專利名稱：用于生物過程操作的拉曼光譜的制作方法
用于生物過程操作的拉曼光譜本申請要求2010年9月17日提交的U.S.S.N.61/384，131和2011年3月15日提交的U.S.S.N.61/452,978的優(yōu)先權(quán)日期的權(quán)益，其二者均以其整體內(nèi)容通過引用并入本文。1.簡介
本申請涉及使用拉曼光譜用于監(jiān)測和控制生物過程操作的過程的方法。2.背景
用于生物過程操作的典型監(jiān)測和控制包括生產(chǎn)過程中的試驗(yàn)(in-process test),例如pH、導(dǎo)電性、蛋白質(zhì)濃度和滲透壓或分析技術(shù)如基于ELISA或HPLC的方法。這些方法常太泛化或太繁瑣并且耗時(shí)。生物制劑過程中間體的化學(xué)組分對(duì)于控制和/或提高生物過程操作的一致性或質(zhì)量常是必需的。亟需迅速和準(zhǔn)確測試這種生物制劑過程中間體的多組分混合物的方法以提供質(zhì)量和組成的實(shí)時(shí)或接近實(shí)時(shí)保證。3.概沭
在某些實(shí)施方案中，目前公開的主題提供了表征用于生物過程操作的多組分混合物的方法，其包括:提供具有預(yù)定量的已知組分的多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品；對(duì)所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析；從所述生物過程操作中提供一種或多種多組分試驗(yàn)混合物；對(duì)所述多組分試驗(yàn)混合物進(jìn)行拉曼光譜分析；和比較所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物的分析以表征所述多組分試驗(yàn)混合物。例如，比較所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物的分析以表征所述多組分試驗(yàn)混合物能包括通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法擬合從多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品獲得的數(shù)據(jù)以獲得校正模型并隨后使用它來測定多組分試驗(yàn)混合物中的濃度。在某些實(shí)施方案中，多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和多組分試驗(yàn)混合物都包含下列物質(zhì)的一種或多種、至少兩種、至少三種、或每一個(gè):糖類(例如，甘露醇)、氨基酸(例如，L-精氨酸、蛋氨酸、L-組氨酸、L-鳥氨酸脯氨酸、丙氨酸、1-精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸、組氨酸和谷氨酸)、表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80) ,Tween "*和pH緩沖劑(例如，檸檬酸鹽制劑、Tris緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑)。這些制劑混合物能包含其它組分，例如抗菌劑(例如，芐醇、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、苯酚、間甲酚)，或螯合劑如EDTA，或其它組分如多元醇、PEG等，或蛋白質(zhì)如BSA等，或鹽如氯化鈉、琥珀酸鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂和氯化鈣，或醇如乙醇。在某些實(shí)施方案中，能隨機(jī)選擇具有預(yù)定量的已知組分的一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析。數(shù)據(jù)處理和主成分方法能確保可靠的可預(yù)測性。例如，能對(duì)一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析的偏最小二乘回歸分析以開發(fā)模型(例如，校正曲線)。在某些實(shí)施方案中，多組分混合物為適用于給予動(dòng)物個(gè)體(例如，人個(gè)體)的制齊U。例如，多組分混合物能為意圖與生物活性劑(例如，單克隆抗體)結(jié)合的制劑緩沖劑。在某些這樣的實(shí)施方案中，多組分混合物(包含或不含生物活性劑)進(jìn)行了并且已經(jīng)獲得管理機(jī)構(gòu)(例如，美國食品和藥品監(jiān)督管理局)的管理批準(zhǔn)。在某些實(shí)施方案中，生物活性劑為單克隆抗體(例如，阿達(dá)木單抗)。在某些實(shí)施方案中，以在線、離線或線旁(at-line)方式從生物過程操作(例如，過濾或純化操作)中進(jìn)行在多組分試驗(yàn)混合物的拉曼光譜分析。例如，在某些實(shí)施方案中，可定期獲得樣品以作為質(zhì)量控制程序的一部分。4.附圖簡沭


