專利名稱：阻斷試劑及其使用方法
阻斷試劑及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于樣品中分析物的基于鄰位探針的檢測試驗(“鄰位試驗”)，特別涉及該方法的改進以降低復雜的生物樣品中出現(xiàn)的非特異性“背景”信號。所述改進包括提供用于該試驗的新阻斷試劑。設計阻斷試劑使其緊密類似(“模擬”)鄰位探針的結構。將過量阻斷試劑加入樣品中以占據(jù)該樣品中能夠非特異性地結合鄰位探針的所有或幾乎所有結合位點。因此，在本發(fā)明中，所述阻斷試劑的可觀察到的效果相當于實現(xiàn)樣品的復雜性降低而不顯著降低存在于樣品中的分析物的濃度或量，從而提高試驗的特異性和靈敏度。本發(fā)明還提供了阻斷試劑，包括所述阻斷試劑的試劑盒和用于制備所述阻斷試劑的方法。鄰位試驗依賴“鄰位探測”的原理，其中通過結合多個(即兩個或多個，通常兩個或三個)探針來檢測分析物，所述的探針當通過結合分析物到達鄰位(因此為“鄰位探針”)時，使得信號生成。一般地，鄰位探針的至少一個包括核酸結構域(或者部分)，所述的核酸結構域(或者部分)連接于該探針的分析物結合結構域(或部分)，并且信號的生成涉及該核酸部分和/或其它探針(或多個探針)攜帶的另一個功能部分之間的相互作用。因此信號生成依賴探針之間的相互作用(更具體地通過所述的核酸或其所攜帶的其它功能部分/結構域)，因此所述的信號僅當必要的兩個(或多個)探針都結合于分析物時才會出現(xiàn)，從而使檢測系統(tǒng)的特異性提高。近年來發(fā)展了鄰位探測的概念，并且現(xiàn)在基于該原理的許多試驗在本領域是熟知的。例如，鄰位連接試驗(PLA)依賴鄰位探針與分析物的鄰位結合，從而從連接反應產(chǎn)生信號，所述的連接反應涉及到鄰位試驗的核酸結構域或者由所述鄰位試驗的核酸結構域介導(例如，在其之間和/或通過其作為模板)。因此，在鄰位試驗中可以使用鄰位探針，所述的鄰位探針結合于分析物并具有核酸結構域或部分，所述核酸結構域或部分在所述分析物結合后以鄰位依賴方式相互作用，以形成可檢測的、優(yōu)選可擴增的核酸檢測產(chǎn)物，可以借助所述核酸檢測產(chǎn)物檢測所述分析物，所述的相互作用通常通過連接進行。基于檢測試驗的鄰位探針，特別是鄰位連接試驗通過將該分析物的存在轉(zhuǎn)化為容易地可檢測的或可定量的基于核酸的信號，從而允許靈敏地、快速地和便利地檢測或定量樣品中的一種或多種分析物，并且能夠均質(zhì)的或異質(zhì)的形式進行。本領域的鄰位探針通常成對地使用，并且分別由對靶分析物具有特異性的分析物結合結構域和與其偶聯(lián)的功能結構域構成，所述的功能結構域例如為核酸結構域。所述的分析物結合結構域可以是例如核酸“適體”(Fredriksson等人(2002)NatBiotech20:473-477)或可以是蛋白質(zhì)的，如單克隆或多克隆抗體(Gullberg等人(2004)Proc Natl Acad Sci USAlOl: 8420-8424)。每個鄰位探針對的各自的分析物結合結構域可以對分析物上的不同結合位點具有特異性，所述分析物可以由單個的分子或相互作用的分子的復合物構成，或例如在靶分析物作為多聚體存在的情況下可以具有相同的特異性。當鄰位探針對彼此緊密相鄰時，這主要當兩者結合于相同的分析物上的其各自的位點時發(fā)生，功能結構域(例如核酸結構域)能夠相互作用，例如，核酸結構域通?？梢酝ㄟ^連接反應連接，從而形成新的核酸序列，其中所述的新的核酸序列可以被加入反應中的夾板(splint)寡核苷酸作為模板，所述夾板寡核苷酸含有與鄰位探針對的各自核酸結構域末端互補的區(qū)域。借此生成的新核酸序列用于報告樣品中分析物的存在或量，并可以定性地或定量地對其進行檢測，例如通過實時、定量PCR (q-PCR)。另外，當鄰近時，鄰位探針的核酸結構域可以在一個或多個加入的寡核苷酸的相互連接時作為模板而不是彼此連接，所述的相互連接包括使加入的線性寡核苷酸成圓形的分子內(nèi)連接，例如基于所謂的鎖式(padlock)探針原理，其中類似于鎖式探針的是，加入的線性寡核苷酸的末端通過雜交至模板而并列，以進行連接，在本文中為鄰位探針的核酸結構域(在鎖式探針的情況下為探針的靶核酸)。各種該試驗的形式描述于W001/61037中。W097/00446和US6，511，809公開了鄰位連接試驗的不同形式，即首先借助特異性分析物結合試劑將分析物固定于固體基質(zhì)。相同的鄰位連接試驗(B卩，在溶液中的)公開于W001/61037、W003/044231、W02005/123963、Fredriksson等人(2002)Nat Biotech20:473_477和Gullberg等人(2004)Proc Natl Acad Sci USAlOl:8420-8424 中。雖然通常使用鄰位探針對，但在例如W001/61037和W02005/12963中描述了鄰位探針檢測試驗的改變，其中使用三個鄰位探針檢測單個分析物分子，第三探針的核酸結構域具有兩個游離末端，所述游離末端可以結合(連接)于第一和第二探針的核酸結構域各自的游離末端，從而夾在其間。在該實施方案中，需要兩種夾板寡核苷酸對第一和第二探針的每個核酸結構域與第三探針的核酸結構域的連接進行模板化。在W02007/107743描述的其它改變中，為兩個鄰位探針的核酸結構域的連接作為模板的夾板寡核苷酸攜帶于第三鄰位探針上。不是所有鄰位試驗均基于 連接。W02007/044903公開了用于檢測分析物的基于鄰位探針的試驗，所述的試驗依賴于釋放的核酸切割產(chǎn)物的形成和檢測。某些描述的實施方案涉及包括分析物結合部分和連接的酶的探針，所述酶作用于連接于第二探針的分析物結合部分的核酸部分，導致釋放可檢測的核酸切割產(chǎn)物。分析物檢測試驗，在某些實施方案中包括鄰位探針樣試劑，其中連接于一個探針的分析物結合部分的聚合酶作用于連接于第二探針的分析物結合部分的核酸部分，如TO2009/012220所描述的。在這些試驗中，作為探針對的一個探針的部分的“錨定的(tethered)”聚合酶的作用導致游離在溶液中的模板的生成，所述模板通過加入的聚合酶而易于擴增。與錨定的聚合酶不同，加入的聚合酶僅能夠作用于由所述的錨定聚合酶生成的模板，并且不直接作用于探針對的不含聚合酶的探針的核酸部分。根據(jù)鄰位探測原理，力口入的聚合酶的作用導致所生成模板的擴增，擴增的拷貝是可檢測的并指示樣品中分析物的存在。除了鄰位探針檢測試驗的變化，還描述了鄰位探針自身的結構的變化，例如在W003/044231中使用了多價鄰位探針。該多價鄰位探針包括至少兩個，最多100個分析物結合結構域，所述分析物結合結構域綴合于至少一個，優(yōu)選地多于一個核酸(或多個核酸)。在許多不同的應用中，已證明基于鄰位探針的檢測試驗，特別是鄰位連接試驗在特異性和靈敏地檢測蛋白，例如弱表達或低豐度蛋白的檢測中非常有用。然而，該試驗在試驗的靈敏度和特異性方面并非沒有問題，并且存在改進空間。如上所述的，傳統(tǒng)鄰位試驗，例如鄰位連接試驗的靈敏度受限于兩個主要因素:
(i)分析物結合結構域?qū)Π蟹治鑫锏挠H和力和(ii)由未結合的探針特別是探針對的隨機鄰位產(chǎn)生的非特異性背景信號。使用具有對分析物親和力高的結合結構域的探針，靈敏度限于檢測約6000個分子。習慣上，為了實現(xiàn)低水平的背景，必須使用濃度非常低的鄰位探針。這排除了通過使用濃度更高的探針來補償包含低親和分析物結合結構域的探針的任何嘗試。因此發(fā)現(xiàn)這可以限制試驗的靈敏度和能夠得到定量結果的范圍。提出了其它用于降低非特異性背景信號的方法，如將夾板寡核苷酸偶聯(lián)于第三鄰位探針和/或使用阻斷寡核苷酸，所述阻斷寡核苷酸結合于鄰位探針上的核酸結構域的游離末端，直到被夾板寡核苷酸置換。僅當鄰位探針結合于靶分析物時才容易發(fā)生置換(W02007/107743)。其它降低背景信號的方法集中于改進對連接的核酸的檢測。然而，仍然有空間來改進背景信號的水平，并且為了克服鄰位試驗的限制，特別是如上所述的本領域已知的鄰位連接試驗，目前已發(fā)現(xiàn)使用類似鄰位探針結構的阻斷試劑可顯著提高試驗的靈敏度和特異性。優(yōu)選地，本發(fā)明的阻斷試劑在加入鄰位探針之前與樣品接觸。通過占據(jù)樣品中能夠非特異性結合于試驗中使用的鄰位探針、分析物或其它成分的一些或所有位點，可能降低存在于試驗中的非特異性背景信號。雖然使用試劑占據(jù)非特異性結合位點在用于檢測樣品中的分析物的方法中是熟知的，但是與上述阻斷試劑相比，本發(fā)明的阻斷試劑的性質(zhì)提供獨特且出乎意料的優(yōu)勢。通常，阻斷試劑是基于相對惰性和穩(wěn)定的分子進行選擇的，所述分子不干擾上述討論的檢測試驗的機制，但該分子會非特異性地和均一地結合于試驗樣品中的位點，所述的位點否則會結合結合分析物或探針。標準阻斷試劑，如免疫試驗中所使用那些，從豐富的到普通的蛋白，例如BSA、奶粉、酪蛋白、明膠，和中性去污劑，例如CHAPS、Triton X-100、Tween-20，到中性聚合物，例如聚乙烯醇。在涉及核酸的試驗中，通常使用片段化的核酸阻斷非特異性結合位點，所述的片段化的核酸例如經(jīng)聲處理的鮭魚精DNA、聚-A RNA。此外，已知這些分子的組合可以用于降低試驗中的非特異性背景信號。