專利名稱：灌流顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及ー種灌流顯微鏡。
背景技術(shù)：
在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生命材料低溫保存過程中的微生物材料損傷是其低溫?fù)p傷的重要來源。微生物材料可以是細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等一切微生物材料。在下述實(shí)施例中重點(diǎn)以細(xì)胞為例加以說明。典型的低溫保存過程主要包括(I)低溫保存前，低溫保護(hù)劑的添加；⑵冷凍過程中，降溫速率的程序化控制；(3)復(fù)溫后、臨床使用前，低溫保護(hù)劑的去除。要減少低溫?fù)p傷，進(jìn)行低溫保存過程的這三個(gè)重要步驟的優(yōu)化設(shè)計(jì)，需要測定細(xì)胞的重要生物物理學(xué)參數(shù)例如細(xì)胞等滲體積、細(xì)胞非滲透性體積、細(xì)胞膜對(duì)低溫保護(hù)劑和水的滲透性參數(shù)及其活 化能等。通常采用灌流顯微鏡來觀測細(xì)胞在不同溫度下，當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo(hù)劑溶液組分或濃度發(fā)生變化時(shí)的體積響應(yīng)，借助非線性擬合技術(shù)擬合出細(xì)胞膜對(duì)于低溫保護(hù)劑和水的滲透性參數(shù)及其活化能，以及細(xì)胞的等滲體積和非滲透性體積等關(guān)鍵參數(shù)。在下述實(shí)施例中，如無特殊說明所涉及的溶液可為ニ元、三元或者多元溶液。通常地，灌流顯微鏡主要包括載物臺(tái)上的微灌流腔，用于控制微灌流腔內(nèi)溶液處于低溫狀態(tài)的低溫循環(huán)浴。一個(gè)為微灌流腔注入溶液的注入注射器和ー個(gè)從微灌流腔內(nèi)抽取溶液的抽取注射器。通過注入注射器與抽取注射器的配合使用，能夠保持微灌流腔內(nèi)溶液的動(dòng)態(tài)平衡，從而保證微灌流腔內(nèi)溶液壓カ的平衡。同吋，灌流顯微鏡還包括ー套用于觀察微灌流腔內(nèi)細(xì)胞變化的裝置，通常地，該裝置主要包括聚光鏡、透光孔和物鏡，光線在聚光鏡的匯聚作用下得到加強(qiáng)，經(jīng)透光孔射入微灌流腔，微灌流腔內(nèi)細(xì)胞的變化情況經(jīng)物鏡放大后被觀察到，即可進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。然而，這種結(jié)構(gòu)的灌流顯微鏡存在的問題是由于只有ー個(gè)注入注射器和一個(gè)抽取注射器，便只能實(shí)現(xiàn)溶液從ー種濃度到另外一種濃度的切換，也即只能測得細(xì)胞在這兩種不同濃度溶液下的體積響應(yīng)。想要測量細(xì)胞在另外ー種溶液濃度下的體積響應(yīng)，就需要更換一次注入注射器內(nèi)溶液的濃度，為連續(xù)試驗(yàn)帶來了很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種灌流顯微鏡，技術(shù)方案如下包括觀察裝置、溫度控制系統(tǒng)和設(shè)置有入口和出口的微灌流腔；以及至少兩個(gè)注入速度分別控制的注入注射器，至少ー個(gè)抽取注射器，注入注射器并聯(lián)后，與微灌流腔的入ロ連接，抽取注射器與微灌流腔的出ロ連接。優(yōu)選地，注入注射器的注入速度和抽取注射器的抽取速度分別由不同的注射泵進(jìn)行控制。
進(jìn)ー步地，還包括連接在注入注射器和微灌流腔的入口之間的微混合腔。優(yōu)選地，溫度控制系統(tǒng)包括冷卻模塊、加熱模塊和溫度傳感器；通過溫度傳感器對(duì)微灌流腔的溫度進(jìn)行檢測反饋，控制冷卻模塊和/或加熱模塊工作，進(jìn)行溫度控制。優(yōu)選地，溫度傳感器置于微灌流腔的部分腔壁中，加熱模塊置于溫度傳感器的相對(duì)側(cè)的微灌流腔之上，冷卻模塊置于加熱模塊之上，微灌流腔、加熱模塊及冷卻模塊由保溫材料包裹。優(yōu)選地，放置溫度傳感器的腔壁部分的材料為硅玻璃或聚ニ甲基硅氧烷或聚酰亞胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯，其他腔壁部分的材料為聚ニ甲基硅氧烷或硅玻璃或聚酰亞胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯。
