量子點和靶向量子點的電鏡下成像及光譜分析，
[0021]將制得的量子點和靶向量子點去離子水稀釋后滴于銅網(wǎng)支持的碳膜上，待溶劑揮發(fā)后，電鏡調(diào)至工作電壓200kV工作模式stem mode進行觀察，獲得量子點和靶向量子點的電鏡下圖像。
[0022]量子點和祀向量子點的稀釋產(chǎn)物用spectrofluorimeter在激發(fā)波長450nm的激發(fā)光下，以Inm為最小間隔記錄550nm到800nm的發(fā)射光光強度制作光譜曲線。
[0023]本發(fā)明的進一步提供所述的胃癌靶向量子點在腫瘤檢測中的應用，本發(fā)明的實施例中用于胃癌細胞免疫熒光成像，
[0024]MGC80-3胃癌腫瘤細胞細胞傳代于4塊孔底帶有玻片的六孔板中，標記為1，2，3，4號，I號為空白組，作為陰性對照，2號為靶向量子點組，3號為純量子點組，4號為熒光二抗標記組，作為陽性對照組。四組均用4%的多聚甲醛固定，后用10%的小牛血清封閉30min。后I號加入ImlPBS作為對照,2號加入祀向量子點Iml, 3號加入相同濃度量子點Iml, 4號加入一抗lml。4組均置于37。C溫箱中孵育2h，后1，2，3組加入DAPI對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下對I，2，3組進行觀察。4組PBS清洗后，加入顯示熒光二抗lml，PBS I: 500稀釋，37。C溫箱中孵育lh，后DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察，獲得四組免疫熒光圖片，其結(jié)果顯示:場發(fā)射掃描透射電鏡觀察顯示量子點直徑為2.241-4.914nm，平均為3.468nm，靶向單個量子點直徑為3.304-5.652nm，平均為3.716nm，二者直徑差值為0.248nm。靶向量子點制作后會出現(xiàn)多個靶向量子點發(fā)生聚集，形成大小不一的量子點簇的現(xiàn)象，直徑約為
7.692-55.769nm,平均 23.763nm。
[0025]光譜分析中，以光強度為縱坐標，發(fā)射光波長為橫坐標將光譜分析數(shù)據(jù)進行分析并分別作出了量子點和靶向量子點的光譜曲線，結(jié)果顯示量子點發(fā)射光波長位于620-780nm之間，波峰在680nm左右，而靶向量子點發(fā)射光波長位于600_800nm之間，波峰在71 Onm左右。
[0026]實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明制得的靶向量子點能夠與胃癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以看到清晰的細胞熒光圖像，而單純的近紅外量子點并不能與腫瘤細胞結(jié)合，在熒光顯微鏡下不能對細胞進行熒光成像。
[0027]本發(fā)明的的胃癌細胞免疫熒光探針可用于制備胃癌細胞免疫熒光成像制劑?；蜻M一步制備檢測腫瘤的試劑盒，尤其是檢測胃癌的試劑盒。
[0028]本發(fā)明的胃癌腫瘤細胞靶向量子點探針毒性小，具有良好的生物相容性，可以與胃癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合，并進行免疫熒光顯像。本發(fā)明可以用于胃癌腫瘤細胞的免疫熒光成像，對通過淋巴循環(huán)對活體動物模型中的轉(zhuǎn)移腫瘤細胞進行定位從而為標記腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)提供了理論依據(jù)。
[0029]本發(fā)明具備的優(yōu)點有，
[0030]1，本發(fā)明中的近紅外量子點發(fā)射光波長位于近紅外區(qū)^50_900nm)，不僅克服了有機熒光染料的缺點，而且在該光譜范圍內(nèi)，水和紅細胞的吸光度最小，動物體內(nèi)環(huán)境對發(fā)射光的吸收、減弱程度最小，量子點發(fā)射光的光強度大，熒光成像更加清晰。