然而，本發(fā)明的阻斷試劑依賴于當阻斷蛋白綴合或偶聯(lián)于核酸時所見的優(yōu)良的阻斷作用。特別地，所述阻斷試 劑的蛋白成分是對分析物具有非常低的或優(yōu)選地無特異性結合親和力的蛋白，即非分析物特異性結合蛋白或非分析物特異性蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，選擇阻斷試劑的蛋白成分以模擬鄰位探針的蛋白質(zhì)分析物結合結構域或使其與鄰位探針的蛋白質(zhì)分析物結合結構域類似。作為選擇地或此外地，阻斷蛋白可以與存在于鄰位探針中的另一種蛋白或蛋白部分類似，例如鏈酶親和素或鄰位探針中使用的類似蛋白以使探針的分析物結合結構域與核酸結構域結合。因此，可以看出阻斷試劑為蛋白-核酸綴合物，并且其以該方式模擬或與鄰位探針類似，所述阻斷試劑自身為蛋白綴合物(或蛋白質(zhì)分子)(例如分析物結合結構域)和核酸。這兩個試劑的偶聯(lián)導致了在基于鄰位探針的試驗中非特異性背景信號更好地降低。如實施例中更加詳細地顯示的，本發(fā)明與本領域已知的其它阻斷試劑的應用相比代表了顯著的進步。特別地，在基于鄰位探針的檢測試驗中，已顯示單獨使用阻斷試劑的非分析物特異性結合蛋白成分或阻斷試劑的核酸成分在降低非特異性背景信號上是無效的。令人驚訝地，僅當以綴合形式使用非分析物特異性結合蛋白成分和核酸成分的組合時才能觀察到阻斷效果明顯提高。使用單個未綴合成分的組合未重現(xiàn)綴合阻斷試劑的效果。因此，是這兩個成分綴合從而形成單一的阻斷試劑導致了非特異性背景信號顯著并完全出乎意料地降低。此外，本發(fā)明的阻斷試劑優(yōu)于先前在基于鄰位探針的檢測試驗中使用的阻斷試劑。如此的背景信號降低的結果是鄰位探針檢測試驗的特異性和靈敏度升高。此外，本發(fā)明所述的阻斷試劑可以與其它步驟組合使用以進一步降低非特異性背景信號。因此，可以看出本發(fā)明提供了與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物在基于探針的檢測試驗中作為阻斷試劑的用途，所述的試驗中使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針檢測樣品中的分析物。另外來看，本發(fā)明的該方面提供了檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的鄰位探針，其中使用偶聯(lián)到核酸的非分析物特異性結合蛋白的綴合物作為阻斷試劑。從再另一個方面來看，本發(fā)明提供了在基于鄰位探針的對樣品分析物檢測的試驗中，降低鄰位探針對樣品中分析物的非特異性結合的方法，所述鄰位探針包括與偶聯(lián)到核酸結構域的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體，所述方法包括將阻斷試劑加入所述樣品中，所述阻斷試劑包括偶聯(lián)于核酸的非分析物特異性結合蛋白的綴合物。然而，本發(fā)明所述阻斷試劑的應用無需僅限于使用鄰位探針的方法。鑒于鄰位探針試驗中獲得的有利結果(見實施例)，設想阻斷試劑可以在使用相似探針(即，包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域)的任何試驗中都有著同樣好的效果，所述的試驗包括探針作為單一試劑，例如免疫試驗，如免疫PCR和免疫RCA。因此，從最寬的意義上來說，可看出本發(fā)明提供了偶聯(lián)于核酸的非分析物特異性結合蛋白的綴合物在基于探針的檢測試驗中作為阻斷試劑的用途，其中使用與核酸結構域偶聯(lián)的包括蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針以檢測樣品中的分析物。另外來看，本發(fā)明的該方面提供了檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括使用與核酸結構域偶聯(lián)的包括蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針，其中偶聯(lián)于核酸的非分析物特異性結合蛋白的綴合物用作阻斷試劑。從再另一個方面中來看，本發(fā)明在基于鄰位探針的對樣品分析物檢測的試驗中，提供了降低探針對樣品中分析物的非特異性結合的方法，所述探針包括偶聯(lián)于核酸結構域的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體，所述方法包括將阻斷試劑加入所述樣品中，所述阻斷試劑包括偶聯(lián)于核酸的非分析物特異性結合蛋白的綴合物。在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明所述方法用于免疫試驗，并且阻斷試劑用于免疫試驗中，優(yōu)選地，其中所述免疫試驗為免疫PCR。此免疫試驗可以為本領域已知的任何試驗，所述試驗利用包括偶聯(lián)于核酸結構域的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針以檢測分析物。本發(fā)明所述阻斷試劑在免疫PCR試驗中，例如在第5，665，539號美國專利所描述的試驗中尤其地有用，其中使用了本文之前所定義的單一探針來檢測已固定的分析物。通過與分析物的相互作用將探針捕獲于固相上，探針的核酸結構域可通過擴增反應檢測。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明所述方法為基于鄰位探針的試驗，并且阻斷試劑用于基于鄰位探針的試驗，并且所述探針為鄰位探針?；卩徫惶结樀臋z測試驗(鄰位試驗)可以是本領域已知的任何試驗 ，例如前文所述的使用鄰位探針檢測樣品中的分析物試驗。有利地，本發(fā)明可用于這樣試驗的環(huán)境下，其中試驗中的至少兩個(或所有)鄰位探針是基于蛋白-核酸綴合物的(即，包括偶聯(lián)于核酸結構域的蛋白分析物結合結構域)。顯著地，該試驗是鄰位連接試驗，盡管本發(fā)明不限于檢測基于連接的鄰位探針的核酸結構域之間的相互作用(例如核酸結構之間的相互作用可是基于雜化或雜交和延伸的，例如在W097/00446 或 W001/61037 中所公開的)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中提供了檢測樣品中分析物的方法，包括:(a)將所述樣品與阻斷試劑接觸，所述阻斷試劑包括偶聯(lián)于核酸的非分析物特異性結合蛋白；(b)將所述樣品進一步與至少一組的，至少第一和第二鄰位探針接觸，所述探針各自包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合于分析物；(c)當所述鄰位探針與所述分析物結合時，使得鄰位探針的核酸結構域彼此相互作用，其中所述相互作用包括連接反應；和(d)檢測所述連接。不希望被理論束縛，認為本發(fā)明所述方法依賴阻斷試劑在樣品內(nèi)部占據(jù)位點，而不是結合于探針或試驗中的其它組分，從而干擾分析物的檢測。因此本發(fā)明的阻斷試劑和用于本發(fā)明所述方法的阻斷試劑的使用通常比各自的探針過量，優(yōu)選地摩爾過量，例如過量2-100000倍，例如20-50000倍，50-30000倍，100-50000 倍，100-30000 倍，1000-20000 倍，5000-10000 倍，例如 5、10、100、200、500、1500、3000,6000 或 12500 倍。所述的檢測自身依賴于樣品中分析物的存在，和檢測兩個(或多個)鄰位探針與分析物結合時之間的相互作用。因此探針之間的相互作用(或更具體地，在其各自核酸(或其它功能性的)結構域之間的(例如核酸結構域和酶結構域之間的相互作用)為鄰位依賴性的；鄰位探針共同結合到分析物使它們變得鄰近，以使它們(或更特別地，其核酸結構域)可相互作用。因此，通過檢測相互作用，例如連接反應(例如通過檢測相互作用產(chǎn)物，例如連接反應的產(chǎn)物)，可以檢測分析 物。因此，在通常情況下鄰位探針的核酸/功能域之間的相互作用(例如，鄰位探針的核酸結構域之間的或鄰位探針上核酸結構域與另一個功能結構域之間的)可導致產(chǎn)物的生成，所述的產(chǎn)物通常為核酸產(chǎn)物，可以對所述的產(chǎn)物進行檢測以檢測分析物。因此在上述方法的步驟(d)中，通過檢測所述連接(例如通過檢測所述連接反應的產(chǎn)物)，可檢測所述分析物。如上所述，基于連接的依賴鄰位的試驗代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案(B卩，其中用于檢測方法中的至少第一和第二鄰位探針包括核酸結構域，并且其間的相互作用涉及連接反應)。一般來看，探針的核酸結構域可以介導(例如直接或間接參與連接反應)。該連接反應可以涉及鄰位探針的核酸結構域的連接，和/或核酸結構域可以作為連接反應的模板。通過更具體的實例，在本發(fā)明所述方法的一個實施方案中，可以通過互相結合(join)使鄰位探針相互作用，例如通過連接(ligation)。所述的相互作用可以通過檢測連接產(chǎn)物來進行檢測(相互作用產(chǎn)物，連接產(chǎn)物)。