圖1:包含氨基酸、PH緩沖劑物質(zhì)和糖的3組分(精氨酸/檸檬酸/海藻糖)緩沖劑體系的拉曼光譜。使用Umetrics SIMCA P+ V 12.0.1.0產(chǎn)生該圖。X軸為數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)。各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為拉曼位移波數(shù)。能在X軸上使用拉曼位移波數(shù)(cm—1)重新繪制它。數(shù)據(jù)從波數(shù)1800(= Num O)開始至800 (= Num 1000)。拉曼光譜原始數(shù)據(jù)是強(qiáng)度(與散射光子數(shù)相關(guān))的單位。該圖顯示三個(gè)單獨(dú)組分(在水中)的平均中心光譜數(shù)據(jù)。光譜的平均值為O。其它值相對(duì)于可能來自平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2:具有隨機(jī)值的3組分緩沖劑體系(精氨酸/檸檬酸/海藻糖)的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較。使用現(xiàn)有模型建立該圖以預(yù)測新溶液的濃度。X-軸和y-軸為濃度(HiM)。圖3:3組分緩沖劑體系(精氨酸/檸檬酸/海藻糖)中單獨(dú)組分的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較。圖4.4組分緩沖劑體系(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/Tween )的純組分原始光譜。y_軸為光譜強(qiáng)度，X-軸為波數(shù)CnT1。圖5.4組分緩沖劑體系(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/Tween )的純組分原始光譜。y_軸為光譜強(qiáng)度，X-軸為波數(shù)cm—1。圖5為圖4顯示的光譜的更詳細(xì)視圖，其中“指紋”區(qū)已被展開。圖6.4組分緩沖劑體系(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/Tween )的純組分SNV/DYDX/平均值中心化光譜(Mean Center spectra)。圖6顯示的數(shù)據(jù)基于在所有預(yù)處理后的圖4-5顯示的相同數(shù)據(jù)，所述預(yù)處理為用于強(qiáng)度歸一化的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(SNV)、用于基線歸一化的I階導(dǎo)數(shù)和用于刻度的平均值中心化。圖7.具有隨機(jī)值的4組分緩沖劑體系(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/Tween )的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較。使用現(xiàn)有模型建立該圖以預(yù)測新溶液的濃度。圖8.3組分緩沖劑體系(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/ Tween )中單獨(dú)組分的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較。圖9.具有顯示拉曼強(qiáng)度的蛋白質(zhì)(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/阿達(dá)木單抗)原始光譜的3組分緩沖劑體系的純組分原始光譜。圖10.具有蛋白質(zhì)(甘露醇/蛋氨酸/組氨酸/阿達(dá)木單抗)的3組分緩沖劑體系的純組分原始光譜，詳細(xì)顯示指紋區(qū)(800 - 1700 cnT1)。圖11.純組分SNV/DYDX/平均值中心化-具有蛋白質(zhì)的3組分緩沖劑體系。圖11顯示的數(shù)據(jù)基于在所有預(yù)處理之后的圖9-10顯示的相同數(shù)據(jù):用于強(qiáng)度歸一化的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(SNV)、用于基線歸一化的I階導(dǎo)數(shù)和用于刻度的平均值中心化。圖12.具有蛋白質(zhì)的3組分緩沖劑體系中單獨(dú)組分的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較。圖13.使用拉曼光譜作為處理和/或質(zhì)量控制的一部分的阿達(dá)木單抗純化過程。圖14.包含緩沖劑、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/組氨酸)的三組分混合物的透析過濾過程的在線拉曼濃度預(yù)測。
圖15.包含緩沖劑、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/組氨酸)的三組分混合物的重復(fù)透析過濾過程。包含另外的數(shù)據(jù)點(diǎn)用于增加分辨率。圖16.糖(甘露醇)/蛋白質(zhì)(阿達(dá)木單抗)溶液的拉曼校正。圖17.其中使用甘露醇溶液代替抗體水溶液以提供糖/蛋白質(zhì)(甘露醇/阿達(dá)木單抗)溶液的透析過濾緩沖劑交換過程的在線拉曼濃度預(yù)測。緩沖劑交換隨后是蛋白質(zhì)濃度。圖18.其中蛋白質(zhì)濃度相擴(kuò)大至180 g/L的圖17實(shí)驗(yàn)的重復(fù)。圖19.拉曼校正組氨酸和阿達(dá)木單抗溶液。圖20.其中使用組氨酸溶液代替蛋白質(zhì)水溶液的透析過濾緩沖劑交換過程的在線拉曼濃度預(yù)測。組氨酸交換隨后是阿達(dá)木單抗?jié)舛取D21A-C.具有蛋白質(zhì)的2組分緩沖劑體系中單獨(dú)組分的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較:A.Tris濃度；B.醋酸鹽濃度；和C.阿達(dá)木單抗?jié)舛?。圖22.具有蛋白質(zhì)的I組分緩沖劑體系中單獨(dú)組分的實(shí)際對(duì)比預(yù)測濃度的比較:A.Tween 濃度；和B.阿達(dá)木單抗?jié)舛取?br>
