測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于確定樣品中觸珠蛋白水平的測(cè)定方法,所述測(cè)定方法包括以下步驟:(i)將血紅蛋白與待測(cè)定樣品混合以形成帶有存在于所述樣品中的觸珠蛋白的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物;(ii)在緩沖液存在的情況和以下條件下,將步驟(i)的產(chǎn)物與用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑和當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光譜可檢測(cè)的變化的一種或多種色原接觸;在所述條件中過(guò)氧化氫從所述試劑中產(chǎn)生并形成用于存在的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的底物,并且其中所述緩沖液的pH在足夠低到任何未復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性基本被遏制但足夠高到產(chǎn)生過(guò)氧化氫的范圍內(nèi);(iii)通過(guò)測(cè)量所述反應(yīng)混合物的光學(xué)性質(zhì)的變化來(lái)確定所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性;和(iv)將所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性水平與所述樣品中觸珠蛋白的量關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還提供了用于此類方法的試劑盒。
【專利說(shuō)明】測(cè)定方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于確定樣品中觸珠蛋白水平的測(cè)定和試劑盒。特別地,本發(fā)明涉及易于適應(yīng)于以干燥形式運(yùn)行的用于確定觸珠蛋白水平的測(cè)定,在所述形式中試劑在運(yùn)行所述測(cè)定前在表面上干燥。
[0002]發(fā)明背景
觸珠蛋白是一群被稱作急性期蛋白的蛋白之一,在感染、炎癥或外傷后其濃度顯著上升。因此測(cè)量血漿中觸珠蛋白的濃度對(duì)樣品所獲自的人或動(dòng)物的健康狀況提供有價(jià)值的診斷信息,在本領(lǐng)域中在開(kāi)發(fā)用于血漿、血清和其它生物流體中的觸珠蛋白的測(cè)定方面已有相當(dāng)興趣。
[0003]目前用于確定樣品中觸珠蛋白濃度的測(cè)定通?;诿庖邷y(cè)定或基于依賴于觸珠蛋白結(jié)合血紅蛋白的能力的血紅蛋白結(jié)合。
[0004]運(yùn)用基于抗體的方法和特異性針對(duì)觸珠蛋白的抗血清的免疫測(cè)定已經(jīng)開(kāi)發(fā)并且為本領(lǐng)域已知。通常,此類測(cè)定基于免疫比濁測(cè)定,觸珠蛋白的濃度經(jīng)由測(cè)量溶液中抗體-觸珠蛋白沉淀物的形成來(lái)確定。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是此類測(cè)定的另一種常見(jiàn)實(shí)施方案。做此類免疫測(cè)定不僅需要抗血清的持續(xù)供給,而且試驗(yàn)必須對(duì)研究中的各個(gè)獨(dú)立物種進(jìn)行驗(yàn)證,使得基于免疫測(cè)定的方法商業(yè)吸引力較少。
[0005]基于觸珠蛋白結(jié)合血紅蛋白的能力的測(cè)定現(xiàn)在常規(guī)用于獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室。其在經(jīng)濟(jì)上更可行,因?yàn)樗鼈儽然诳贵w的方法需要更少昂貴的試劑并且還可對(duì)所有物種進(jìn)行。
[0006]在EP 1031035B1中描述了一種血紅蛋白結(jié)合測(cè)定系統(tǒng),其利用了觸珠蛋白結(jié)合血紅蛋白的內(nèi)源活性。在低PH下,所得觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物保留了過(guò)氧化物酶活性,而未結(jié)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性是失活的。通過(guò)檢測(cè)過(guò)氧化物酶的活性,可確定存在的復(fù)合的血紅蛋白的量并從而可確定樣品的觸珠蛋白含量。在EP 1031035B1中所述的測(cè)定系統(tǒng)中,應(yīng)用試劑例如蛋白結(jié)合抑制劑和有效針對(duì)二硫鍵的還原劑和/或離液劑以抑制在觸珠蛋白的低血液濃度時(shí)干擾測(cè)定的血清血蛋白的過(guò)氧化物酶活性。
[0007]與迄今描述的血紅蛋白結(jié)合測(cè)定(例如以上論述的EP 1031035B1中所述的測(cè)定)相關(guān)的主要缺點(diǎn),是需要過(guò)氧化氫作為用于所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的底物。過(guò)氧化氫是高活性的并且需要穩(wěn)定化以防止其氧化所述測(cè)定中的其它組分。這不僅限制了所述測(cè)定的實(shí)用性,而且還使所述測(cè)定不適于適應(yīng)干燥化學(xué)形式,例如用于目測(cè)評(píng)價(jià)或基于儀器的評(píng)價(jià)的“試條(dip-stick) ”布置。