在該方法的一種形式中，所述核酸結構域的相互作用需要一個或多個夾板寡核苷酸與結構域結合并介導其相互作用(具體地在連接的情況下，所述夾板寡核苷酸雜交到所述的結構域，并充當連接反應的模板)并且所述夾板促進或介導該相互作用。從上述各種鄰位試驗的描述中可認識到，在其它形式/實施方案中，所述夾板可以作為第三鄰位探針的核酸結構域提供，和/或核酸結構域的連接可以是直接的(即，核酸結構域可直接互相連接)，或間接的，即，它們可以間接地連接，例如通過間隔(gap)寡核苷酸的中介(intermediacy);在一個這樣的實施方案中，核酸結構域可雜交域夾板寡核苷酸上，在它們各自的末端留下間隔一可通過間隔寡核苷酸或通過使用聚合酶延伸核酸結構域之一的末端(游離的3’端)填充該間隔。鄰位試驗的該“間隔填充”的實施方案在文獻中有充分描述，例如在W001/61037或在W02007/107743中。在一個更加具體的實例中，鄰位探針的一個或多個核酸結構域可在一個或多個所加入的寡核苷酸的連接中起到模板的作用。在一個這樣的實施方案中，首先加入的寡核苷酸可雜交到兩個核酸結構域，可加入一個或多個其它的僅與結構域之一雜交的寡核苷酸，例如可以與每個核酸結構域結合的寡核苷酸，每個寡核苷酸鄰近第一寡核苷酸的每個末端，所述加入的寡核苷酸可以在核酸結構域作為模板的反應中與第一寡核苷酸連接。在另外的實施方案中，所加入的寡核苷酸(或多種寡核苷酸)可通過連接反應環(huán)化(即，類似上述的鎖式探針)。因此，通過舉例的方式，連接于各自探針的分析物特異性結合部分的鄰位探針對核酸結構域可分別與所加入的線性寡核苷酸(類似與“鎖式探針”)的(i )5'和3'端，和(ii)所述末端之間的區(qū)域具有互補性。當鄰位探針對的兩個探針均由于結合于相同分析物而鄰近時，各自探針的核酸結構域能夠與所加入寡核苷酸的各自部分進行雜交。對所加入的寡核苷酸的5'和3'端具有互補性的核酸結構域可以作為并列雜交和所述末端的連接的 模板(加入合適的連接酶后)，導致所加入的寡核苷酸的環(huán)化。然后使用其它核酸結構域作為引物，通過滾環(huán)擴增(RCA)檢測該環(huán)化的寡核苷酸；此對中的另一個探針的核酸結構域具有3’游離末端，所述的核算結構域雜交到所加入的寡核苷酸的連接末端之間。在加入合適的聚合酶后，可通過環(huán)化寡核苷酸的滾環(huán)擴增(RCA)來檢測樣品中的分析物的存在。僅當鄰位探針鄰位結合時才能夠形成的多聯(lián)體RCA產(chǎn)物為分析物的檢測提供了“替代”標志物。應當認識到單一的加入的寡核苷酸能夠被兩個寡核苷酸取代，所述兩個寡核苷酸可連接到一起形成圓形(該連接可由一個或兩個核酸結構域作為模板，但是所述結構域中的一個應具有游離的3'端以充當引物)。鄰位探測反應也可通過利用兩個游離的3'端來進行，一個在每個鄰位探針上并具有弱的互補性，當鄰近時，DNA聚合酶可以通過加入dNTP延伸這些末端，從而形成可檢測的DNA模板，例如在第7，306，904號和第6，511，809號美國專利所述的。其它雜交和延伸形式也是可能的，例如其中一個核酸結構域具有游離的3'端，另一個具有游離的5'端，其中核酸結構域(或核酸結構域的更特定的部分)可以互相雜交或雜交到共同的雜交模板，或具有游離的3'端的兩個核酸結構域(或其更特定的部分)與共同雜交模板雜交，在每種情況下在雜交之后有至少一個游離的3'端可用，所述游離的3'端可進行延伸以形成可檢測的延伸產(chǎn)物。鄰位延伸試驗的各種實例描述于GB1101621.9中。在本發(fā)明最廣泛的實施方案中，本發(fā)明所述的阻斷試劑和用于本發(fā)明的方法的阻斷試劑包括偶聯(lián)于核酸結構域的非分析物特異性結合蛋白成分。阻斷試劑的非分析物特異性結合蛋白成分可廣泛地定義為蛋白，所述蛋白對基于鄰位探針試驗的靶分析物具有非常低或低的，即可忽略的，不可檢測的或不顯著的結合親和力，或無特異性結合親和力。換言之，可以將其看作與分析物特異性結合蛋白的反義詞，而所述的與分析物特異性結合蛋白可定義為能夠特異結合于，但不需要專一地結合于分析物的蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)可優(yōu)先結合于包括非分析物成分的環(huán)境中的分析物。因此非分析物特異性結合蛋白不能特異性結合于分析物，并且在包括其它成分的環(huán)境中不能優(yōu)先結合于分析物。然而，所述的非分析物特異性結合蛋白能夠特異結合于其它分子，例如非分析物(其可以是鄰位探針試驗中不存在的分子)，盡管優(yōu)選地，阻斷試劑的非分析物特異性結合蛋白成分對基于鄰位探針試驗中的任何一種或多種成分不具有特異的結合親和力，即，其僅能夠非特異性或一致地地結合于試驗樣品中的位點而不是結合于分析物或探針。因此所述的阻斷試劑，特別是所述的阻斷試劑中的蛋白成分，必須不能特異性結合于靶分析物。因此，阻斷試劑的蛋白成分必須不能以比樣品中其它成分更高的親和力和/或特異性結合于靶標(例如分析物)，即，任何與靶分析物的結合不能區(qū)別于與非靶分析物的結合；阻斷試劑的蛋白成分不結合于靶分析物或可忽略地結合或不可檢測地結合以使任何該非特異性結合，如果發(fā)生的話，不會區(qū)別于與其它非靶分析物的結合。阻斷試劑和樣品中任意靶分析物或非靶分析物之間的結合通常是非共價的。特別地，如果阻斷試劑的蛋白成分能夠結合于靶分析物，該結合必須是短暫的，并且其結合親和力必須小于鄰位探針對靶分析物的結合親和力。因此，阻斷試劑的蛋白成分對革G分析物的結合親和力應至少比鄰位探針的分析物祀向結合位點小一個量級。優(yōu)選地，阻斷試劑的蛋白成分的結合親和力應至少比鄰位探針的分析物靶向結合位點小2、3、4、5或6個量級。因此，對分析物的特異性結合親和力非常低、低或沒有是指阻斷試劑的蛋白成分對分析物的解離常數(shù)為至少10_ 2m?！爸辽佟笔侵缸钄嘣噭┑牡鞍壮煞值臐舛缺仨毟咭詫е?0%的蛋白成分的“結合位點”被分析物占據(jù)。在本發(fā)明所述試驗的情況下，在上述范圍內(nèi)的Kd會導致僅有小部分的分析物結合于阻斷試劑。例如，如果阻斷試劑以KT4M的濃度存在，并且分析物以10_9M的濃度存在，并且阻斷試劑對分析物的&為10_2M，那么可預期阻斷試劑分析物復合物的濃度在任意時間為10_nM，即總分析物僅有1%會結合于阻斷試劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，阻斷試劑的蛋白成分對分析物的解離常數(shù)為至少IO-2MUiT1M'0.1M、1M、2M、5M*10M。因此，無特異結合親和力是指阻斷試劑的蛋白成分的解離常數(shù)是這樣，使得在用于鄰位探針反應的濃度下僅在分析物和非分析物特異性結合蛋白之間發(fā)生非特異性短暫的相互作用。另外，當用于本發(fā)明的方法時，小于10%的分析物將結合于阻斷試劑的蛋白成分。更優(yōu)選地，小于5%、4%、3%、2%或1%的分析物將結合。最優(yōu)選地，小于0.5%、0.1%、0.01%或0.001%的分析物將結合于阻斷試劑的蛋白成分。非分析物特異性結合蛋白可以是單一蛋白物種或類型，或可以是不同蛋白的混合物，例如不同蛋白類型或相同類型的不同物種(在這里使用的術語“物種”不具有分類學意義，而是旨在表示特定特異性類型的蛋白)。例如，當?shù)鞍讓μ囟?非分析物)靶標具有結合特異性時，可使用不同特異性的蛋白混合物。優(yōu)選地在該情況下蛋白混合物不包括對靶分析物具有特異性的蛋白，或另外地，混合物中的任何蛋白對靶分析物均不具有特異結合活性或?qū)Π蟹治鑫锏娜我饨Y合活性都非常低，例如以上定義的可忽略或微不足道或無法檢測。阻斷試劑的非分析物特異結合蛋白成分優(yōu)選為血清蛋白或鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白，或其修飾物、衍生物或變體，或其組合。當阻斷試劑的非分析物特異性結合蛋白成分包括一種或多種以下進一步定義的優(yōu)選的蛋白時，應理解這些蛋白對靶分析物不可能具有任何特異結合親和力。血清蛋白成分可以是單一特定類型的血清蛋白，或可以包括多個不同類型和結構的蛋白。特別地，血清蛋白成分可以是球蛋白和/或白蛋白。鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白成分可以是單一特定類型的鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白或其修飾物、衍生物或變體，或可以包括多個所述蛋白。鏈酶親和素樣蛋白可定義為具有與鏈酶親和素或其修飾物、衍生物或變體相似的結構和/或功能特征的蛋白。例如，在鳥類、爬行動物和兩棲動物的卵白中發(fā)現(xiàn)的抗生物素蛋白，僅顯示與鏈酶親和素具有30%的序列同源性，但與鏈酶親和素具有幾乎相同的二級、三級和四級結構，并且被認為是鏈酶親和素樣蛋白?？股锼氐鞍滓才c鏈酶親和素具有共同的功能特性，能夠以高度的親和力或特異性結合于生物素。因此，本發(fā)明也考慮鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白的修飾體、衍生物或變體，例如，片段或截短的蛋白、化學修飾的蛋白或多肽，或通過基因工程獲得的變體，例如基于天然存在的鏈酶親和素或抗生物素蛋白的氨基酸序列但包括一個或多個氨基酸替換、添加和/或缺失等的多肽。也包括等價的或相應的蛋白，所述蛋白不必須是天然存在的，但結構或功能上是等價的。