圖23.當(dāng)使用未修飾蛋白質(zhì)的光催化交聯(lián)(PICUP)單獨(dú)聚集兩種抗體(D2E7和ABT-874)時(shí)使用的條件。將抗體暴露于聚集光源O- 4小時(shí)。圖24.圖23描述的交聯(lián)的尺寸排阻色譜結(jié)果。圖25.使用D2E7樣品的主成分分析的拉曼光譜和光譜建模，表明聚集的樣品具有獨(dú)特的主成分得分并且能使用拉曼光譜從聚集體中辨別。圖26.使用ABT-874樣品的主成分分析的拉曼光譜和光譜建模，表明聚集的樣品具有獨(dú)特的主成分得分并且能使用拉曼光譜從聚集體中辨別。圖27A-B.使用(A) D2E7樣品和(B) ABT-974樣品的偏最小二乘分析的拉曼光譜和光譜建模，表明拉曼光譜結(jié)果和SEC測量值之間的一些相關(guān)性。5.詳細(xì)描述
為了清楚目的并且不作為限制，將本發(fā)明的詳細(xì)描述分為下列分段:
(i)定義
( )可用方法和系統(tǒng)；和
(iii)拉曼光譜儀器和技術(shù)。5.1 定義
如本文使用的，術(shù)語“糖類”包括通式(CH2O)n的化合物及其衍生物，并且還包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原糖、非還原糖等。本文糖的非限制性實(shí)例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、葡聚糖、丙三醇、葡聚糖、赤蘚糖醇、丙三醇、阿糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨醇、甘露醇、蜜二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇等。如本文使用的，術(shù)語“表面活性劑”是指表面活化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑是非離子表面活化劑。表面活性劑的實(shí)例包括但不限于聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80);泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188) ; Triton ;十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基_、肉豆蘧基_、亞油醇基-或硬脂?；?磺基甜菜堿；月桂基_、肉豆蘧基_、亞油醇基-或硬脂?；?肌氨酸；亞油醇基_、肉豆蘧基-或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亞油酰胺丙基-、肉豆蘧酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蘧酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油?；；撬徕c或甲基油?；；撬岫c；和MONAQUAT 系列(Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey);聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics 、PF68 等)等。如本文使用的，術(shù)語“pH緩沖劑”是指通過其酸-堿共軛組分的作用抵抗pH變化的緩沖溶液?？刂苝H的pH緩沖劑的實(shí)例包括tri s、三乙醇胺、磷酸鹽、雙-tri s丙燒、組氨酸、醋酸鹽、琥珀酸鹽、琥珀酸鹽、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、雙甘氨肽和其它有機(jī)酸緩沖劑。如本文使用的，“生物制劑”是指來自重組或天然來源的細(xì)胞、分子、細(xì)胞器(天然或合成的)或衍生自非合成化學(xué)源的活生物體的其它物質(zhì)。實(shí)例包括但不限于DNA、RNA、病毒、病毒亞單位、病毒樣顆粒、肽(合成和天然的)、蛋白質(zhì)。這些分子中的任一個(gè)都能提供能被檢測并能用于系統(tǒng)的監(jiān)測和控制的拉曼信號(hào)。如本文使用的，術(shù)語“以工業(yè)規(guī)模提供”是指生物過程，其中例如，在連續(xù)的基礎(chǔ)上(除了維修或升級(jí)必需的中斷之外)生產(chǎn)治療性(例如，用于給予人的單克隆抗體)或其它最終產(chǎn)品達(dá)延長的時(shí)間段(例如，達(dá)至少一周或一個(gè)月或一年)，期望從商業(yè)上關(guān)注的治療性或其它最終產(chǎn)品的銷售或分配產(chǎn)生收入。工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)不同于實(shí)驗(yàn)室“臺(tái)式”設(shè)置，其通常僅維持有限的實(shí)驗(yàn)或研究時(shí)間，并且為了研究目的而進(jìn)行并且不期望從由此生產(chǎn)的最終產(chǎn)品的銷售或分配中產(chǎn)生收入。5.2可用方法和系統(tǒng)