[0008]US 4695552描述了在游離血紅蛋白存在的情況下確定血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的方法,所述方法涉及確定過(guò)氧化物酶的活性。但是,所述過(guò)氧化物酶活性的底物是過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫還作為試劑與3,3’,5,5’ -四甲基聯(lián)苯胺一起用于JP 2208568中所述的觸珠蛋白確定方法中。
[0009]因此仍有對(duì)克服現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定方法相關(guān)問(wèn)題的用于確定樣品中觸珠蛋白水平的改良測(cè)定的持續(xù)需要。
[0010]發(fā)明簡(jiǎn)沭 本發(fā)明提供了用于確定樣品中觸珠蛋白水平的測(cè)定方法,所述方法包括以下步驟:
(i)將血紅蛋白與待測(cè)定樣品混合以形成帶有存在于所述樣品中的觸珠蛋白的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物;
(ii)在緩沖液存在的情況和以下條件下,將步驟(i)的產(chǎn)物與用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑和當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光學(xué)可檢測(cè)的變化的一種或多種色原接觸;在所述條件中過(guò)氧化氫從所述試劑中產(chǎn)生并形成用于存在的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的底物,并且其中所述緩沖液的PH在足夠低到任何未復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性基本被遏制但足夠高到產(chǎn)生過(guò)氧化氫的范圍內(nèi);
(iii)通過(guò)測(cè)量所述反應(yīng)混合物的光學(xué)性質(zhì)的變化來(lái)確定所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性;和
(iv)將所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性水平與所述樣品中觸珠蛋白的量關(guān)聯(lián)。
[0011]合適地,在以上方法中,步驟(i)和(ii)例如通過(guò)形成包含待測(cè)定樣品、血紅蛋白、用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑、當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光譜可檢測(cè)變化的一種或多種色原和合適的緩沖液中的全部的反應(yīng)混合物來(lái)同時(shí)進(jìn)行。
[0012]本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的觸珠蛋白測(cè)定的試劑盒,其包含血紅蛋白、用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑、當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光學(xué)可檢測(cè)的變化的一種或多種色原和緩沖液。
[0013]通過(guò)本發(fā)明,提供了用于確定樣品中觸珠蛋白水平的測(cè)定方法,其通過(guò)確定與所述觸珠蛋白復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性來(lái)利用觸珠蛋白結(jié)合血紅蛋白的內(nèi)源活性,但其避免了包含過(guò)氧化氫作為試劑以提供用于該過(guò)氧化物酶活性的底物的需要。其中過(guò)氧化氫底物在原位產(chǎn)生的觸珠蛋白的無(wú)過(guò)氧化物測(cè)定的開(kāi)發(fā),是特別有利的,因?yàn)槠浔苊饬水?dāng)不穩(wěn)定并且高活性的過(guò)氧化氫直接用作試劑時(shí)加諸于測(cè)定上的實(shí)際限制,從而促進(jìn)所述測(cè)定在廣范圍的情況和測(cè)定形式中的用途。
[0014]發(fā)明詳沭
本發(fā)明的測(cè)定方法可合適地對(duì)來(lái)自任何動(dòng)物的血液樣品,例如血漿或血清進(jìn)行?;蛘?,用于所述測(cè)定的樣品可包含其它的生物流體例如腹水、滑液、腦脊液奶。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述樣品可獲自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述樣品中觸珠蛋白的濃度為0.02 mg/ml-1.4 mg/ml。
[0016]用于本發(fā)明的測(cè)定方法的血紅蛋白可獲自從中獲得用于測(cè)定的樣品的相同的動(dòng)物,或者其可獲自不同的物種。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述血紅蛋白為高鐵血紅蛋白。
[0018]在本發(fā)明的測(cè)定方法中,所述樣品中的觸珠蛋白和添加的血紅蛋白共同反應(yīng)以形成觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述測(cè)定反應(yīng)混合物孵育多至20分鐘,例如5-20分鐘。