優(yōu)選地，該修飾體包括抗生物素蛋白的去糖基化和/或中性形式。本發(fā)明所述的鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白可以來自單一來源或多個來源，即，來自單一類型的有機體，例如細菌或動物，或來自多個類型的有機體，例如細菌的不同株或動物的不同物種。可考慮合成得到的或獲得的，例如重組的鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白形式。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白選自鏈酶親和素、NeutrAvidin 、Extravidin 和NeutraLite 。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的阻斷試劑的蛋白成分包括鏈酶親和素。血清蛋白包括球蛋白和白蛋白兩者，并來自血漿，所述的血漿可以定義為當除去細胞和血小板后剩余的血液部分。更具體而言，血清可以定義為不包含細胞、纖維蛋白原或任何其它凝血因子的血漿的部分。因此，血清蛋白可以是可以從血清中獲得的(或可獲得的)或存在于血清中的任何蛋白。其可以是存在于血清中或從血清中獲得的單一蛋白，或該蛋白的混合物，或其 可以是來自血清的蛋白部分或蛋白成分。本發(fā)明所述阻斷試劑的蛋白成分通?？梢园ㄑ宓鞍?，也就是說其通常可由血清的血清蛋白成分代表，而不需分離特定蛋白成分。換言之，其可為存在于血清中的蛋白的混合物，并且可從其中分離。因此，在本發(fā)明所述阻斷試劑中的血清蛋白可以包括球蛋白和白蛋白，優(yōu)選地Y-球蛋白(免疫球蛋白)和/或血清白蛋白。所述血清蛋白可以來自單一血液來源或多個血液來源，即，來自不同動物個體和/或來自不同類型的動物。因此可使用不同物種的或來自不同物種的血清蛋白，例如來自任意哺乳動物物種的。雖然血清蛋白的天然來源是便利的，但可通過合成得到或獲得血清蛋白，例如通過重組表達或通過對天然存在的蛋白進行衍生化。因此，包括在術語“血清蛋白”中的不僅是天然存在于血清中的任意蛋白，而且還包括其變體和衍生物，例如片段或截短蛋白、化學修飾的蛋白或多肽、或通過基因工程獲得的變體，例如基于天然存在的血清蛋白的氨基酸序列但包括一種或多種氨基酸替換、添加和/或缺失等的多肽。也包括等價體或相應蛋白，所述蛋白不必存在于血清中，但是在結構或功能上是等價的。球蛋白、假球蛋白和優(yōu)球蛋白廣泛存在于動物和植物界，通過其物理性質(zhì)如溶解度和電泳遷移對其進行表征，例如假球蛋白在水和稀鹽溶液中都可溶，而優(yōu)球蛋白不溶于水但溶于稀鹽溶液中。兩種球蛋白子類均可通過熱凝固。本發(fā)明可使用任意該球蛋白。因此，一般說來，本發(fā)明所述的阻斷試劑可以包括任意的球蛋白。如以下更加詳細地描述的，也可使用白蛋白，因此本發(fā)明所述阻斷試劑可以包括任意白蛋白。
球蛋白的主要來源為血漿和血清、乳汁、肌肉和植物種子。特別地，術語“球蛋白”包括在血清中發(fā)現(xiàn)的異體蛋白群體，所述蛋白群體分類為具有高分子量，溶解度和電泳遷移速率低于白蛋白，所述白蛋白為組成血清的主要成分的另一類蛋白。因此，用于本發(fā)明所述阻斷試劑的優(yōu)選的血清蛋白是血清球蛋白，其可以包括四種主要蛋白:α-1球蛋白、α-2球蛋白、球蛋白和Y-球蛋白。然而，本領域技術人員應認識到當處理血清以除去纖維蛋白原和其它凝血因子時，血清蛋白僅包括球蛋白亞種，主要為Y-球蛋白。優(yōu)選的阻斷試劑的血清蛋白為血清蛋白的球蛋白部分包括至少70%的Y -球蛋白，優(yōu)選80%和最優(yōu)選至少90%的Y -球蛋白。α -球蛋白的特征在于其在堿性的或帶電荷的溶液中高度移動的能力，并且包括α -1抗胰蛋白酶和血清淀粉樣蛋白A ( α -1球蛋白)和觸珠蛋白和血漿銅藍蛋白(α -2球蛋白)。β_球蛋白的特征在于其在堿性的或帶電荷的溶液中比α-球蛋白的移動性較低，但高于Y-球蛋白，并且包括血纖維蛋白溶酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。因此，Y-球蛋白在堿性的或帶電荷的溶液中比α-和β_球蛋白的移動性低，并且包括作為蛋白的主導類型的免疫球蛋白(抗體)。本領域很好地描述了抗體，抗體被分為多個組，通常為IgG、IgE、IgD (所有單體)、IgA (二聚體)和IgM (五聚體)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，阻斷試劑的蛋白成分包括Y-球蛋白，特別是免疫球蛋白。優(yōu)選的阻斷試劑的免疫球蛋白物種為IgG。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，阻斷試劑的蛋白成分為大批的IgG，即由包括具有一系列結合特異性和親和力的多種免疫球蛋白(IgG)的血清純化得到的免疫球蛋白。因此大批的IgG包括具有不同特異性的不同IgG蛋白，S卩，具有不同特異性的IgG蛋白的混合物。優(yōu)選地，所述的不同特異性為非靶分析物特異的結合特異性。雖然考慮阻斷試劑的蛋白成分可以包括具有特異性結構，即具有結合特征的免疫球蛋白(或如下所述的白蛋白)，僅當該免疫球蛋白的結合性質(zhì)不干擾分析物的檢測時該特征才具有實用性，即阻斷試劑的蛋白成分必須不能夠特異和親和結合于分析物，如上所述的和以下詳細描述的。因此優(yōu)選地，阻斷試劑的IgG成分，特別是大批的IgG對靶分析物不具有特異結合活性，或已發(fā)生的對靶分析物的任何結合都較低，例如如上所述的微不足道、可忽略或不可檢測。重點是阻斷試劑與靶分析物的任何結合不干擾試驗的性能。因此免疫球蛋白成分，例如IgG或大批的IgG對靶分析物不具有結合活性，或具有低的(或非常低的)結合活性。特別感興趣的是阻斷試劑的血清蛋白成分為抗體，以及其結合片段和衍生物或模擬物，所述的抗體優(yōu)選為IgG抗體。同樣地，阻斷試劑的蛋白成分可為單克隆或多克隆抗體。在再另一個實施方案中，阻斷試劑的蛋白成分是抗體的結合片段或其衍生物或模擬物，其中這些片段、衍生物和模擬物對靶分析物不具有結合親和力。例如，可通過切割完整蛋白來制備抗體片段如Fv、F(ab)2和Fab，例如通過蛋白酶或化學切割。還感興趣的是重組性或合成性制備的抗體片段或衍生物，如單鏈抗體或scFv，或其它抗體衍生物如嵌合抗體或CDR嫁接(graft)抗體,其中該重組或合成制備的抗體片段保留上述抗體的結合特征，即它們不能夠特異性結合于靶分析物。該抗體片段或衍生物通常包括題述抗體的至少Vh和\結構域，以保持題述抗體的結合特征。在阻斷試劑的蛋白成分的情況下，結合特征是這樣的以至于它們不結合于靶分析物?？梢允褂萌魏畏奖愕姆椒ㄈ菀椎刂苽漕}述發(fā)明所述的該抗體片段、衍生物或模擬物，如第5，851，829號和第5，965，371號美國專利中所公開的方法，將其公開引入本文作為參考。上述抗體、其片段、衍生物和模擬物可以由商業(yè)來源獲得和/或使用任意便利的技術制備而成，其中本領域技術人員已知制備多克隆抗體、單克隆抗體、其片段、衍生物和模擬物的方法，包括其重組衍生物。如上所述的，白蛋白構成血漿和血清的另一個主要成分，并且該種類的蛋白由于其在水中的溶解度以及熱處理后凝固的傾向而值得注意。因此，在另一個實施方案中，阻斷試劑的蛋白成分可以包括血清白蛋白。值得注意的是血清白蛋白顯示與免疫球蛋白(Y-球蛋白)具有顯著的結構相似性。用于本發(fā)明所述的阻斷試劑中的血清白蛋白可以來自單一來源，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等，或可以是不同血清白蛋白的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，其中阻斷試劑的蛋白成分來自上述的血清蛋白，所述血清蛋白來自與鄰位探針的蛋白質(zhì)靶分析物結合結構域相同的種類。因此，例如，當鄰位探針的分析物結合結構域包括或基于免疫球蛋白例如IgG時，阻斷試劑的蛋白成分由來自相同物種的IgG構成，優(yōu)選大批的IgG。阻斷試劑的核酸結構域可以包括同種結構域，即偶聯(lián)于阻斷試劑的蛋白成分的單一序列，或異體的結構域，即多個不同序列，其中一個不同序列存在于阻斷試劑的蛋白成分的蛋白上。阻斷試劑的核酸結構域的選擇基于其不干擾發(fā)明所述方法中的分析物的檢測來進行。換言之，阻斷試劑的核酸結構域必須不能與試驗中使用的鄰位探針的核酸結構域具有顯著的序列同源性。此外，當任何其它核酸分子(例如寡核苷酸)加入或用于試驗方法中時，例如其中一個或多個夾板寡核苷酸和/或間隔/盒式寡核苷酸(例如，如下所述)和/或加入的用于連接的寡核苷酸(“可連接的寡核`苷酸”或“連接底物”)和/或阻斷寡核苷酸(如下所述)用于介導(或促進)鄰位探針的核酸結構域之間的相互作用，阻斷試劑的核酸結構域必須不能與那些寡核苷酸(或多種寡核苷酸)具有顯著的序列同源性。此外，阻斷試劑的核酸結構域必須不能雜交于分析物或干擾第一和第二鄰位探針的核酸相互作用的檢測方法，即，必須不能與擴增例如PCR等使用的引物具有序列同源性。因此，只要不與試驗中使用的鄰位探針的核酸結構域、或任意其它寡核苷酸(或多種寡核苷酸)(例如，加入反應混合物中的夾板寡核苷酸和/或連接底物(即，可連接的寡核苷酸)，即不存在于原始樣品中的)或分析物雜交，那么阻斷試劑的核酸結構域的序列就不是關鍵的，特別是當靶分析物為核酸時。