本發(fā)明的某些實(shí)施方案使用拉曼光譜技術(shù)以表征用于生物過程操作的組分(例如，多組分混合物)。例如，在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能用于表征意圖與生物活性劑(例如，單克隆抗體)組合的制劑。這些制劑有時(shí)稱為“制劑緩沖劑”通常為測定生物制劑中的賦形劑水平的多組分混合物。例如，這類制劑通常包含下列的一種或多種:PH緩沖劑(例如，檸檬酸鹽、Tris、醋酸鹽或組氨酸化合物)、表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)、糖或糖醇(例如，甘露醇)和/或氨基酸(例如，L-精氨酸或蛋氨酸)。制劑緩沖劑中的誤差常導(dǎo)致不合格批次，其又導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜技術(shù)能用于識(shí)別蛋白質(zhì)聚集。例如，但不作為限制，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的拉曼光譜技術(shù)能識(shí)別蛋白質(zhì)藥物和藥物產(chǎn)品樣品的聚集，例如抗體藥物和藥物產(chǎn)品樣品。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜技術(shù)能用于檢驗(yàn)藥物和藥物產(chǎn)品樣品中賦形劑的濃度。在某些這樣的實(shí)施方案中，基于單一讀數(shù)檢驗(yàn)賦形劑濃度以作為質(zhì)量控制過程的一部分，避免需要一系列分析試驗(yàn)。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜還能用于包括產(chǎn)品稀釋和PH調(diào)整的生物過程。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能用于測試和表征過濾操作(例如，超濾/透析過濾過程)中存在的制劑，例如其中生物活性劑如單克隆抗體(例如，阿達(dá)木單抗)被純化的過濾操作。例如，但不作為限制，本發(fā)明的拉曼光譜技術(shù)能用于獲得在線或離線獲得的樣品以確定單一讀數(shù)中存在的組分的特性和數(shù)量。在某些實(shí)施方案中，除了賦形劑濃度之外能測定蛋白質(zhì)濃度。在某些這樣的實(shí)施方案中，能分析O至150 mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。
在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能用于監(jiān)測、檢驗(yàn)、測試并由此控制生物過程操作。與生物過程操作一起使用的單元操作，例如，層析、過濾、pH改變、通過組分的添加或溶液的稀釋進(jìn)行的組成改變都導(dǎo)致由有機(jī)或無機(jī)組分和生物分子組成的混合物。因此，例如，通過使用拉曼光譜迅速和精確檢測中間體的組成提供了提高和保持操作以及生物產(chǎn)品的一致性和質(zhì)量的機(jī)會(huì)。在某些實(shí)施方案中，通過拉曼光譜檢測混合物中各個(gè)組分的組成允許這種含有和不含生物分子的混合物的精確制備。例如，在某些實(shí)施方案中，這種檢測適用于制備廣泛用于生物過程操作的緩沖劑溶液，益處為提高制備的一致性或提供接近實(shí)時(shí)的緩沖劑溶液的制備。在某些實(shí)施方案中，這將排除需要用于制備的復(fù)雜設(shè)備、緩沖劑溶液的保持和傳送。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜的使用允許能被提供的緩沖劑溶液的測試和釋放，其中使用簡單儀器實(shí)時(shí)檢測緩沖劑制劑中的可能誤差(例如，化學(xué)組分濃度、錯(cuò)誤化學(xué)品等)。能被測試的制劑包括但不限于不含蛋白質(zhì)的三-組分制劑(緩沖劑+糖+氨基酸)、蛋白質(zhì)和糖制劑、蛋白質(zhì)和表面活性劑制劑以及蛋白質(zhì)和緩沖劑制劑。在某些實(shí)施方案中，溶液組成的精確檢測允許調(diào)整生物溶液以便能實(shí)現(xiàn)添加劑(陰離子、陽離子、疏水性、溶劑等)的正確目標(biāo)組成。目前這種檢測是煩瑣的并且需要不便于實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)使用的復(fù)雜的分析方法。拉曼光譜的使用允許進(jìn)行用文件提供非常高度的擔(dān)保的檢測，其為受管制行業(yè)的期望。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的技術(shù)允許監(jiān)測和控制通過化學(xué)、物理或生物方法實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)反應(yīng)、蛋白質(zhì)-小分子反應(yīng)和/或蛋白質(zhì)修飾的能力。在某些這樣的實(shí)施方案中，使用拉曼光譜監(jiān)測反應(yīng)物(生物的，處于其原始狀態(tài))和產(chǎn)物(生物的，處于其最終狀態(tài))以及其它反應(yīng)物/催化劑(本質(zhì)上為化學(xué)或生物學(xué)的)的獨(dú)特生物化學(xué)特征。此外，以該方式監(jiān)測反應(yīng)物和產(chǎn)物允許反應(yīng)條件和反應(yīng)物量的反饋控制。在某些實(shí)施方案中，還可能的是設(shè)計(jì)體系以去除反應(yīng)副產(chǎn)物和/或連續(xù)優(yōu)化產(chǎn)物，提高或保持產(chǎn)物質(zhì)量或這樣的體系的性能。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜還允許在色譜操作中的生物產(chǎn)物分離和純化。在某些這樣的實(shí)施方案中，能監(jiān)測產(chǎn)物/產(chǎn)物變體/產(chǎn)物亞型或雜質(zhì)的洗脫并能基于目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量或加工性能進(jìn)行柱流出物的分餾。