專利名稱：基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的磷脂酶A ₂的生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于ー種定量分析磷脂酶A2的生物傳感方法，具體是指磷脂雙層膜具有的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，納米顆粒的表面等離子體共振現(xiàn)象，納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生的耦合增強(qiáng)和光吸收性質(zhì)的改變。
背景技術(shù)：
磷脂酶A2 (PLA2)是ー系列參與磷脂代謝的酶，它廣泛參與人體生理性細(xì)胞內(nèi)外的傳遞及炎癥、多種炎癥相關(guān)疾病等多種病理反應(yīng)。PLA2能水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，釋放兩種代謝物，即自由脂肪和溶血磷脂。目前對(duì)于PLA2的檢測(cè)技術(shù)有熒光法、比色法，該方法需要合成類似磷脂成分的納米顆粒，水解后產(chǎn)生熒光和顔色的變化，但是人工合成的底物不能等同于天然存在的磷脂，并且需要進(jìn)行標(biāo)記；還有脂質(zhì)體包埋染料法，染料自身有背景，且不適合血液分析，血液成分對(duì)觀察造成干擾，另外，這些方法都存在操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度不高的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的PLA2的生物傳感方法。操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，靈敏度高，特異性好。金屬納米顆粒存在表面等離子體共振現(xiàn)象，當(dāng)表面等離子體受到激發(fā)，在顆粒表面產(chǎn)生電磁場(chǎng)，顯著增強(qiáng)了表面吸附分子的拉曼信號(hào)，而當(dāng)納米顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚時(shí)，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了更強(qiáng)的電磁場(chǎng)，對(duì)表面吸附分子的拉曼信號(hào)能達(dá)到IO12倍的增強(qiáng)作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是，制備了拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的金納米顆粒探針，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，使磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)SERS檢測(cè)。同吋，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測(cè)。所述基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的PLA2的定量分析可以通過兩種技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一種技術(shù)方案中，基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的磷脂酶A2的生物傳感方法，包括如下步驟(I)制備磷脂雙層膜包裹的修飾有拉曼染料的納米顆粒探針；⑵PLA2水解反應(yīng)，PLA2水解甘油磷脂sn_2位的脂酰鍵，磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)SERS檢測(cè)；(3)利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的另ー種技術(shù)方案中，基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的磷脂酶A2的生物傳感方法，包括如下步驟(I)制備磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針；、
⑵PLA2水解反應(yīng)，PLA2水解甘油磷脂sn_2位的脂酰鍵，磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生光吸收的變化；(3)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說明。對(duì)于采用拉曼技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)PLA2的定量分析，操作過程是取拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針儲(chǔ)備液以及緩沖溶液于微量管中，加入包含有待測(cè)物的樣品溶液，37°C反應(yīng)30分鐘后，取一定體積的樣品對(duì)其進(jìn)行SERS檢測(cè)。本發(fā)明中，制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針通過已有的合成方法來實(shí)現(xiàn)。具體步驟是取O. 3nM納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL，邊攪拌邊加入500 μ M DTNB (5，5 ^ - ニ硫雙(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室溫放置
2小時(shí)。稱取 I. 628mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 和 I. 96mg l_m yristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine 于 25mL 圓底燒瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)3mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā),溫度設(shè)定為45°C,蒸干后繼續(xù)蒸發(fā)20min。將2. 3mL DTNB/AuNPs溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩ー段時(shí)間，至瓶壁上的磷脂膜完全進(jìn)入到溶液中，放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時(shí)，得到的產(chǎn)品溶液在12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。本發(fā)明中，所述基于拉曼染料修飾的納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生耦合增強(qiáng)的PLA2的SERS檢測(cè)方法，操作步驟是25μ L反應(yīng)體系中，加入5μ L 5XTris緩沖溶液(50mM Tris-HCl,PH 7. 5)，I. 25 μ L IOOmM CaCl2溶液和6. 25 μ L上述合成的金納米顆粒探針溶液于微量管中，再加入包含有待測(cè)物的樣品溶液，充分混勻后，37°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘，取反應(yīng)后的樣品溶液10 μ L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描，得到樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)。所述基于納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生光吸收變化的PLA2的比色檢測(cè)，操作過程中不需要對(duì)金納米顆粒進(jìn)行拉曼染料標(biāo)記，其它步驟完全一致，最后得到的產(chǎn)物溶液用滅菌水稀釋至60 μ L，移入微量石英比色皿中，通過紫外可見光吸收分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改變比例或試劑加入順序可使信號(hào)的變化程度在1% 100%內(nèi)變化。本發(fā)明制備了拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的金納米顆粒探針，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，使磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了巨大的電磁場(chǎng)，顯著增強(qiáng)了顆粒表面吸附分子的拉曼信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的SERS檢測(cè)。同吋，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測(cè)。該方法不需要對(duì)酶底物進(jìn)行標(biāo)記，操作步驟簡(jiǎn)單、快速，成本低，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。