進(jìn)ー步地，還包括在微灌流腔的內(nèi)壁上間隔設(shè)置的第一檔板和第二檔板；第一擋板和第二檔板將微灌流腔分隔為相互連通的第一緩沖腔、微生物材料腔和第二緩沖腔，微生物材料腔位于第一緩沖腔和第二緩沖腔之間，第一擋板和第二擋板阻擋微生物材料在微生物材料腔與第一緩沖腔和第二緩沖腔之間流動(dòng)；入口位于第一緩沖腔上，出ロ位于第二緩沖腔上；微生物材料腔上設(shè)置有加載入口和卸載出ロ。優(yōu)選地，觀察裝置包括攝像頭，微型計(jì)算機(jī)，以及位于微灌流腔ー側(cè)的聚光鏡，透光孔，位于微灌流腔另ー側(cè)與聚光鏡相對(duì)設(shè)置的物鏡。本發(fā)明提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是在本發(fā)明的實(shí)施例中，在微灌流腔的入口端并聯(lián)接入了兩個(gè)注入注射器，其注入速度分別控制，這樣，通過分別控制這兩個(gè)注入注射器的注入速度，可以精確控制微灌流腔內(nèi)溶液濃度的變化，實(shí)現(xiàn)溶液濃度由一種濃度到多種濃度的變化，從而可以測量細(xì)胞在周圍溶液濃度變化過程中和變化后的體積響應(yīng)。進(jìn)ー步地，通過連接在注入注射器和微灌流腔入ロ之間的微混合腔，可以預(yù)先對(duì)溶液進(jìn)行混合，使得進(jìn)入微灌流腔的溶液濃度均勻一致，從而保證灌流過程中細(xì)胞周圍溶液濃度均勻一致。進(jìn)ー步地，采用具有冷卻模塊和加熱模塊的溫度控制系統(tǒng)，能夠精確控制溶液溫度的程序化降低或升高及與之同步的濃度變化，可以模擬細(xì)胞在冷凍或者復(fù)溫過程中周圍溶液的熱力學(xué)狀態(tài)的變化，從而將其用于研究細(xì)胞在非平衡冷凍或者復(fù)溫融解過程中的體積響應(yīng)，測定低溫下細(xì)胞膜的生物物理學(xué)參數(shù)。進(jìn)ー步地，通過微灌流腔內(nèi)壁上間隔設(shè)置的第一擋板和第二檔板將微灌流腔分隔為相互連通的第一緩沖腔、微生物材料腔和第二緩沖腔。一方面，可以使溶液在第一緩沖腔內(nèi)再次混合，使得進(jìn)入微生物材料腔的溶液濃度更加均勻；另一方面，分隔出專門的微生物材料腔，可以保證微生物材料始終處于觀察區(qū)域；第三方面，通過在微生物材料腔上設(shè)置加載入口和卸載出口，可以方便地進(jìn)行微生物材料的更換，有利于進(jìn)行連續(xù)多組試驗(yàn)。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖所示實(shí)施例得到其他的實(shí)施例及其附圖。
圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的冷卻模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的冷卻模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的微灌流腔的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步地詳細(xì)描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有實(shí)施例都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 為了能夠連續(xù)測量細(xì)胞在多種濃度溶液下的體積響應(yīng)，本發(fā)明提出了ー種灌流顯微鏡，包括觀察裝置34、溫度控制系統(tǒng)35和設(shè)置有入口 24和出ロ 25的微灌流腔9 ;以及至少兩個(gè)速度分別控制的注入注射器26和27 ;至少ー個(gè)抽取注射器28 ;注入注射器26和27并聯(lián)后，與微灌流腔9的入ロ 24連接；抽取注射器28與微灌流腔9的出口 25連接。