在某些實(shí)施方案中，還能將拉曼光譜應(yīng)用于其它單元操作中餾分的分離/濃縮，例如但不限于過濾和非色譜分離。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能夠被部署為非侵入性工具。例如但不作為限制，能通過不干擾信號(hào)的物質(zhì)進(jìn)行拉曼光譜檢測。這提供了其中保持包含這些混合物的容器/器皿的完整性是關(guān)鍵的生物過程操作中另外獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能為檢測包含其它組分的溶液的“污染物”的非常有價(jià)值的方法。在某些這樣的實(shí)施方案中，使用統(tǒng)計(jì)或光譜比較技術(shù)將從污染的溶液中獲得的拉曼光譜數(shù)據(jù)與預(yù)期光譜比較，并且在它們用于生物過程之前如果不同能允許這些溶液的制劑中誤差的迅速檢測。在某些實(shí)施方案中，如通過下文實(shí)施例作為概念證明所證實(shí)的，能使用拉曼光譜定量檢測包含來自包含主體細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等的細(xì)胞培養(yǎng)基收獲物質(zhì)的雜質(zhì)的混合物中抗體的濃度。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法能用于監(jiān)測來自包含不純混合物的生物過程操作的流入物和流出物。實(shí)例能包括但不限于針對(duì)柱的裝載和洗脫操作、過濾器和非色譜分離設(shè)備(膨脹床、流化床、兩相萃取等)。提供的實(shí)例表明能在包含來自裝載有從化學(xué)確定培養(yǎng)基類細(xì)胞培養(yǎng)方法制備的澄清收獲溶液的蛋白質(zhì)A親和色譜柱的未結(jié)合餾分的基質(zhì)中定量0.1至I g/L的抗體濃度。如果線內(nèi)(in-line)并入拉曼光譜，則這樣的檢測能實(shí)現(xiàn)柱負(fù)載的直接監(jiān)測和控制，能實(shí)現(xiàn)在代表動(dòng)態(tài)結(jié)合容量或靜態(tài)(平衡)容量的百分比的預(yù)先確定的結(jié)合容量下柱的一致性和最佳負(fù)載。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是將這樣的技術(shù)應(yīng)用于上述各種其它操作。在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能用于生物過程純化操作中的質(zhì)量控制和/或反饋控制(例如，控制阿達(dá)木單抗純化過程的線內(nèi)緩沖劑稀釋)。在某些這樣的實(shí)施方案中，如在以其整體內(nèi)容通過引用并入本文的Anal.Chem.，77:1228-1236 (2005)中描述的，拉曼光譜能用于包括蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)或其它化學(xué)反應(yīng)(例如，液相Heck反應(yīng))的過程中的質(zhì)量控制和/或反饋控制。在目前公開主題的各個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的拉曼光譜技術(shù)用于上述以工業(yè)規(guī)模提供的生物過程操作。盡管僅為了方便，本申請的主題主要在生物過程方法的背景下描述的，但還提供了用于進(jìn)行生物過程本身的系統(tǒng)(參見例如，實(shí)施例13)。因此，本申請的某些實(shí)施方案提供了用于進(jìn)行包括以工業(yè)規(guī)模提供的生物過程系統(tǒng)的生物過程操作的系統(tǒng)，其中拉曼探針與從各個(gè)過程中在線或離線采集的樣品流體互通。關(guān)于系統(tǒng)本身的信息能從相應(yīng)過程的描述中獲得。5.3拉曼光譜儀器和技術(shù)
拉曼光譜基于在物質(zhì)上的單色入射輻射以特定方式被反射、吸收或散射的原理，其依賴接收福射的特定分子或蛋白質(zhì)。盡管大部分能量在相同波長下被散射(Rayleigh散射),但少量(例如，IO7)的福射在一些不同波長下被散射(Stokes和Antistokes散射)。該散射與旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)和電子能級(jí)躍遷(electronic level transition)相關(guān)。散射光子波長的變化提供化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。在某些實(shí)施方案中，能對(duì)多組分混合物進(jìn)行拉曼光譜以提供組分高度特定的“指紋”。由混合物的拉曼光譜分析產(chǎn)生的光譜指紋是各個(gè)單獨(dú)組分的疊加。帶的相對(duì)強(qiáng)度與特定組分的相對(duì)濃度相關(guān)。因此，在某些實(shí)施方案中，拉曼光譜能用于定性和定量表征組分的混合物。拉曼光譜能用于表征大多數(shù)樣品，包括固體、液體、漿體、凝膠、膜、粉末和一些氣體，具有非常短的信號(hào)采集時(shí)間。通常，能直接從討論中的生物過程采集樣品，而不需要特殊的制備技術(shù)。而且，入射光和散射光能在長距離上傳送從而允許遠(yuǎn)程監(jiān)測。此外，因?yàn)樗畠H提供了弱的拉曼散射，因此能表征水性樣品而沒有水的顯著干擾。能基于商購拉曼光譜分析儀分析本文描述的可用方法和組合物。