通常，應選擇阻斷試劑的核酸序列以避免除了在樣品中存在并且不是本方法的靶分析物的核酸之間以外發(fā)生的雜交事件。一旦選擇或確定了序列，可使用任何便利的方法合成核酸結構域。所謂缺乏顯著的序列同源性是指阻斷試劑的核酸結構域必須與試驗中使用的鄰位探針的核酸結構域、夾板或其它寡核苷酸(例如，介導或促進鄰位探針的核酸之間的相互作用的寡核苷酸)或用于檢測鄰位探針之間的相互作用的核酸具有小于80%的序列同源性。優(yōu)選地，阻斷試劑的核酸結構域必須與所考慮的核酸的大部分具有小于70%、60%、50%或小于40%的序列同源性。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，阻斷試劑的核酸結構域包括一個或多個隨機生成的核酸序列?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何合適的方法測定序列同源性，例如使用BLAST比對算法。因此，阻斷試劑的核酸可為單鏈核酸分子(例如，寡核苷酸)，部分雙鏈和部分單鏈的分子，或雙鏈分子，所述雙鏈分子包括雙鏈區(qū)域以及兩條核酸鏈不互補而成為單鏈的區(qū)域。同樣，在某些實施方案中，核酸結構域由單鏈核酸構成。在其它實施方案中，核酸結構域可由兩條部分互補的核酸鏈構成，其中兩條鏈包括雜交區(qū)域和非雜交區(qū)域。阻斷試劑的核酸結構域的長度通常為約8至約1000個核苷酸，其中在某些實施方案中它們的長度為約8至約500個核苷酸，包括長度為約8至約250個核苷酸，例如長度為約8個至約160個核苷酸，如長度為約12至約150個核苷酸，長度為約14至約130個核苷酸，長度為約16至約110個核苷酸,長度為約8至約90個核苷酸,長度為約12至約80個核苷酸，長度為約14至約75個核苷酸,長度為約16至約70個核苷酸,長度為約16至約60個核苷酸等。在某些代表性的實施方案中，核酸結構域的長度可為約10至約80個核苷酸，長度可為約12至約75個核苷酸，長度可為約14至約70個核苷酸，長度可為約34至約60個核苷酸，以及在所述范圍之間的任意長度。在某些實施方案中，核酸結構域的長度通常不多于約 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、65 或 70 個核苷酸。阻斷試劑的核酸結構域可由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成核苷酸殘基構成，所述的合成核苷酸堿基是能夠參與沃森-克里克類型或類似的堿基對相互作用的。因此，核酸結構域可以是DNA或RNA或其任意修飾物，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。因此，在極端情況下，本發(fā)明所述的阻斷試劑可以包括多種偶聯(lián)于多種核酸的蛋白，或如前所述的偶 聯(lián)于核酸的單一類型的蛋白，或其組合，所述的單一類型的蛋白均由相同的序列構成。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，阻斷試劑包括偶聯(lián)于任意寡核苷酸的大批的IgG，其中所述寡核苷酸為單鏈DNA。進一步優(yōu)選地，寡核苷酸的長度至少為40個核苷酸。核酸結構域偶聯(lián)于阻斷試劑的蛋白成分，并且該“偶聯(lián)”或連接可以是本領域已知的任意手段，可能是需要的或便利的，直接或間接的，例如通過連接基團。例如結構域可以通過共價鍵(例如化學交聯(lián))或通過非共價連接來互相連接，所述的非共價連接例如通過基于鏈酶親和素-生物素的偶聯(lián)(在一個結構域上提供生物素，在另一個上提供鏈酶親和素)。在阻斷試劑的蛋白成分為鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白或其修飾物、衍生物或變體的情況下，在寡核苷酸分子上提供生物素分子。然而，考慮到鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白或其修飾物、衍生物或變體可以直接偶聯(lián)于阻斷試劑的寡核苷酸上，即通過共價鍵以及在生物素不存在的情況下。如上所討論的，在該方面中，與成分未發(fā)生偶聯(lián)的單獨或組合使用的成分相比，阻斷試劑的兩種成分的偶聯(lián)會導致阻斷試劑的優(yōu)良作用。阻斷試劑的兩種成分通過鍵直接連接或通過連接基團間接連接。當采用連接基團時，可以選擇該基團以提供核酸結構域和蛋白成分通過連接基團的共價連接。感興趣的連接基團根據(jù)蛋白成分的本質(zhì)可以有很大的變化。當連接基團存在時，其在許多實施方案中是生物惰性的。本領域技術人員已知多種連接基團，并且已發(fā)現(xiàn)其應用于題述的阻斷試劑中。在代表性的實施方案中，連接基團通常至少約為50道爾頓，通常至少約100道爾頓，可以高達1000道爾頓或更大，例如如果連接基團含有間隔子時可高達1000000道爾頓，但通常不會超過約500道爾頓，通常不會超過300道爾頓。一般而言，該連接子可包括在任一端由反應性官能團封端的間隔基團，所述的反應性官能團能夠共價結合于核酸結構域或蛋白成分。感興趣的間隔基團可以包括脂肪族的和不飽和的烴鏈、含有雜原子如氧(醚如聚乙二醇)或氮(多胺)、肽、碳水化合物、可能含有雜原子的環(huán)狀或非環(huán)狀系統(tǒng)。間隔基團也可由結合于金屬的配體構成，以使存在的金屬離子與兩種或多種配體進行配位以形成復合物。具體的間隔元件包括:1，4-二氨基己烷、二甲苯二胺、對苯二甲酸、3，6-二氧雜辛二酸、乙二胺-N，N- 二乙酸、1，I'-乙烯雙(5-氧-3-吡咯烷羧酸)、4，4/ -乙烯二哌啶?？赡艿姆磻怨倌軋F包括親核官能團(胺、醇、硫醇、酰肼)，親電官能團(醛、酯、乙烯酮、環(huán)氧化合物、異氰酸酯、馬來酰亞胺)，能夠發(fā)生環(huán)加成反應、能夠形成二硫鍵或能夠結合于金屬的官能團。具體實例包括一級和二級胺、異羥肟酸、N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯、氧羰基咪唑、硝基苯基酯、三氟乙酯、縮水甘油醚、乙烯砜和馬來酰亞胺?？捎糜陬}述阻斷試劑的特定連接基團包括雜官能團化合物，如疊氮基苯甲?；ｋ?、N-[4-(對疊氮基水楊基氨基)丁基]-3' _[2'-吡啶基二硫]丙酰胺)、雙-磺基琥珀酰亞胺辛二酸酯、己二亞胺二甲酯(dimethyladipimidate)、雙琥拍酰亞胺酒石酸酯、N-馬來酰亞胺丁?；趸牾啺孵ァ-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]_1，3' -二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯、戊二醛、和琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(3^^)、4-(1馬來酰亞胺基甲基)_環(huán)己烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMCC)等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用于偶聯(lián)非分析物特異性結合蛋白成分和阻斷試劑的核酸結構域的連接子與將鄰位探針(或多個探針)的核酸結構域偶聯(lián)于蛋白質(zhì)分析物結合結構域的連接子相同?？梢允褂萌魏伪憷姆椒ㄖ苽湓陬}述方法中采用的阻斷試劑。然而，在本發(fā)明的一個方面中也提供了用于制備阻斷試劑的方法，其包括:(a)從血液中提取血清蛋白；(b)制備核酸；和( c )將(a )所述的蛋白與(b )所述的核酸偶聯(lián)。所述的血清蛋白、核酸和偶聯(lián)如上所定義。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中，血清蛋白為大批的IgG。因此，在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了包括偶聯(lián)于核酸結構域的大批的IgG的阻斷試劑。更一般而言，可以看出本發(fā)明的該方面提供了包括偶聯(lián)于核酸分子(或供選擇地，核酸結構域)的大批的IgG的綴合物。在進一步優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了包括偶聯(lián)于核酸結構域的白蛋白的阻斷試齊U。更一般而言，可以看出本發(fā)明的該方面提供了包括偶聯(lián)于核酸分子(或供選擇地，核酸結構域)的白蛋白的綴合物。優(yōu)選地，所述的白蛋白為血清白蛋白(例如BSA或HSA等)。在本發(fā)明的這 些方面中，所述的核酸結構域/分子如上所定義。在優(yōu)選的實施方案中(特別地包括上述的本發(fā)明的方面)，核酸包括一個或多個隨機序列的寡核苷酸，即單一隨機生成的寡核苷酸或各自具有不同隨機序列的多個寡核苷酸。因此，本發(fā)明也提供了可通過上述方法已獲得的或可獲得的阻斷試劑，和包括本發(fā)明所述阻斷試劑的且用于檢測樣品中分析物的試劑盒。