其中，觀察裝置34主要用于觀察微灌流腔9內(nèi)的細(xì)胞體積響應(yīng)情況；溫度控制系統(tǒng)35根據(jù)需要提供合適的試驗(yàn)溫度，以保持細(xì)胞的存活狀態(tài)，同時(shí)可進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)微灌流腔9內(nèi)溶液溫度按照特定的速率進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化；微灌流腔9用于細(xì)胞灌流；入口 24既可用于溶液注入，又可用于細(xì)胞加載；出口 25既可用于溶液抽取，又可用于細(xì)胞卸載；通過注入注射器26、27和抽取注射器28的配合使用，可以保證微灌流腔9內(nèi)溶液流量的動(dòng)態(tài)平衡。通過在注入注射器26和27中添加不同濃度的溶液，井分別設(shè)定注入速度，可以在微灌流腔9內(nèi)得到一定濃度的溶液，改變注入速度可以得到不同濃度的溶液，通過分別控制注入注射器26和27的注入速度可以得到多種不同濃度的溶液。通過觀察裝置34可以觀察到細(xì)胞在多種不同濃度溶液下的體積響應(yīng)。更優(yōu)選地，在注入注射器26、27和微灌流腔9的入ロ 24之間連接ー個(gè)微混合腔3。通過微混合腔3對(duì)溶液的預(yù)先混合作用，使得進(jìn)入微灌流腔9內(nèi)的溶液濃度均勻一致，從而保證灌流過程中細(xì)胞周圍溶液濃度均勻一致。為了使溶液能夠更加充分地混合，也可以在注入注射器26、27和微灌流腔9之間串聯(lián)多個(gè)微混合腔3。更優(yōu)選地，對(duì)微灌流腔9內(nèi)溶液溫度進(jìn)行控制的溫度控制系統(tǒng)35包括冷卻模塊6、加熱模塊7和溫度傳感器31。溫度傳感器31用于檢測微灌流腔9內(nèi)溶液的溫度，并將檢測到的溫度信息進(jìn)行反饋，以控制冷卻模塊6和/或加熱模塊7工作，使溶液溫度根據(jù)需要升高或降低，實(shí)現(xiàn)溶液溫度按照特定的速率進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化，以滿足試驗(yàn)中不同的溫度需要，從而可以準(zhǔn)確測定冷凍過程細(xì)胞的滲透性參數(shù)。其中，溫度控制系統(tǒng)35不限于冷卻模塊6、加熱模塊7和溫度傳感器31，也可以由其他能夠?qū)崿F(xiàn)溫度控制、調(diào)節(jié)功能的裝置替代，具體可以根據(jù)微灌流腔9及觀察裝置34的結(jié)構(gòu)來配合設(shè)置溫度控制系統(tǒng)35。更優(yōu)選地，在微灌流腔9的內(nèi)壁上間隔設(shè)置的第一檔板20和第二檔板22將微灌流腔9分隔為相互連通的第一緩沖腔19、微生物材料腔21和第二緩沖腔23，微生物材料腔21位于第一緩沖腔19和第二緩沖腔23之間，第一擋板20和第二擋板22阻擋微生物材料在微生物材料腔21與第一緩沖腔19和第二緩沖腔23之間流動(dòng)；入口 24位于第一緩沖腔19上，出口 25位于第二緩沖腔23上；微生物材料腔21上設(shè)置有加載入口 29和卸載出ロ30。微灌流腔9的這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，一方面，可以使溶液在第一緩沖腔19內(nèi)再次混合，使得進(jìn)入微生物材料腔21的溶液濃度更加均勻；另一方面，分隔出專門的微生物材料腔21，可以保證微生物材料始終處于觀察區(qū)域；第三方面，通過在微生物材料腔21上設(shè)置加載入ロ 29和卸載出口 30，與溶液入口 24和溶液出口 25加以區(qū)分，可以方便地進(jìn)行微生物材料的更換，有利于進(jìn)行連續(xù)多組試驗(yàn)。為了更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案以及有益效果，下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的介紹，實(shí)施例只是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明并不限于此。
圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖I所示，本發(fā)明實(shí)施例公開了ー種灌流顯微鏡，包括觀察裝置34、溫度控制系統(tǒng)35和設(shè)置有入口 24和出ロ 25的微灌流腔9 ;以及兩個(gè)速度分別控制的注入注射器26和27 ; —個(gè)抽取注射器28 ;注入注射器26和27并聯(lián)后，與微灌流腔9的入ロ 24連接；抽取注射器28與微灌流腔9的出口 25連接；在注入注射器26、27和微灌流腔9的入口 24之間連接微混合腔3。在本實(shí)施例中，兩個(gè)注入注射器和一個(gè)抽取注射器分別由不同的注射泵進(jìn)行注入速度或抽取速度的控制。具體而言，注射泵I控制注入注射器26的注入速度，注射泵2控制注入注射器27的注入速度，注射泵8控制抽取注射器28的抽取速度，灌流過程中，通?？傋⑷胨俣群涂偝槿∷俣仁冀K保持一致。其中，注射泵對(duì)注射器的速度控制可以通過軟件編程實(shí)現(xiàn)。通過軟件編程控制，一方面，可以精確控制注入注射器26和27各自的注入速度，實(shí)現(xiàn)溶液濃度的不同配比；另一方面，精確控制總注入速度和總抽取速度始終保持一致，以保持微灌流腔9內(nèi)的流量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而確保微灌流腔9內(nèi)的壓カ平衡。其中，在入口 24處設(shè)置入口導(dǎo)管，在出口 25處設(shè)置出口導(dǎo)管。采用毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)注入注射器26與27之間，以及注入注射器26、27與微混合腔3之間的連接，連接微混合腔3的毛細(xì)管通過入口導(dǎo)管與微灌流腔9的入口 24相連，連接抽取注射器28的毛細(xì)管通過出ロ導(dǎo)管與微灌流腔9的出ロ 25相連。由于用于連接的毛細(xì)管內(nèi)徑很小，優(yōu)選為O. 2 1mm，其內(nèi)部流體流動(dòng)為層流，為了增強(qiáng)溶液的混合效果，必須進(jìn)行強(qiáng)化混合。 在本實(shí)施例中，冷卻模塊6為冷循環(huán)模塊，加熱模塊7為電熱薄膜，溫度傳感器31為熱電偶；微灌流腔9為由上壁、下壁和側(cè)壁圍成的空間，熱電偶置于微灌流腔9的下壁中，電熱薄膜置于微灌流腔9之上，冷循環(huán)模塊置于電熱薄膜之上。在試驗(yàn)過程中為了保證微灌流腔9與外界隔離，防止與外界進(jìn)行熱交換，實(shí)現(xiàn)保溫作用，將微灌流腔9、電熱薄膜及冷循環(huán)模塊用保溫材料32進(jìn)行封裝。為了保證光線能夠透過保溫材料32、冷循環(huán)模塊和電熱薄膜到達(dá)微灌流腔9，需要在其上設(shè)置透光孔5，以便光線射入。在本實(shí)施例中，微灌流腔9是由兩種材料構(gòu)成的封閉殼體，具體地，上壁和側(cè)壁由PDMS (聚ニ甲基娃氧燒，polydimethylsiloxane) 18制成,下壁由娃玻璃33制成。作為等效變換方式，也可以僅將下壁的一部分用硅玻璃33制成，將熱電偶設(shè)置于硅玻璃33中，而將微灌流腔9的其余部分腔壁都用PDMS 18制成。由于硅玻璃33與溶液直接接觸，且硅玻璃33具有良好的導(dǎo)熱性能，將熱電偶設(shè)置于其中，可以間接檢測溶液的溫度。PDMS 18是ー種透光性良好的材料，光線可以通過PDMS18照射進(jìn)微灌流腔9 ;其中，PDMS 18用于構(gòu)成微灌流腔9的微流體通道的尺寸優(yōu)選為長10 150毫米,寬I 10毫米,深5 100微米。在其他的實(shí)施例中，微灌流腔9的下壁或下壁上用于放置熱電偶的腔壁部分的材料為具有足夠硬度、良好的生物相容性和導(dǎo)熱性能的透光材料，例如可以是聚ニ甲基硅氧烷、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲脂、聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯等；微灌流腔9的上壁和側(cè)壁部分的材料為具有足夠硬度、良好的生物相容性和任意透光的適合于加工微流控芯片的材料，例如可以是硅玻璃、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲脂、聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯等。