例如，能使用商購自 Kaiser Optical Systems, Inc.(Ann Arbor, MI)的 RamanRX2 分析儀或其它分析儀?；蛘撸藤徸岳?，PerkinElmer (Waltham, MA) > Renishaw (Gloucestershire, UK)和Princeton Instruments (Trenton, NJ)的拉曼分析儀。能從各個(gè)供應(yīng)商獲得商購的拉曼光譜分析儀的技術(shù)細(xì)節(jié)和操作參數(shù)。能基于例如，拉曼光譜分析儀和使用它的過程(例如，在提供UF/DF生物過程操作的實(shí)時(shí)監(jiān)測的過程中)測定合適的暴露時(shí)間、樣品尺寸和取樣頻率。類似地，還能基于分析儀和使用分析儀的過程確定適當(dāng)?shù)奶结樂胖?。例如，提供足夠信?hào)的浸入探針的樣本尺寸能小于20 mL或小于10 mL(例如，8 mL或更少)。提供足夠信號(hào)的暴露時(shí)間能小于2分鐘或小于I分鐘(例如，30秒)。例如，對(duì)于期望量化和以多于一種pH依賴離子化形式(例如，組氨酸)存在的組分，能在不同濃度下和/或在各個(gè)PH下進(jìn)行拉曼校正以預(yù)測在給定pH范圍上的濃度使得組分(例如，組氨酸)的檢測不是PH-依賴的。例如，處于不同pH-依賴形式的組氨酸的校正模型能用于檢測和定量多種電離形式的組氨酸以便能確定溶液性質(zhì)。能進(jìn)行信號(hào)處理，其能包括強(qiáng)度校正(例如，標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(SNV))和/或基線校正(例如，一階導(dǎo)數(shù))。能通過檢測代表性測試溶液的CCD飽和度并確保它們在可接受的儀器范圍內(nèi)(例如，40%-80%)來測定暴露時(shí)間。如上面提到的，在一些實(shí)施方案中，將pH控制或pH范圍建模用于特定組分(例如，緩沖劑如組氨酸)。在一些實(shí)施方案中，將入射光最小化，其能例如，通過使用掩蔽物阻止環(huán)境光源干擾光譜(例如，鋁箔)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，其中例如，使用非帶電物質(zhì)濃縮蛋白質(zhì)(例如抗體)，除了大量的溶質(zhì)之外，蛋白質(zhì)占據(jù)大量的溶液體積。這導(dǎo)致非帶電物質(zhì)濃度的凈減少。將該效應(yīng)稱為“體積排阻”，其與蛋白質(zhì)濃度成比例。在某些實(shí)施方案中，例如包括帶電組分的檢驗(yàn)的那些實(shí)施方案，由于在較高濃度下發(fā)生唐南效應(yīng)，蛋白質(zhì)電荷變得明顯有助于溶液中全部帶電物質(zhì)。由于期望在膜的任何一側(cè)建立平衡，因此電中性要求導(dǎo)致在膜的滯留側(cè)上帶正電物質(zhì)(例如，緩沖劑物質(zhì))的凈減少。將該現(xiàn)象稱為唐南效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，使用RamanRX2 分析儀。該分析儀以及其它商購拉曼分析儀提供了監(jiān)測多達(dá)四通道同時(shí)全光譜覆蓋的能力。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)NIR激光激發(fā)用于最大化樣品相容性。能使用可編程連續(xù)監(jiān)測模式，例如，通過RamanRX2 分析儀，并且裝置與過程光學(xué)相容，能使一種分析儀類型從發(fā)現(xiàn)相使用到產(chǎn)品相。便攜式附件和光纖取樣界面允許分析儀用于多個(gè)位置。在目前公開主題的某些實(shí)施方案中，通過拉曼光譜表征包含預(yù)定量的已知組分的至少一種多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品(即，多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品)以獲得用于包含未知組分和/或未知濃度的已知或未知組分的混合物的模型(例如，校正曲線)。優(yōu)選地，通過拉曼光譜表征具有預(yù)定量的已知組分的一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品以用于獲得模型的目的。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能確定用于獲得用于具有未知組分和/或未知濃度的已知或未知組分的混合物的模型的方法。例如，偏最小二乘回歸分析基于預(yù)期在多組分測試混合物中存在的主成分。而且，可從拉曼光譜供應(yīng)商得到的軟件程序能用于設(shè)計(jì)多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品，其反過來能用于開發(fā)用于多組分測試混合物的模型。此外，應(yīng)當(dāng)理解關(guān)于“提供具有預(yù)定量的已知組分的多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品”和“對(duì)多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析”和更通常地，開發(fā)模型以表征具有未知組分或未知濃度的組分的多組分混合物包括平行分析(即，“現(xiàn)場”獲得的數(shù)據(jù))以及參照多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品的前面獲得的或前面記錄的結(jié)果(例如，拉曼光譜指紋)，即，具有已知組分與已知濃度的多組分混合物。例如，參照從供應(yīng)商產(chǎn)品文獻(xiàn)獲得的拉曼光譜結(jié)果包括在“提供具有預(yù)定量的已知組分的多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品”和“多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析”中。6.實(shí)施例