[0031]2，本發(fā)明采用水相合成法制作的量子點具有很好的水溶性，而且用于動物體內(nèi)不會發(fā)生排斥反應，有利于其在腫瘤應該標記中的進一步應用。
[0032]3，本發(fā)明的靶向量子點光強度強(比有機染料強1000倍)，散射少，在免疫熒光的應用中具有獨特的優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0033]圖1為場發(fā)射掃描透射電鏡下的量子點及靶向量子點圖片，其中A為量子點圖片，B、C為靶向量子點圖片。
[0034]圖2為量子點及靶向量子點的光譜分析曲線，藍色為量子點光譜曲線，紅色為靶向量子點光譜曲線。
[0035]圖3為量子點及靶向量子點熒光成像圖，橫行中，I為空白對照組，2為靶向量子點組，3為陰性對照組，4為陽性對照組，縱列中A為光學顯微鏡下成像，B為熒光顯微鏡下成像，C為細胞核成像，D為B、C的合成圖片。
【具體實施方式】:
[0036]實施例1
[0037]制備近紅外CdTe量子點
[0038]首先制備NaHTe溶液:IOOmg NaBH4溶于20ml去離子水中，冰浴狀態(tài)下通平穩(wěn)氮氣流30min，以除去溶液中的氧氣，然后迅速加入127mg碲粉，繼續(xù)通入氮氣，制成淡紫色NaHTe溶液。其次制作CdC12_MPA溶液:366.6mg (2mmol) CdC12加入IOOml去離子水中，然后加入382.1mg (3.6mmol)MPA，用2mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)至9。最后一步為制作CdTe量子點:1ml NaHTe溶液與20ml CdC12_MPA溶液混合后迅速攪拌，然后將此前軀體溶液9mL加入到反應釜中，放入185°C烘箱中反應一段時間，粗產(chǎn)物用乙醇沉淀洗滌3次，放入40°C真空烘箱中烘干備用。
[0039]制備胃癌細胞靶向量子點
[0040]13.5 ill EDC、13.5u I NHS和50 yl實施方式I中制作的量子點溶液混合，室溫下?lián)u床上搖動30min,加入594 ii I CC49胃癌單克隆抗體，反應液中CdTe: antibody =I: 4,常溫下反應2h,用IOOk超濾管離心分離三次后,將產(chǎn)物重新分散在PBS (pH = 7.4)溶液中。放入冰箱保存。
[0041]量子點和靶向量子點的場發(fā)射透射電鏡下成像及光譜分析
[0042]電鏡成像:將制作的量子點和靶向量子點去離子水稀釋后滴于銅網(wǎng)支持的碳膜上，待溶劑完全揮發(fā)后，電鏡調(diào)至工作電壓200kV工作模式stem mode進行觀察，獲得量子點和靶向量子點的電鏡下圖像。光譜分析:量子點和靶向量子點的稀釋產(chǎn)物用spectrofluorimeter在激發(fā)波長450nm的激發(fā)光下激發(fā)，窄縫寬度為1mm，以Inm為最小間隔記錄550nm到800nm的發(fā)射光光強度制作光譜曲線。
[0043]胃癌細胞免疫熒光成像
[0044]MGC80-3胃癌腫瘤細胞細胞傳代于4塊孔底帶有玻片的六孔板中，標記為1，2，3，4號，I號為空白組，作為陰性對照，2號為靶向量子點組，3號為純量子點組，4號為熒光二抗標記組，作為陽性對照組，四組均在_培養(yǎng)箱中孵育，細胞長滿后，吸除培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，4%的多聚甲醒固定15min, PBS清洗三次,每次5min, 10%的小牛血清封閉30min,PBS清洗三次，每次5min。后I號每孔加入lmlPBS，2號加入靶向量子點1ml，3號加入相同濃度量子點lml，4號加入一抗lml，PBS I: 500稀釋。4組均置于37。C溫箱中孵育2h，后1，2，3組加入DAPI對細胞核進行染色5min，后PBS清洗3次，每次，5min，熒光顯微鏡下對1，2，3組進行觀察。4組PBS清洗3次，每次3分鐘，加入熒光二抗lml，PBS I: 500稀釋，37。C溫箱中孵育lh，后DAPI染色，PBS清洗三次，每次三分鐘，熒光顯微鏡下觀察。共獲得四組免疫熒光圖片(A為光鏡下成像，B為熒光顯微鏡下成像，C為細胞核熒光染色圖像，D為B、C的合成圖像)。