圖2和圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的冷卻模塊6的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖2和圖3所示，冷卻模塊6包括兩個(gè)冷循環(huán)單元。其中，第一冷循環(huán)單元上設(shè)置ー個(gè)冷卻液入口 14和ー個(gè)冷卻液出口 15，第二冷循環(huán)單元上設(shè)置ー個(gè)冷卻液入口 16和ー個(gè)冷卻液出ロ 17。冷卻液入口和出口分別與外部的低溫循環(huán)浴槽連接，以實(shí)現(xiàn)對(duì)微灌流腔9內(nèi)溶液的冷卻降溫作用。 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的灌流顯微鏡的微灌流腔的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖4所示，還包括在微灌流腔9的內(nèi)壁上間隔設(shè)置的第一檔板20和第二檔板22 ;第ー擋板20和第二檔板22將微灌流腔9分隔為相互連通的第一緩沖腔19、微生物材料腔21和第二緩沖腔23，微生物材料腔21位于第一緩沖腔19和第二緩沖腔23之間，第一擋板20和第二擋板22阻擋微生物材料在微生物材料腔21與第一緩沖腔19和第二緩沖腔23之間流動(dòng)；入口 24位于第一緩沖腔19上，出口 25位于第二緩沖腔23上；微生物材料腔21上設(shè)置有加載入ロ 29和卸載出口 30。在本實(shí)施例中，微灌流腔9內(nèi)壁上的第一檔板20和第二擋板22平行、間隔設(shè)置，第一檔板20和第二檔板22的上端與微灌流腔9的上壁連接，第一檔板20和第二檔板22的下端與微灌流腔9的下壁之間留有空隙，形成可以供溶液流過而細(xì)胞不能通過的流通部。流通部的尺寸可以根據(jù)細(xì)胞的體積大小進(jìn)行設(shè)置，在本實(shí)施例中，流通部的高度尺寸優(yōu)選為1-10微米。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中，第一擋板20和第二擋板22也可以采用傾斜、間隔設(shè)置。在本實(shí)施例中，觀察裝置34包括攝像頭13，微型計(jì)算機(jī)11，以及位于微灌流腔9ー側(cè)的聚光鏡4，透光孔5，位于微灌流腔9另ー側(cè)與聚光鏡4相對(duì)設(shè)置的物鏡12。微灌流腔9放置于載物臺(tái)10上，在正對(duì)微灌流腔9上方的位置設(shè)置聚光鏡4，光線經(jīng)過聚光鏡4的匯聚、加強(qiáng)作用，通過透光孔5到達(dá)微灌流腔9，經(jīng)物鏡12的放大作用，再由攝像頭13采集到微生物材料的體積變化信息，傳遞給微型計(jì)算機(jī)11進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。攝像頭13優(yōu)選采用CCD (Charge-coupled Device,電荷稱合元件)攝像頭,也可以采用其他任何圖像采集速度大于10FPS (Frames Per Second,姆秒傳輸巾貞數(shù))的攝像頭。為了更好地理解本發(fā)明，下面以采用本發(fā)明的灌流顯微鏡模擬添加、去除低溫保護(hù)劑過程，井根據(jù)細(xì)胞體積響應(yīng)，測定不同溫度下細(xì)胞膜的滲透性參數(shù)為例加以詳細(xì)說明。其中，低溫保護(hù)劑通常是含低溫保護(hù)劑(CPA)的生理鹽水或含低溫保護(hù)劑(CPA)的磷酸鹽緩沖液。模擬添加低溫保護(hù)劑過程，根據(jù)細(xì)胞的體積響應(yīng)，測定不同溫度下細(xì)胞膜的滲透性參數(shù)的具體實(shí)施過程如下