所述試劑盒可以進一步包括一個或多個鄰位探針，一個或多個用于該方法中的其它寡核苷酸(例如，夾板寡核苷酸、間隔寡核苷酸、和/或可連接的寡核苷酸)和用于影響和/或檢測鄰位探針的相互作用的手段，并且詳細定義如下。術語“檢測”在本文廣泛地使用，以包括測定分析物存在的任何手段(即，其是否存在)，或測量分析物的任意形式。因此“檢測”可以包括以各種方式測定、測量、評估或分析分析物的存在或不存在或量或位置。包括定量和定性測定、測量或評估，包括半定量。該測定、測量或評估可以是相對的，例如當對樣品中兩種或多種不同的分析物進行檢測時，或絕對的。同樣的，當用于定量樣品中靶分析物(或多種分析物)的情況下時，術語“定量”可以指絕對或相對定量。絕對定量可通過包含已知濃度(或多個已知濃度)的一種或多種對照分析物和/或?qū)z測到的靶分析物水平與已知對照分析物進行對比(例如通過生成標準曲線)來實現(xiàn)。供選擇地，相對定量可通過比較兩種或多種不同靶分析物之間的檢測水平或量來實現(xiàn)，以提供兩個或多個不同分析物各自的相對定量，即相對于彼此。“分析物”可以是想要通過本發(fā)明所述方法檢測的任意物質(zhì)(例如分子)或?qū)嶓w。所述分析物為本發(fā)明所述試驗方法的“靶標”。因此分析物可以是想要檢測的任意生物分子或化學化合物，例如肽或蛋白， 或核酸分子或小分子，包括有機和無機分子。所述分析物可以是細胞或微生物，包括病毒或其片段或產(chǎn)物。因此可看出分析物可以是任何物質(zhì)或?qū)嶓w，其中可以形成特異結合配偶體(例如親和結合配偶體)。在基于鄰位探針試驗的情況下，所需要的是分析物能夠同時結合于至少兩個結合配偶體(更具體而言，至少兩個鄰位探針的分析物結合結構域)。在其它基于探針的檢測試驗的情況下，例如免疫PCR、免疫RCA等，分析物能夠結合于至少一個結合配偶體就已足夠。基于探針的檢測試驗，例如基于鄰位探針的試驗，如本發(fā)明所述試驗，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在蛋白或多肽的檢測中有著特定的應用。因此特別感興趣的分析物可以包括蛋白質(zhì)分子如肽、多肽、蛋白或朊病毒或包括蛋白或多肽成分等的任何分子，或其片段。所述分析物可以為單一分子或含有兩個或多個分子亞單元的復合物，所述分子亞單元可以是或不是彼此共價結合的，并且可以為相同或不同。因此除了細胞或微生物之外，該復合分析物也可為蛋白復合物或蛋白相互作用。因此該復合物或相互作用為同或異多聚體。分子聚集物，例如蛋白也可以是靶分析物，例如相同蛋白或不同蛋白的聚集物。所述分析物也可以是蛋白或肽和核酸分子如DNA或RNA之間的復合物。特別感興趣的是蛋白和核酸之間的相互作用，例如，調(diào)節(jié)因子，如轉(zhuǎn)錄因子和DNA或RNA。包括所有生物和臨床樣品,例如,有機體的任意細胞或組織樣品,或來自其的任意體液或標本，以及樣品如細胞培養(yǎng)物、細胞標本、細胞裂解物等。也包括環(huán)境樣品，例如土壤和水樣品或食物樣品?？梢孕迈r制備樣品或可以以任何便利的方式對樣品提前處理以用于例如儲存。因此代表性樣品包括任意可以包含生物分子，或者可以包含任意其他想要的或者靶分析物的材料，其包括例如 食物和關聯(lián)產(chǎn)物、臨床和環(huán)境樣品。樣品可以是生物樣品，其可以包含任意病毒或細胞材料，包括所有原核或真核細胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細胞器。因此該生物材料可以包括所有類型的哺乳動物和非哺乳動物細胞、植物細胞、藻類，所述的藻類包括藍綠藻、真菌、細菌、原生動物等。因此代表性樣品包括全血和血得到的產(chǎn)物如血漿、血清和血沉棕黃色層、血細胞、尿液、糞便、腦脊液或任何其它體液(例如，呼吸系統(tǒng)分泌物、唾液、乳汁等)、組織、活檢切片、細胞培養(yǎng)物、細胞混懸液、條件培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)成分的其它樣品等?？梢砸匀魏伪憷蛐枰姆绞筋A處理樣品以準備用于本發(fā)明所述方法中，例如通過細胞裂解或純化，分離分析物等。用于本發(fā)明所述檢測方法中的探針，例如鄰位探針包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和功能結構域，所述功能結構域優(yōu)選為核酸結構域，但如上所述，在鄰位試驗中使用的一個或多個鄰位探針可以包括不同的官能團如酶。鄰位探針實際上是結合于分析物(通過分析物結合結構域)的檢測探針，可以借助對該結合發(fā)生后在功能(例如核酸)結構域之間發(fā)生的相互作用的檢測來檢測所述結合(以檢測分析物)。其它探針例如免疫PCR或免疫RCA探針可充當檢測探針，檢測其與分析物的結合以檢測分析物的存在。因此，當功能結構域為核酸分子時，探針可視為分析物的核酸標記的親和配體或結合配偶體，其中分析物結合結構域為親和結合配偶體，核酸結構域為核酸標簽。核酸結構域偶聯(lián)于分析物結合結構域并且如上所述的，該“偶聯(lián)”或連接可通過本領域已知的任意手段，可以是需要的或便利的，可以是直接的或間接的，例如通過連接基團。蛋白偶聯(lián)至核酸的方式的實例在上文中有詳細描述。優(yōu)選地，用于偶聯(lián)分析物結合結構域和探針(例如鄰位探針)的核酸結構域的連接子或方式與阻斷試劑的連接子或方式相同。分析物結合結構域可以是靶分析物的任何結合配偶體，并且其可以是直接或間接結合配偶體。因此其可以直接結合于靶分析物，或通過中間分子或結合于靶分析物的結合配偶體間接結合，所述分析物結合結構域結合于所述中間分子(結合配偶體)。特別地，分析物結合結構域或中間結合配偶體為分析物的特異性結合配偶體。結合配偶體為能夠結合于其靶標例如靶分析物的任意分子或?qū)嶓w，以及特異性結合配偶體為能夠特異性結合于其靶標(例如靶分析物)的配偶體，即結合配偶體以比樣品中的其它成分更高的親和力和/或特異性結合于靶標(例如分析 物)。因此與靶分析物的結合可以區(qū)別于非靶分析物；特異性結合配偶體不與非靶分析物結合或以可忽略的或不可檢測的或任意該非特異性結合的方式結合，如果發(fā)生了則可以區(qū)分。靶分析物及其結合配偶體之間的結合通常是非共價的。可以選擇分析物結合結構域以對靶分析物具有較高的結合親和力。較高的結合親和力是指結合親和力至少為約10_4m，通常至少約10_6M或更高，例如10_9M或更高。當作為鄰位探針的一部分存在時，分析物結合結構域可以是任意多種不同類型的分子，只要其對靶蛋白顯示所需的結合親和力。在其它實施方案中，分析物結合結構域可以是配體，所述配體對其靶分析物具有中等或甚至較低的親和力，例如低于約10_4m。在本發(fā)明的檢測方法中，至少一種探針例如鄰位探針(但是優(yōu)選至少兩個，更優(yōu)選所有鄰位探針)的分析物結合結構域為蛋白質(zhì)分子。因此，分析物結合結構域可以是小肽分子或較大的多肽或蛋白。肽的大小可以例如為約5至約100個氨基酸殘基，通常為約5至約50個殘基，更通常為約10個至約30個殘基。大的多肽或蛋白是指大小為約100個氨基酸殘基或更大的分子。作為分析物結合結構域而受到特別關注的是抗體，以及其結合片段和衍生物或模擬物。當抗體為分析物結合結構域時，它們可以來自多克隆成分以使通過特異性區(qū)分的抗體的異種群體均“標記”相同的標記核酸(核酸結構域)，或來自單克隆成分，其中對靶分析物具有相同特異性的相同抗體的同種群體均標記相同的核酸。同樣地,分析物結合結構域可以是單克隆或多克隆抗體。在其它實施方案中，親和結合結構域為抗體片段或其衍生物或模擬物，其中這些片段、衍生物和模擬物對靶分析物具有所需的結合親和力?？贵w、抗體片段、其模擬物和衍生物的實例如上所述，并且本發(fā)明考慮所述親和結合結構域可以是任意類型的這些分子，只要它們對靶分析物具有所需的結合親和力。重要的，分析物結合結構域可以是一種結構域，其包括能夠共價連接于核酸結構域而不實質(zhì)消除分析物結合結構域?qū)ζ潇敕治鑫锏慕Y合親和力的部分。在本發(fā)明所述方法的一個實施方式中，探針(例如鄰位探針)可以是多價(鄰位)探針。該多價(鄰位)探針包括至少兩個，但多至100個分析物結合結構域,所述分析物結合結構域與至少一個，以及優(yōu)選地多于一個核酸(或多個核酸)綴合。在部件中針對各自鄰位探針的分析物結合結構域的分析物上的結合位點可以是相同或不同的。因此，例如在包含兩個或多個相同亞單元或蛋白成分的同數(shù)蛋白復合物或聚集物的情況下，兩個或多個探針的分析物結合結構域可以是相同的。當分析物為單一分子或包括不同亞單元或成分時(例如不同蛋白的同數(shù)復合物或聚集物)，分析物結合結構域可以是不同的。由于可以構建鄰位探針的核酸結構域的長度以跨越不同分子距離，因此針對分析物結合結構域的分析物上的結合位點不需在相同的分子上。它們可以在獨立的但緊密放置的分子上。例如可以通過本發(fā)明所述方法靶向有機體如細菌或細胞或病毒的，或蛋白復合物的或相互作用的多個結合結構域。如上所述，分析物結合結構域可以直接或間接地結合于分析物。在直接結合的情況下，靶分析物可以首先被特異性結合配偶體(或親和配體)結合，并且探針例如鄰位探針的分析物結合結構域可以結合于特異結合配偶體。這使得能夠設計作為通用試劑的探針(例如鄰位探針)。