[0020]本發(fā)明方法的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的形成通過(guò)經(jīng)由測(cè)量所述反應(yīng)混合物光學(xué)性質(zhì)的變化而確定所述復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性來(lái)檢測(cè)。所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的水平可接著與所述樣品中觸珠蛋白的量關(guān)聯(lián)。
[0021 ] 在本發(fā)明的測(cè)定方法中,所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性通過(guò)在所述測(cè)定中原位產(chǎn)生過(guò)氧化氫以形成用于所述復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的底物并利用當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光譜可檢測(cè)的變化的色原檢測(cè)所述過(guò)氧化物酶活性來(lái)確定。
[0022]本發(fā)明用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑合適地包含催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶連同用于所述酶的底物。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑包含葡萄糖氧化酶和底物葡萄糖。
[0024]應(yīng)理解的是可使用其它合適的酶/底物的組合以在所述測(cè)定中原位產(chǎn)生過(guò)氧化氫??墒褂帽绢I(lǐng)域常規(guī)的產(chǎn)生過(guò)氧化氫的任何酶/底物的組合例如膽固醇/膽固醇氧化酶或尿素/尿素氧化酶。
[0025]當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光譜可檢測(cè)的變化的色原為本領(lǐng)域所熟知并描述于例如以上論述的EP 1031035B1中。
[0026]用于測(cè)定血紅蛋白水平的本領(lǐng)域已知的任何顯色底物可方便地用于本發(fā)明的測(cè)定中。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明測(cè)定的血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性用當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷可分光光度檢測(cè)的顏色變化的色原(例如:苯酚、4-碘苯酚、3_氨基比林(3-aminophenozone)、8_苯胺基萘磺酸(ANS)、4_氨基安替比林(AAP)、2_氨基-4-羥基苯磺酸(AHBS)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺二鹽酸鹽、鄰聯(lián)茴香胺、2-羥基_3,5- 二氯苯磺酸鈉、2,2’ -連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或其混合物)來(lái)確定。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中,用于本發(fā)明的測(cè)定中的顯色底物包含苯酚、8-苯胺基萘磺酸(ANS)和4-氨基安替比林的組合。
[0028]可檢測(cè)的顏色變化可用以本領(lǐng)域中常規(guī)的各種濃度范圍存在的色原來(lái)檢測(cè)。
[0029]所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性和所述原位產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑的活性兩者是PH依賴的,因而本發(fā)明解決的難題是尋找一種pH范圍,所述pH范圍中兩種活性是起作用的。
[0030]本領(lǐng)域已知的是未復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性在低pH下可為失活的。如Jpn.J Vet.Sci, 44,第15-21頁(yè)(1982)中報(bào)道的,該活性可在pH 4.1下失活。然而已表明在此類PH下因游離的血紅蛋白所致的過(guò)氧化物酶活性可保留并且以上論述的EP1031035B1中所述的測(cè)定優(yōu)選在低于4.1的pH下,特別地在pH 3.8下進(jìn)行。
[0031]然而本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過(guò)在緩沖液存在的情況下在3.9-4.5的pH范圍下進(jìn)行本發(fā)明測(cè)定方法,測(cè)定混合物中殘留的任何未復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性可基本被遏制而不抑制原位過(guò)氧化氫的產(chǎn)生。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法在緩沖液存在的情況下在4-4.5的pH范圍下進(jìn)行。
[0033]在特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法在4.1的pH下進(jìn)行。