通過下面提供的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。這樣的實(shí)施例的使用僅為例示性的并且絕不限制本發(fā)明或任何實(shí)施例術(shù)語的范圍和含義。同樣地，本發(fā)明不限于本文描述的任何特別優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)際上，在閱讀該說明書后，本發(fā)明的許多修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。因此，本發(fā)明僅受附加的權(quán)利要求的術(shù)語連同權(quán)利要求給予的等同物的全部范圍限制。6.1 3-組分制劑緩沖劑的試驗(yàn)
使用水溶劑制備包含精氨酸、檸檬酸和海藻糖的預(yù)定混合物的制劑緩沖劑。組分從O至100 mM變化。使用RAMANRXN2 分析儀(2光譜/混合物)針對(duì)15 mL等分試樣的各個(gè)混合物獲得800至1700 cnT1范圍內(nèi)的拉曼光譜。將光譜濾波參數(shù)設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(SNV)強(qiáng)度歸一化，具有15點(diǎn)平滑的I階導(dǎo)數(shù)(間隙點(diǎn)(gap))基線校正，和平均強(qiáng)度值=O的平均值中心化差分光譜。這被認(rèn)為是數(shù)據(jù)換算而非光譜過濾器。使用浸入探針收集光譜，暴露時(shí)間為30秒每樣品。主成分方法用于開發(fā)模型。將PLS (偏最小二乘法預(yù)測潛在結(jié)構(gòu))模型應(yīng)用于各個(gè)三種組分以確定組分間相關(guān)性。這結(jié)果是轉(zhuǎn)變光譜強(qiáng)度(例如，從1700 - 800 cm-1)
為濃度(axl + bx2 +......+ zx900 =濃度)的線性模型。用于本文顯示的校正結(jié)果的軟
件為來自 Thermo Galactic 的具有 PLSplus/IQ 插件的 GRAMS/AI V 7.02。SIMCA P+用于許多圖表和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)。通過去除兩個(gè)樣品交叉驗(yàn)證樣品。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以便重復(fù)測試相關(guān)性和交叉驗(yàn)證的步驟直至組分間相關(guān)性低于2%的誤差閾值。使用單一讀數(shù)能提供緩沖劑組分(例如，在2%內(nèi))的精確量化。能使用隨機(jī)混合物設(shè)計(jì)獲得校正曲線。將上面開發(fā)的3-組分模型用于產(chǎn)生關(guān)于精氨酸、檸檬酸和海藻糖的隨機(jī)混合物的光譜的預(yù)測。將這些預(yù)測與實(shí)際光譜比較以確認(rèn)模型具有±2%的預(yù)定公差界限。結(jié)果在圖2和3中示出。獲得隨機(jī)混合物的獨(dú)立測量值以驗(yàn)證模型能被用于形成測量值。6.2 4-組分制劑緩沖劑的試驗(yàn)
將實(shí)施例6.1的方法應(yīng)用于包含4組分的制劑緩沖劑，其中組分為甘露醇、蛋氨酸、組氨酸和Tween (聚山梨醇酯80)。預(yù)定混合物的檢測光譜在圖4_6中示出。波數(shù)從遠(yuǎn)-1R區(qū)至中-1R區(qū)。由于藍(lán)寶石覆蓋的限制，在該特定實(shí)施例中能不考慮100-800 cnT1的范圍并且校正在800-1800 cnT1發(fā)生。以與在實(shí)施例6.1中獲得的3組分模型相同的方式獲得4組分緩沖劑體系的模型。將基于獲得的模型的預(yù)測與隨機(jī)混合物的實(shí)際光譜比較以確定模型足夠精確。結(jié)果在圖7和8中示出。6.3具有蛋白質(zhì)的3-組分制劑緩沖劑的試驗(yàn)
將實(shí)施例6.2的方法應(yīng)用于包含3組分以及濃度為O至100 mg/ml的蛋白質(zhì)的制劑緩沖劑。組分為甘露醇、蛋氨酸、組氨酸和D2E7(阿達(dá)木單抗)。預(yù)定混合物的檢測的光譜在圖9-11中示出。以與實(shí)施例6.2中獲得的4組分模型相同的方式獲得具有蛋白質(zhì)的3組分緩沖劑體系的模型。將基于獲得的模型的預(yù)測與隨機(jī)混合物的實(shí)際光譜比較以確定模型足夠精確。結(jié)果在圖12中示出。實(shí)際與預(yù)測光譜的決定系數(shù)(R2)和交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差(SECV)值在下列表I中示出。表1.模型擬合總結(jié)
權(quán)利要求