例如分析物特異性結合配偶體可以是抗體和通用探針，例如鄰位探針，可以通過部件結合于各種不同分析物特異性抗體的Fe區(qū)域，使用部件來檢測不同分析物。探針例如鄰位探針的核酸結構域可以被認為是核酸“標簽”，所述核酸“標簽”可以被檢測，或在鄰位探針相互作用形成可檢測產(chǎn)物的情況下可以檢測到以報告分析物的檢測。因此核酸結構域可以被認為是反應性核酸官能團，所述官能團可以直接或間接提供，或所述官能團可以相互作用而提供信號，借助所述信號來檢測分析物(例如形成產(chǎn)生信號的產(chǎn)物(例如它們可以連接到一起從而形成連接產(chǎn)物，或可以允許延伸產(chǎn)物，例如如上詳述的延伸產(chǎn)物的形成)或介導產(chǎn)生信號的產(chǎn)物的形成或促進其形成，例如作為連接或延伸模板和/或引物，例如作為RCA引物)。換言之，可以認為核酸結構域是“檢測標簽”，所述“檢測標簽”可以被檢測到或可相互作用而形成“可檢測的”標簽或產(chǎn)物。當兩個或多個分析物存在于相同樣品中時，可以使用兩個或多個探針或鄰位探針組同時檢測，其中設計每組鄰位探針以通過相互作用形成獨特的核酸序列“可檢測的標簽”?？梢允褂梦墨I中熟知的方法對這些獨特的“可檢測的標簽”分別進行檢測和定量(任選地在擴增之后)，包括液相色譜法、電泳法、質(zhì)譜法、DNA陣列技術和多色實時PCR。如上所述，現(xiàn)有技術很好地描述了基于檢測試驗的鄰位探針，例如W097/00446、W001/61037, W003/04423U W02005/123 963 和 W02007/107743，將其引入本文作為參考。本領域也已知并描述了其它鄰位試驗，例如在W02007/044903和W02009/012220中，也將其引入本文作為參考。因此明顯的是，只要那些方法延伸至利用蛋白質(zhì)鄰位探針的基于鄰位探針的檢測試驗，那么技術人員就能夠使用本領域公開的方法來修改本文所述的檢測方法。然而，本發(fā)明所述檢測方法的特別優(yōu)選的方面詳細解釋如下。在一個優(yōu)選的本發(fā)明所述的檢測方法中，第一和第二鄰位探針的核酸結構域可以互相接合，例如通過連接。該“結合”(或“綴合”)可以是直接的，即各核酸結構域可以直接互相結合，或其可以是間接的，即各核酸結構域可以間接接合，例如通過分別與另一個中間核酸分子(例如，“間隔”寡核苷酸，在本領域也稱為“盒式”寡核苷酸)的兩端接合。該“綴合”或“相互作用”(通常為連接)可以通過一個或多個夾板寡核苷酸介導。同樣地，可以將夾板或間隔/盒式寡核苷酸以獨立核酸的形式加入樣品中，或可作為如下進一步解釋的第三鄰位探針的核酸結構域提供。在新核酸分子或序列形成時的相互作用(通過連接)結果可以檢測到。如上所述以及以下進一步討論，夾板寡核苷酸可以雜交于第一和第二鄰位探針的核酸結構域，從而使其能夠連接。鄰位探針的核酸結構域可以是單鏈核酸分子(例如寡核苷酸)、部分雙鏈和部分單鏈分子、或雙鏈分子，所述雙鏈分子包括雙鏈區(qū)域以及兩條核酸鏈不互補而成為單鏈的區(qū)域。同樣，在某些實施方案中，核酸結構域由單鏈核酸構成。在其它實施方案中，核酸結構域可由兩條部分互補的核酸鏈構成，其中兩條鏈包括雜交區(qū)域和非雜交區(qū)域。當與靶分析物結合時，鄰位探針的核酸結構域的長度通常足夠允許發(fā)生與另一個鄰位探針的核酸結構域的夾板介導的相互作用。核酸結構域的長度通常為約8至高達約1000個核苷酸，其中在某些實施方案中它們的長度為約8至約500個核苷酸，包括長度為約8至約250個核苷酸，例如長度為約8個至約160個核苷酸，如長度為約12至約150個核苷酸，長度為約14至約130個核苷酸，長度為約16至約110個核苷酸，長度為約8至約90個核苷酸，長度為約12至約80個核苷酸，長度為約14至約75個核苷酸，長度為約16至約70個核苷酸，長度為約16至約60個核苷酸等。在某些代表性實施方案中，核酸結構域的長度可為約10至約80個核苷酸，長度可為約12至約75個核苷酸，長度可為約14至約70個核苷酸，長度可為約34至約60個核苷酸，以及在所述范圍之間的任意長度。在某些實施方案中，核酸結構域的長度通常不多于約28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、44、46、50、55、60、65 或 70 個核苷酸。鄰位探針的核酸結構域可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成核苷酸殘基構成，所述的合成核苷酸殘基是能夠參與沃森-克里克類型或類似堿基對相互作用的。因此，核酸結構域可以是DNA或RNA或其任意修飾物，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。可以根據(jù)夾板挑選或選擇第一和第二鄰位探針的核酸結構域的序列(S卩，“檢測”核酸結構域)，所述夾板提供于第三鄰位探針上。因此，該序列不是關鍵的，只要第一和第二結構域可以雜交于第三結構域(夾板)。然而，應選擇序列以避免除了在第一和第二鄰位探針的核酸結構域和夾板(或多個夾板)的核酸結構域之間以外發(fā)生的雜交事件。例如，鄰位探針的核酸應該不能雜交于阻斷試劑的核酸結構域，或如果存在，間隔/盒式寡核苷酸的核酸結構域。一旦選擇或確定了核酸結構域的序列，可使用任何便利的方法合成該核酸結構域。 探針例如鄰位探針的兩種成分通過鍵連接到一起，或通過連接基團間接連接。可以使用如上述用于偶聯(lián)阻斷試劑的核酸結構域和蛋白成分的，上文所描述的方法和連接子，將核酸結構域偶聯(lián)于探針，例如鄰位探針。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，使用相同的連接子作為阻斷試劑將探針例如鄰位探針的核酸結構域偶聯(lián)于分析物結合結構域。在題述方法中采用的探針例如鄰位探針和阻斷試劑可以使用任何便利的方法制備。在代表性實施方案中，核酸結構域可以綴合于分析物結合結構域，所述的綴合是直接的或通過連接基團的。如本領域已知的，成分可以通過官能團互相共價結合，其中該官能團可以存在于成分上或使用一個或多個步驟引入成分中，例如氧化反應、還原反應、裂解反應等。用于共價鍵合成分以制備探針例如鄰位探針的官能團包括:羥基、巰基、氨基等?？梢赃x擇經(jīng)過修飾以提供共價鍵的不同成分的特定部分以便于不實質(zhì)性地不利地干擾成分對靶分析物的結合親和力。換言之，共價鍵不應抑制探針例如鄰位探針與分析物的結合，并且不應促進阻斷試劑結合于靶分析物。必要和/或需要時，可以使用本領域已知的阻斷基團保護成分上的某些部分，參見例如Green&Wuts, Protective Groups in OrganicSynthesisQohn ffiley&Sons) (1991)。本領域技術人員熟知用于制備核酸/抗體綴合物的方法。參見例如第5，733，523號美國專利，將其公開的內(nèi)容引入本文作為參考。在其它實施方案中，可以使用體外方案制備探針例如鄰位探針和阻斷試劑，產(chǎn)生核酸-蛋白綴合物，即分子具有共價結合于蛋白的核酸例如編碼序列，即其中由編碼探針例如鄰位探針的載體在體外制備分析物結合結構域或蛋白成分。感興趣的該體外方案的實例包括:基于 RepA 的方案(參見例如，F(xiàn)itzgerald, Drug Discov.Today (2000) 5:253-258和W098/37186),基于核糖體呈現(xiàn)(display)的方案(參見例如Hanes等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA (1997) 94:4937-42;Roberts,Curr Opin Chem Biol (1999)Jun;3:268-73;Schaffitzel 等人，J Tmmunol Methods(1999)DeclO;231:119-35;和W098/54312)等。夾板可視為“連接子”寡核苷酸，其用于連接或?qū)⒌谝缓偷诙徫惶结樀暮怂峤Y構域“保持在一起”以使其可以相互作用，例如可以連接在一起。特別地，夾板可以 與第一和第二鄰位探針的核酸結構域雜交。更特別地，夾板與至少第一和第二鄰位探針的核酸結構域同時雜交(退火)。當夾板為第三鄰位探針的核酸結構域的形式時，所有鄰位探針組的核酸結構域的互相雜交在結合于靶分析物后提高探針-靶標復合物的活動性。該活動性作用通過支持產(chǎn)生信號的鄰位探針-靶分析物復合物的形成而有助于試驗的靈敏度。本文所使用的術語“雜交(hybridisation)”或“雜交(hybridises)”是指在核苷酸序列之間雙鏈的形成，其足夠互補以通過沃森-克里克堿基配對形成雙鏈。當分子具有堿基對組織的相似性時，兩個核苷酸序列互相“互補”?！盎パa的”核苷酸序列可以特異性地結合以在適當?shù)碾s交條件下形成穩(wěn)定的雙鏈。例如，當?shù)谝恍蛄械囊徊糠帜軌蛞苑聪蚱叫械姆较蚪Y合于第二序列的一部分時，兩個序列是互補的，其中每個序列的3’端結合于其它序列的5'端，并且一個序列的每個A、T (U)、G和C分別與另一個序列的T (U)、A、C和G對準。RNA序列也可包括互補的G=U或U=G堿基對。因此在本發(fā)明中，兩個序列不需要具有完美的“互補性”。