[0034]可應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)的任何緩沖液以保持所述測(cè)定的所需pH。方便地,可應(yīng)用混合的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液,用檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.8)將磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)滴定至所需pH。
[0035]從EP 1031035B1已知的是,血液樣品中存在的白蛋白和其他蛋白對(duì)依賴于觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的固有過(guò)氧化物酶活性的觸珠蛋白測(cè)定有非所需的“過(guò)氧化物酶作田,,
川 O
[0036]因此,在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法在用于減少由于樣品中的任何白蛋白或其他蛋白所致的過(guò)氧化物酶作用的一種或多種另外試劑存在的情況下進(jìn)行。應(yīng)理解的是此類另外的一種或多種試劑可以不足以顯著抑制觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的形成的量添加。
[0037]用于減少由于樣品中的任何白蛋白或其他蛋白所致的過(guò)氧化物酶作用的合適的另外試劑為如EP 1031035B1中所述的,包括例如蛋白結(jié)合抑制劑、有效針對(duì)二硫鍵的還原劑和離液劑。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述另外的一種或多種試劑可以0.1-0.5mM濃度存在。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法在蛋白結(jié)合抑制劑例如8-苯胺基萘磺酸(ANS)、原卟啉、膽紅素、?;侨パ跄懰?膽汁鹽)、雙香豆素或2-巰基苯并噻唑存在的情況下進(jìn)行。
[0040]在另一個(gè)實(shí)施方案中,有效針對(duì)二硫鍵的另外的還原劑選自二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、巰基乙醇、谷胱甘肽、4,4’ - 二硫代吡啶或5,5’ - 二硫代(2-硝基苯甲酸)。
[0041]在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法在合適的離液劑(例如鹽酸胍、硫氰酸鉀或氯化鈉)存在的情況下進(jìn)行。
[0042]本發(fā)明的測(cè)定合適地還包含洗滌劑以幫助保持溶液中的其它組分。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中,洗滌劑以低濃度,合適地以多至0.3%(v/v)的量加入測(cè)定混合物中。
[0044]可應(yīng)用的合適的洗滌劑包括本領(lǐng)域常規(guī)的非離子型和離子型表面活性劑。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中,用于添加到所述測(cè)定混合物中的洗滌劑包含非離子型表面活性齊U,例如聚氧乙烯(polyoxylene)山梨糖醇酯(例如Tween? 20、40、60、80)、聚氧乙烯醇(例如Brij ? 35,36)或其混合物。
[0046]在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述洗滌劑包含一種或多種離子型表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉或西曲溴銨。
[0047]應(yīng)理解的是,測(cè)定試劑可以任何順序加在一起,前提是在所述測(cè)定起始前不發(fā)生色原的光譜可檢測(cè)的變化。例如,所述試劑可以各種穩(wěn)定的組合預(yù)混合并與樣品放在一起以進(jìn)行所述測(cè)定。
[0048]抗菌劑可與一種或多種試劑或試劑混合物包括在內(nèi)以充當(dāng)防腐劑。合適的成分包括例如三氯生或硫柳汞。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中,提供了第一試劑混合物和第二試劑混合物并且所述測(cè)定通過(guò)形成待測(cè)定樣品與所述第一試劑混合物和第二試劑混合物的混合物來(lái)進(jìn)行。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述第一試劑混合物包含血紅蛋白和催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶,所述第二試劑混合物包含一種或多種色原和用于所述第一混合物的酶的底物。合適地所述酶包含葡萄糖氧化酶并且所述酶的底物包含葡萄糖。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方案中,的一種或多種色原連同血紅蛋白和催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶包含在所述第一試劑混合物中。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中,組分測(cè)定試劑中的一些或全部可以干燥形式組合并接著加入含水樣品中以進(jìn)行所述測(cè)定。
[0053]合適地,測(cè)定試劑組合可以溶液制備并在固體表面例如紙或測(cè)定條上冷凍干燥。
[0054]干燥形式例如這種干燥形式對(duì)于儲(chǔ)存和便攜性是特別方便的,并且相比于現(xiàn)有技術(shù)方法其代表了本發(fā)明的方法的顯著優(yōu)勢(shì),因?yàn)檫@在需要過(guò)氧化氫作為試劑之一時(shí)是不能實(shí)現(xiàn)的。