1.表征用于生物過程操作的多組分混合物的方法，其包括: (a)提供具有預(yù)定量的已知組分的多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品； (b)對(duì)所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析； (C)從所述生物過程操作中提供多組分試驗(yàn)混合物； (d)對(duì)所述多組分試驗(yàn)混合物進(jìn)行拉曼光譜分析；和 (e)比較來自步驟(d)的分析與來自步驟(b)的分析以表征所述多組分試驗(yàn)混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物都包含多糖、氨基酸和PH緩沖劑中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物都包含多糖、氨基酸、pH緩沖劑中的至少兩種。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述多糖為甘露醇。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述pH緩沖劑選自組氨酸和檸檬酸鹽制劑。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物還包含表面活性劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表面活性劑為聚山梨醇酯80。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括提供具有預(yù)定量的隨機(jī)選擇的已知組分的一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品并對(duì)一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其還包括基于對(duì)該一系列多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜分析的偏最小二乘回歸分析開發(fā)用于表征所述多組分試驗(yàn)混合物的模型。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多組分混合物為適用于給予動(dòng)物受試者的制劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述受試者為人。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述制劑與生物活性劑組合，并且其中所述組合的生物活性劑和制劑是由管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物還包含選自單克隆抗體、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、病毒亞單位、肽和疫苗的試劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物包含單克隆抗體。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中從來自所述生物過程的在線樣品中進(jìn)行在所述多組分試驗(yàn)混合物上的拉曼光譜分析。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中每隔一定時(shí)間進(jìn)行所述拉曼光譜分析以作為質(zhì)量控制程序的一部分。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物過程為過濾或純化操作。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將至少一部分所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品加入至所述多組分試驗(yàn)混合物。
19.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述多組分試驗(yàn)混合物還包含張度劑(tonicizer)、表面活性劑、螯合劑、鹽和醇中的至少一種。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述單克隆抗體為阿達(dá)木單抗。
全文摘要
表征用于生物過程操作的多組分混合物的方法，其包括提供具有預(yù)定量的已知組分的多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品；對(duì)所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜分析；從所述生物過程操作中提供多組分試驗(yàn)混合物；對(duì)所述多組分試驗(yàn)混合物進(jìn)行拉曼光譜分析；并比較所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物的分析以表征所述多組分試驗(yàn)混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多組分混合物標(biāo)準(zhǔn)品和所述多組分試驗(yàn)混合物都包含下列物質(zhì)的一種或多種、至少兩種、至少三種、或每一個(gè)多糖(例如，蔗糖或甘露醇)、氨基酸(例如，L-精氨酸、L-組氨酸或L-鳥氨酸)、表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)和pH緩沖劑(例如，檸檬酸鹽制劑)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103119448SQ201180044608
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者N.拉馬蘇布拉曼延, L.馬爾姆伯格, M.斯特恩曼 申請人:Abbvie 公司