打開加載入口 29，將細(xì)胞注入微生物材料腔21，然后封閉加載入口 29。在注入注射器26中裝入含低溫保護(hù)劑的溶液，在注入注射器27中裝入不含低溫保護(hù)劑的溶液。在某ー時(shí)刻，同步啟動(dòng)注入注射器27和抽取注射器28，且控制兩者的流速相等，將整個(gè)管路和微灌流腔9內(nèi)充滿不含低溫保護(hù)劑的溶液。通過冷卻模塊6和加熱模塊7的協(xié)同工作，并通過溫度傳感器31的溫度檢測反饋，精確控制微灌流腔9內(nèi)的溶液溫度。待灌流達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，停止注入注射器27，并同時(shí)啟動(dòng)注入注射器26，繼續(xù)以等流速注入，則微灌流腔9內(nèi)完成了從不含低溫保護(hù)劑到含低溫保護(hù)劑溶液的切換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞模擬添加低溫保護(hù)劑的過程。通過CCD攝像頭13采集細(xì)胞的體積變化，并通過微型計(jì)算機(jī)11記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，即可得到在某一溫度下，添加特定濃度、特定類型低溫保護(hù)劑過程中細(xì)胞的體積響應(yīng)，進(jìn)而通過非線性擬合技術(shù)，獲得細(xì)胞的等滲體積、細(xì)胞的非滲透性體積和細(xì)胞膜對(duì)低溫保護(hù)劑和水的滲透性參數(shù)等。通過冷卻模塊6和加熱模塊7改變溫度，重復(fù)上述測試過程，得到至少三個(gè)不同溫度下，細(xì)胞膜對(duì)低溫保護(hù)劑和水的滲透性參數(shù)，然后通過數(shù)學(xué)模型，得到其相關(guān)的活化能。
模擬去除低溫保護(hù)劑過程，根據(jù)細(xì)胞的體積響應(yīng)，測定不同溫度下細(xì)胞膜的滲透性參數(shù)的具體實(shí)施過程，與模擬添加低溫保護(hù)劑過程的區(qū)別是對(duì)調(diào)注入注射器26和27的開啟順序即可。進(jìn)ー步地，為了更好地理解本發(fā)明，下面以采用本發(fā)明的灌流顯微鏡模擬非平衡冷凍過程和復(fù)溫融解過程，根據(jù)細(xì)胞的體積響應(yīng)，測定細(xì)胞在非平衡冷凍過程和復(fù)溫融解過程中的滲透性參數(shù)及其活化能為例進(jìn)行詳細(xì)說明。其中，低溫保護(hù)劑溶液均為水-食鹽-低溫保護(hù)劑三元溶液，溶液的組分由非平衡冷凍過程多元溶液的相圖加以確定。模擬非平衡冷凍過程，根據(jù)細(xì)胞的體積響應(yīng)，進(jìn)而測定細(xì)胞在非平衡冷凍過程的滲透性參數(shù)及其活化能的實(shí)施過程如下在注入注射器26內(nèi)裝入高濃度的低溫保護(hù)劑溶液，而在注入注射器27內(nèi)裝入低濃度的低溫保護(hù)劑溶液。打開加載入口 29，將細(xì)胞注入微生物材料腔21，然后封閉加載入ロ 29。在某ー時(shí)刻，同步啟動(dòng)注入注射器27和抽取注射器28，且控制兩者的流速相等，將整個(gè)管路和微灌流腔9內(nèi)充滿低濃度的低溫保護(hù)劑溶液。通過冷卻模塊6和加熱模塊7協(xié)同工作，并通過溫度傳感器31的溫度檢測反饋，可以精確控制微灌流腔9內(nèi)溶液的溫度。待灌流達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，通過注射泵I和2內(nèi)的軟件編程控制注入注射器26和27的注入速度，實(shí)現(xiàn)溶液濃度的變化，從而實(shí)現(xiàn)微灌流腔9內(nèi)溶液濃度嚴(yán)格按照冷凍過程的變化而變化，同時(shí)同步控制微灌流腔9內(nèi)溶液的溫度按照實(shí)際冷凍過程的降溫速率而降低。通過攝像頭13采集細(xì)胞的體積變化，并通過微型計(jì)算機(jī)11記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，即可得到冷凍過程細(xì)胞體積隨溫度的變化，進(jìn)而使用相關(guān)數(shù)學(xué)模型，通過非線性擬合，可獲得在該降溫速率下，冷凍過程細(xì)胞膜的滲透性參數(shù)及其活化能。模擬復(fù)溫融解過程，根據(jù)細(xì)胞的體積響應(yīng)，進(jìn)而測定細(xì)胞在復(fù)溫融解過程的滲透性參數(shù)及其活化能的實(shí)施過程，與模擬非平衡冷凍過程的區(qū)別是對(duì)調(diào)注入注射器26和27的開啟順序即可。