[0055]通過(guò)參考利用觸珠蛋白的已知濃度生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線,針對(duì)本發(fā)明測(cè)定方法中形成的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物確定的過(guò)氧化物酶活性水平可與樣品中觸珠蛋白的水平關(guān)聯(lián)。
[0056]用于本發(fā)明的方法的試劑盒可合適地包含另外的組分例如具有已知觸珠蛋白濃度的血清的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的測(cè)定方法可合適地利用設(shè)備如試管或微量滴定板來(lái)進(jìn)行?;蛘?,所述測(cè)定可利用自動(dòng)化生化分析儀來(lái)進(jìn)行。
[0058]在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求中,詞語(yǔ)“包含”和“含有”以及所述詞語(yǔ)的變體,例如“包括”和“含”,意指“包括但不限于”并且不排除其它的部分、添加物、組分、整數(shù)
或步驟。
[0059]在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求中,除非上下文另外需要,否則單數(shù)涵蓋復(fù)數(shù)。特別地,當(dāng)使用不定冠詞時(shí),除非上下文另外需要,否則本說(shuō)明書(shū)應(yīng)理解為考慮復(fù)數(shù)和單數(shù)。
[0060]本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征可如關(guān)聯(lián)任何其它方面所述。本發(fā)明的其它特征根據(jù)以下實(shí)施例可變得顯而易見(jiàn)。
[0061]一般而言,本發(fā)明延伸到本說(shuō)明書(shū)(包括任何隨附權(quán)利要求和附圖)中公開(kāi)的特征的任何新的發(fā)明或任何新組合。因此,除非與之不兼容,否則與關(guān)聯(lián)本發(fā)明特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣鳌⒄麛?shù)、特性、化合物、化學(xué)部分或化學(xué)基團(tuán)應(yīng)理解為適用于本文所述的任何其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?br>
[0062]此外除非另外指出,否則本文公開(kāi)的任何特征可被提供相同或相似目的的備選特征所代替。
[0063]現(xiàn)將通過(guò)參考以下的非限制性實(shí)施例的方式來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例
[0064]使用以下溶液和一般程序- 儲(chǔ)液:_
試劑A:血紅蛋白和葡萄糖氧化酶 磷酸鹽緩沖液0.05M pH 7.4
在超純水中依照Makimura和Susuki (1982.Jap J Vet Sci 44:15-21)制備的30 mg/ml馬血紅蛋白
含10 mg/ml葡萄糖氧化酶(Sigma)的磷酸鹽緩沖液 試劑B:色原/葡萄糖 儲(chǔ)液:_
檸檬酸鹽緩沖液0.5 M,pH 3.8
【權(quán)利要求】
1.一種用于確定樣品中觸珠蛋白水平的測(cè)定方法,所述測(cè)定方法包括以下步驟: (i)將血紅蛋白與待測(cè)定樣品混合以形成帶有存在于所述樣品中的觸珠蛋白的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物; (ii)在緩沖液存在的情況和以下條件下,將步驟(i)的產(chǎn)物與用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑和當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光學(xué)可檢測(cè)的變化的一種或多種色原接觸;在所述條件中過(guò)氧化氫從所述試劑中產(chǎn)生并形成用于存在的觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的底物,并且其中所述緩沖液的PH在足夠低到任何未復(fù)合的血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性基本被遏制但足夠高到產(chǎn)生過(guò)氧化氫的范圍內(nèi); (iii)通過(guò)測(cè)量所述反應(yīng)混合物的光學(xué)性質(zhì)的變化來(lái)確定所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性;和 (iv)將所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性水平與所述樣品中觸珠蛋白的量關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的測(cè)定方法,其中步驟(i)和步驟(ii)同時(shí)進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定在pH3.9-pH4.5的pH下進(jìn)行。
4.權(quán)利要求3的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定在pH4-pH4.5的pH下進(jìn)行。