有望成為ー種有用的PLA2定量分析方法，對(duì)于研究抗菌、抗炎癥以及細(xì)胞毒性、藥理毒理作用、代謝穩(wěn)定性及其機(jī)制具有重要的意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :蜂毒中提取的PLA2的含量分析(I)制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針稱取I. 58mg 5，5' - ニ硫雙(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用滅菌水稀釋為500 μ Μ(避光,備用)。取O. 3ηΜ納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL，邊攪拌邊加入500 μ M DTNB (5，5' -ニ硫雙(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室溫放置 2 小時(shí)。稱取 I. 628mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero_3-phosphocholine 和 I. 96mgl-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin 于 25mL 圓底燒瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)3mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā),溫度設(shè)定為45°C,蒸干后繼續(xù)蒸發(fā)20min。將2. 3mL DTNB/AuNPs溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩ー段時(shí)間，至瓶壁上的磷脂完全進(jìn)入到溶液中，放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時(shí)，得到的產(chǎn)品溶液在12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。(2) PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，使磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚取蜂毒中提取的PLA2 (凍干粉形式)，用滅菌水溶解為2mg/ml (即138 μ Μ)，再分別稀釋到 I. 38 μ Μ, 138ηΜ, 13. 8ηΜ, I. 38ηΜ, 138ρΜ。25μ L 反應(yīng)體系中，加入 5μ L 5XTris 緩沖溶液(50mM Tris-HCl, PH 7.5)，I. 25 μ L IOOmMCaCl2溶液和6. 25 μ L上述合成的金納米顆粒探針于微量管中，再加入包含有待測(cè)物的樣品溶液，充分混勻后，37°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘。(3)利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)
取10 μ L產(chǎn)物溶液滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)溶液進(jìn)行掃描，選用632nmHeNe激發(fā)器，曝光時(shí)間10秒，掃描圈數(shù)I圈，掃描范圍200nm-2000nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測(cè)物PLA2的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是IOpM ΙΟηΜ，能達(dá)到
3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是7pM。實(shí)施例2 :牛胰腺中提取的PLA2的含量分析(I)制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針稱取I. 628mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 和 I. 96mg Inyristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine 于 25mL 圓底燒瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)3mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā),溫度設(shè)定為45°C,蒸干后繼續(xù)蒸發(fā)20min。取
0.3nM納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL。將離心后的納米金溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩一段時(shí)間，至瓶壁上的磷脂完全進(jìn)入到溶液中，放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時(shí)，得到的產(chǎn)品溶液在12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。(2) PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，使磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚取牛胰腺中提取的PLA2 (凍干粉形式)，用滅菌水溶解為lmg/ml (即71. 9 μ Μ)，再分別稀釋到 7. 19 μ Μ, 719ηΜ, 71. 9ηΜ, 7. 19ηΜ, 719ρΜ。25μ L 反應(yīng)體系中，加入 5μ L 5XTris 緩沖溶液(5OmM Tris-HCl, PH 7. 5),
1.25 μ L IOOmMCaCl2溶液和6. 25 μ L上述合成的金納米顆粒探針于微量管中，再加入包含有待測(cè)物的樣品溶液，充分混勻后，37°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘。(3)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)取20 μ L產(chǎn)物溶液用蒸餾水稀釋至60 μ L，移入微量石英比色皿，利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行定量分析，掃描范圍800nm-400nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測(cè)物PLA2的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是50pM 50nM，能達(dá)到 3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是35pM。
權(quán)利要求
1.一種基于磷脂修飾的納米顆粒團(tuán)聚的磷脂酶A2的生物傳感方法，包括以下步驟 (1)制備磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針； (2)磷脂酶A2水解反應(yīng)； (3)產(chǎn)物溶液的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(3)所述的檢測(cè)方法是利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的納米顆粒探針是修飾有拉曼染料的納米顆粒探針；步驟(3)所述的檢測(cè)方法是利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明制備了拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的金納米顆粒探針，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵，使磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了巨大的電磁場(chǎng)，顯著增強(qiáng)了顆粒表面吸附分子的拉曼信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的SERS檢測(cè)。同時(shí)，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測(cè)。該方法不需要對(duì)酶底物進(jìn)行標(biāo)記，操作步驟簡(jiǎn)單、快速，成本低，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。有望成為一種有用的PLA2定量分析方法，對(duì)于研究抗菌、抗炎癥以及細(xì)胞毒性、藥理毒理作用、代謝穩(wěn)定性及其機(jī)制具有重要的意義。
文檔編號(hào)G01N21/33GK102661926SQ201210075069
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 王玉, 蔣健暉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)