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種灌流顯微鏡，其特征在干 包括觀察裝置、溫度控制系統(tǒng)和設(shè)置有入口和出口的微灌流腔；以及 至少兩個(gè)注入速度分別控制的注入注射器，至少ー個(gè)抽取注射器，所述注入注射器并聯(lián)后，與微灌流腔的入口連接，所述抽取注射器與微灌流腔的出口連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的灌流顯微鏡，其特征在于 所述注入注射器的注入速度和抽取注射器的抽取速度分別由不同的注射泵進(jìn)行控制。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的灌流顯微鏡，其特征在于 還包括連接在所述注入注射器和微灌流腔入口之間的微混合腔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的灌流顯微鏡，其特征在于 所述溫度控制系統(tǒng)包括冷卻模塊、加熱模塊和溫度傳感器； 通過所述溫度傳感器對(duì)微灌流腔的溫度進(jìn)行檢測反饋，控制冷卻模塊和/或加熱模塊工作，進(jìn)行溫度控制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的灌流顯微鏡，其特征在干 所述溫度傳感器置于所述微灌流腔的部分腔壁中，所述加熱模塊置于所述溫度傳感器的相對(duì)側(cè)的微灌流腔之上，所述冷卻模塊置于所述加熱模塊之上，所述微灌流腔、加熱模塊及冷卻模塊由保溫材料包裹。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的灌流顯微鏡，其特征在干 放置所述溫度傳感器的腔壁部分的材料為硅玻璃或聚ニ甲基硅氧烷或聚酰亞胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯，其他腔壁部分的材料為聚ニ甲基硅氧烷或硅玻璃或聚酰亞胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚對(duì)ニ甲苯或聚四氟こ烯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的灌流顯微鏡，其特征在于 還包括在微灌流腔的內(nèi)壁上間隔設(shè)置的第一檔板和第二檔板； 所述第一擋板和第二檔板將所述微灌流腔分隔為相互連通的第一緩沖腔、微生物材料腔和第二緩沖腔，微生物材料腔位于第一緩沖腔和第二緩沖腔之間，所述第一擋板和第二擋板阻擋微生物材料在微生物材料腔與所述第一緩沖腔和第二緩沖腔之間流動(dòng)； 所述入口位于所述第一緩沖腔上，所述出ロ位于所述第二緩沖腔上； 所述微生物材料腔上設(shè)置有加載入口和卸載出ロ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的灌流顯微鏡，其特征在于 所述觀察裝置包括攝像頭，微型計(jì)算機(jī)，以及 位于微灌流腔ー側(cè)的聚光鏡，透光孔，位于微灌流腔另ー側(cè)與聚光鏡相對(duì)設(shè)置的物鏡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種灌流顯微鏡，包括觀察裝置、溫度控制系統(tǒng)和設(shè)置有入口和出口的微灌流腔；以及至少兩個(gè)注入速度分別控制的注入注射器，至少一個(gè)抽取注射器，所述注入注射器并聯(lián)后，與微灌流腔的入口連接，所述抽取注射器與微灌流腔的出口連接?？梢跃_控制微灌流腔內(nèi)溶液濃度的變化，實(shí)現(xiàn)溶液濃度由一種濃度到多種濃度的變化，從而可以測量細(xì)胞在周圍溶液濃度變化過程中和變化后的體積響應(yīng)，還可以同步控制微灌流腔內(nèi)溶液濃度和溫度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液非平衡冷凍過程或復(fù)溫融解過程的模擬。
文檔編號(hào)G01N15/08GK102692495SQ201210196718
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者趙剛 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)