5.權(quán)利要求4的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定在4.1的pH下進(jìn)行。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑包含催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶連同用于所述酶的底物。`
7.權(quán)利要求6的測(cè)定方法,其中所述用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑包含葡萄糖氧化酶和底物葡萄糖。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)所述色原經(jīng)歷可被光譜檢測(cè)的顏色變化。
9.權(quán)利要求8的測(cè)定方法,其中所述色原包含:苯酚、4-碘苯酚、3-氨基比林、8-苯胺基萘磺酸(ANS)、4_氨基安替比林(AAP)、2_氨基-4-羥基苯磺酸(AHBS)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺二鹽酸鹽、鄰聯(lián)茴香胺、2-羥基-3,5- 二氯苯磺酸鈉和2,2’ -連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或其混合物。
10.權(quán)利要求9的測(cè)定方法,其中所述色原包含苯酚、8-苯胺基萘磺酸(ANS)和4-氨基安替比林的組合。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定在用于減少由于樣品中的白蛋白或其他蛋白所致的過(guò)氧化物酶作用的一種或多種另外試劑存在的情況下進(jìn)行。
12.權(quán)利要求11的測(cè)定方法,其中所述一種或多種另外的試劑選自蛋白結(jié)合抑制劑、有效針對(duì)二硫鍵的還原劑和離液劑或其混合物。
13.權(quán)利要求12的測(cè)定方法,其中所述蛋白結(jié)合抑制劑包含8-苯胺基萘磺酸(ANS)、原卟啉、膽紅素、?;侨パ跄懰?膽汁鹽)、雙香豆素或2-巰基苯并噻唑。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的測(cè)定方法,其中所述還原劑包含二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、巰基乙醇、谷胱甘肽、4’ - 二硫代吡啶或5,5’ - 二硫代(2-硝基苯甲酸)。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述離液劑包含鹽酸胍、硫氰酸鉀或氯化鈉。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定混合物還包含洗滌劑。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定混合物還包含抗菌劑。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定通過(guò)形成待測(cè)定樣品與第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的混合物來(lái)進(jìn)行。
19.權(quán)利要求18的測(cè)定方法,其中所述第一試劑混合物包含血紅蛋白和催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶并且第二試劑混合物包含一種或多種色原和用于所述第一混合物的酶的底物。
20.權(quán)利要求19的測(cè)定方法,其中所述一種或多種色原包含在所述第一反應(yīng)混合物中。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中所述組分測(cè)定試劑的一些或全部以干燥形式組合并接著加入含水樣品中以進(jìn)行所述測(cè)定。
22.權(quán)利要求21的測(cè)定方法,其中所述測(cè)定試劑組合以溶液制備并冷凍干燥在固體表面上。
23.權(quán)利要求22的測(cè)定方法,其中所述固體表面為紙或測(cè)定條。
24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法,其中通過(guò)參考利用觸珠蛋白的已知濃度生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將所述觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性的水平與所述樣品中觸珠蛋白的量關(guān)聯(lián)。
25.一種用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的觸珠蛋白測(cè)定的試劑盒,所述試劑盒包含血紅蛋白、用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫的試劑、當(dāng)存在過(guò)氧化物酶活性時(shí)經(jīng)歷光學(xué)可檢測(cè)的變化的一種或多種色原和緩沖液。
26.一種測(cè)定方法,所述測(cè)定方法基本如本文所述。
27.一種試劑盒,所述試劑盒基本如本文所述。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103492881SQ201180067993
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月20日
【發(fā)明者】P.D.??扑_爾, E.麥庫(kù)洛奇, S.多徹爾蒂 申請(qǐng)人:反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室有限公司