[0045]本發(fā)明分別在光鏡下和熒光顯微鏡下對空白組(I號)，靶向量子點組(2號)，量子點組(3號)和熒光二抗組(4號)進行了觀察?？瞻捉M光鏡下細胞染色非常淺，幾乎不可辨，熒光顯微鏡下無細胞影像，DAPI染色后在紫外波長激發(fā)光激發(fā)下可見染色的細胞核。靶向量子點組光鏡下即可見深染的細胞圖像，熒光顯微鏡下也可以看到高亮度的細胞熒光顯像，DAPI染色可以看見細胞核熒光顯像，兩張圖片合成后可見細胞核位置和高亮度的細胞位置重合。未嫁接抗體的單純量子點組光鏡下很難辨別細胞，熒光顯微鏡下細胞影像略微可見，DAPI染色可清楚分辯細胞核的位置，合成后可見細胞核影像與模糊的細胞影像重
口 o
[0046]本發(fā)明中采用的陽性對照組是發(fā)射光波長位于FITC區(qū)間的熒光二抗進行細胞標記，光鏡下可以看到模糊的細胞影像，熒光顯微鏡FITC模式下可以看到高亮度的清晰的細胞影像，DAPI染色可以看見清晰的細胞核染色圖，圖片合成后可以看到細胞熒光成像和細胞核成像位置重合。實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明制得的靶向量子點能夠與胃癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以看到清晰的細胞熒光圖像，而單純的近紅外量子點并不能與腫瘤細胞結(jié)合，在熒光顯微鏡下不能對細胞進行熒光成像。
【權(quán)利要求】
1.一種胃癌細胞免疫熒光探針，其特征在于，由CdTe近紅外量子點為顯像材料，與胃癌單克隆抗體CC49接合，制成免疫熒光探針。
2.按權(quán)利要求1所述的胃癌細胞免疫熒光探針，其特征在于，所述的胃癌細胞單克隆抗體CC49與CdTe近紅外量子點按4: I的比例接合。
3.按權(quán)利要求1所述的胃癌細胞免疫熒光探針制備方法，其特征是，通過下述方法和步驟: 1)制備近紅外CdTe量子點 首先制備NaHTe溶液:將NaBH4溶于去離子水中，冰浴狀態(tài)下通平穩(wěn)氮氣流30min，除去溶液中的氧氣，然后加入碲粉(Te)，繼續(xù)通入氮氣，制成淡紫色NaHTe溶液； 其次制備CdC12-MPA溶液:2mmol CdC12加入去離子水中，加入3.6mmol MPA，用2mol/L NaOH調(diào)溶液pH值至9 ; 最后制備CdTe量子點=NaHTe溶液與CdCl2-MPA溶液混合后攪拌，將此前軀體溶液加入到反應釜中，放入185°C烘箱中反應，粗產(chǎn)物用乙醇沉淀洗滌后，40°C真空烘干備用； 2)制備胃癌腫瘤細胞靶向量子點 在CdTe量子點水溶液中加入EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)的水溶液，室溫反應，反應液中CdTe: EDC: NHS =I: 100: 100 ;半小時后加入抗體IgG，反應液中CdTe:抗體=I: 4，繼續(xù)反應后停止，用超濾管(look)離心分離，產(chǎn)物分散在PBS，pH = 7.4的溶液中，冰箱保存。
4.權(quán)利要求1的胃癌細胞免疫熒光探針在制備胃癌細胞免疫熒光成像制劑中的應用。
5.權(quán)利要求1的胃癌細胞免疫熒光探針在制備檢測腫瘤試劑盒中的用途。
6.按權(quán)利要求5所述的用途，所述的腫瘤是胃癌。
【文檔編號】G01N21/64GK103513025SQ201210210733
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】孫鵬, 張云鵬, 楊武利, 張旭瑞 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院, 復旦大學