通常當至少約85% (優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約95%)的核苷酸在確定長度的分子內(nèi)共享堿基配對結構時，兩個序列具有足夠的互補性。因此第一和第二鄰位探針的核酸結構域含有對夾板寡核苷酸互補的區(qū)域，相反地，夾板寡核苷酸的核酸結構域包含對第一和第二鄰位探針的每個核酸結構域互補的區(qū)域?；パa的區(qū)域(B卩，雜交區(qū)域)的長度可以為4-30bp，例如6-20、6-18、7-15或8_12bp0夾板核酸結構域的長度通常足以提供上述第一和第二探針的核酸結構域的同時結合。在代表性實施方案中，夾板寡核苷酸的長度為約6至約500個核苷酸，包括約20至約40個寡核苷酸，例如約25至約30個寡核苷酸。如上所述，在上述的優(yōu)選的代表性實施方案中，第一和第二鄰位探針的核酸結構域之間的相互作用為各自結構域的連接。該連接可以優(yōu)選為連接，特別是模板引導的連接。在該情況下，應明確理解連接模板由夾板提供?？梢允褂眠B接酶進行該連接。因此，在本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實施方案中，第一和第二探針的核酸結構域可借助雜交夾板作為模板的反應來連接，其中所述核酸結構域連接并且可檢測到連接產(chǎn)物。因此在該實施方案中，夾板可視為“夾板模板”或“連接模板”或“模板寡核苷酸”。為了使相互作用，或更具體地連接發(fā)生，第一和第二鄰位探針的核酸結構域之一通常可通過其5'端偶聯(lián)于蛋白質(zhì)分析物結合結構域(留下游離的3'羥基端)，而另一個結構域可以通過其3'端偶聯(lián)(留下游離的5'磷酸酯端)。因此第一和第二鄰位探針之一可以是具有游離3'羥基端的5'探針，所述游離3'羥基端能夠與另一個3'探針的5'磷酸酯端相互作用。為了能夠連接，第一和第二核酸結構域分別雜交于夾板，一個的3'端對準另一個的5'磷酸酯端。然而，如上所述并且如以下更加詳細的描述的是，各自結構域的連接不需要是直接的，它們可借助中間寡核苷酸連接在一起，或可以使用聚合酶延伸第一或第二鄰位探針中的攜帶游離3'核酸結構域末端的任一個以填充間隔，直到第一和第二核酸結構域可以通過連接反應連接。因此， 夾板(模板)上的各自的3'端和5'端不需互相緊鄰地雜交，但可以雜交于夾板并在其中留下空間(或一段核苷酸)。夾板同時與第一和第二鄰位的雜交產(chǎn)生穩(wěn)定的雙鏈結構，所述雙鏈結構含有所有三個核酸結構域。該雙鏈結構使第一鄰位探針的核酸結構域的3'羥基游離端和第二鄰位探針的核酸結構域的5'磷?；坞x端結合在一起(雖然如上所述，但這些不需要緊鄰地并列放置)。因此，可以包括對5'游離鄰位探針的核酸結構域具有互補性的第一 3'區(qū)域和對3'游離鄰位探針的核酸結構域具有互補性的第二 5'區(qū)域。夾板的第一和第二區(qū)域長度可以為3至20、6至17、6至15或6至12或8至12個核苷酸，例如長度為約13至17、12至16、11至15、或12至14個核苷酸或長度為約6至12、7至11或8至10個核苷酸。如以下更加詳細的描述的，相互作用(例如連接)產(chǎn)物的擴增可用作檢測過程的一部分。因此，在某些實施方案中需要設計夾板以便于將在該步驟中可能發(fā)生的任何錯誤擴增最小化，例如夾板充當擴增中使用的聚合酶的模板的可能性。因此例如夾板可以作為RNA寡核苷酸或DNA/RNA雜交體來提供；通常用于擴增反應中的Taq聚合酶不能使用RNA模板。供選擇地，使用具有兩個端雜交區(qū)域的DNA夾板可以達到相似效果；由于雜交較弱，該夾板不能在PCR使用的高溫下為DNA聚合作為模板。如上所述的，在一個實施方案中，第一和第二探針的核酸結構域可以雜交于互相不緊鄰的夾板，而在其間留出間隔。為了使其能夠綴合于(例如連接)本文稱為“間隔”或“盒式”寡核苷酸的另一個寡核苷酸，可以雜交于該間隔中的夾板，更具體地，跨過該間隔。該間隔/合適寡核苷酸可以直接雜交于其每個末端，所述末端與每個各自結構域的末端鄰近，以使每個該結構域末端可以連接于間隔/盒式寡核苷酸以形成單一的新核酸產(chǎn)物。這需要兩個連接事件，所述兩個連接事件以夾板作為模板。間隔/盒式寡核苷酸的5'和3'端以適當?shù)姆绞浇雍?連接)于第一和第二探針的核酸結構域的游離末端。因此通過間隔/盒式寡核苷酸連接或接合第一和第二結構域。該排列使探針的核酸結構域的柔軟度增加。間隔/盒式寡核苷酸的長度(當雜交于夾板時第一和第二結構域的末端之間的間隔)可以不同，例如為 4 至 50，例如 6-30、6-25、6-22、8-22、10-22、6-20、8-20、10-20 個核苷酸。間隔/盒式寡核苷酸在第一和第二核酸結構域的連接中充當中間寡核苷酸，在探針與樣品接觸后可以將所述間隔/盒式寡核苷酸加入。供選擇地，可以在相同時間將其加入，或可以將其預雜交至夾板寡核苷酸。也可以使用聚合酶，通過延伸攜帶3'端的第一或第二鄰位探針的任何一個游離核酸結構域來填充間隔。一旦填充了間隔，就通過連接步驟連接末端。為了實施本發(fā) 明所述的方法，優(yōu)選地在與至少一組探針接觸之前將樣品與阻斷試劑接觸。在某些實施方案中，可以針對兩種或多種不同的靶分析物對樣品進行試驗。在該實施方案中，將樣品與一組探針接觸，一個探針針對一個祀分析物，或更優(yōu)選地一組鄰位探針針對一個靶分析物，以使接觸樣品的探針或探針組的數(shù)量可以為兩個或多個，例如三個或多個、四個或多個等。該方法在多重和高通量應用中有著特別的用途?？梢赃x擇加入樣品中的鄰位探針的量以在反應混合物種提供足夠低濃度的鄰位探針，從而確保鄰位探針在未結合于靶分析物時不會隨機地互相緊密鄰近，至少不以任何較大或很大的程度。同樣地，希望的是僅當鄰位探針通過鄰位探針的分析物結合結構域之間的結合相互作用和分析物的結合位點結合于分析物時，鄰位探針才會互相緊密鄰近。在代表性實施方案中，在與樣品組合后的反應混合物中的鄰位探針的濃度為約IfM至ΙμΜ，如約IpM至約InM,包括約IpM至約ΙΟΟηΜ。在與樣品組合后，阻斷試劑和探針組(或多個探針組)，例如鄰位探針，可以將反應混合物孵育一段時間，如果存在于樣品中，所述時間足夠使探針例如鄰位探針結合于靶分析物。優(yōu)選地在加入探針例如鄰位探針之前將樣品與阻斷試劑接觸。在代表性的實施方案中，阻斷試劑和樣品可以在加入探針如鄰位探針之前預孵育一段時間，所述時間為5分鐘至約24小時。優(yōu)選地，在溫度為4至約50° C下，優(yōu)選地在室溫下例如18-30° C下，所述預孵育為約20分鐘至約12小時。在預孵育后，如果包括該步驟，產(chǎn)物混合物可以在約4至約50° C下，包括約20至約37° C下孵育一段時間，所述時間為約5分鐘至約48小時，包括約30分鐘至約12小時。應優(yōu)化維持的反應混合物以促進探針例如鄰位探針特異性結合于分析物，同時抑制非特異性相互作用。條件也應允許在上述核酸結構域之間的有效的和特異性雜交。在某些實施方案中，孵育混合物的有效體積至少在孵育步驟的部分降低，在此步驟中探針例如鄰位探針結合于靶分析物，如果靶分析物存在于樣品中的話。在這些實施方案中，孵育混合物的有效體積由于許多不同原因而降低。在某些實施方案中，降低孵育混合物的有效體積以使得能使用中等和低親和性的分析物結合結構域和/或提高試驗的靈敏度。例如，在孵育混合物的有效量降低的某些實施方案中，分析物結合結構域可以是中等或低親和性的結合物，所述中等或低親和性的結合物是指分析物結合結構域?qū)ζ浒蟹治鑫锏慕Y合親和力小于約10_4M，如約lmMKd。在某些實施方案中，可以升高試驗靈敏度以使試驗能夠在I μ I樣品中檢測到低至約100個或更少的靶分析物，包括在I μ I樣品中低至約75個或更少的靶分析物，包括在I μ I樣品中低至約50個或更少的靶分析物。在某些實施方案中，在上述孵育步驟過程中在混合物中包括“聚集劑(crowdingagent)”或“體積排斥劑(volume excluder)”,例如在鄰位探針與其祀分析物結合的過程中降低孵育混合物的有效體積。通常，“聚集劑”是水溶性大分子材料。合適的大分子材料廣泛地包括平均分子量為約1500至數(shù)百萬的生物相容的天然或合成聚合物，所述聚合物不與混合物中的其它試劑或產(chǎn)物發(fā)生特異性相互作用。本領域?qū)⒃摼酆衔锓Q為“體積排斥劑”，由于其主要功能是在體外反應介質(zhì)中占據(jù)體積，并為生物化學反應提供高濃度的環(huán)境，例如，接近體內(nèi)條件。體積排斥劑聚合物當然必須足夠可溶以提供所需濃度。合適的典型聚合物包括但不限于:市售聚乙二醇(PEG)聚合物，例如平均分子量高于約2000的；FIC0LL聚合物，如平均分子量為約70，000的那些；牛血漿白蛋白；糖原；聚乙烯吡咯烷酮；葡聚糖等。在代表性實施方案中采用更高分子量的PEG聚合物，尤其是分子量分別為約1450、3000-3700,6000-7500 和 15，000-20，000 的 PEG1450、PEG3350、PEG6000 (也作為 PEG8000出售)，和PEG20，000。在代表性實施方案中采用PEG6000和PEG8000。根據(jù)聚合物類型及其分子量，在代表性實施方式中的孵育反應中體積排斥劑聚合物的濃度落入約5%w/v至約45%w/v。通常， 預期給定類型的更高分子量的聚合物需要以比更低分子量的聚合物類型更低的濃度存在，以實現(xiàn)對酶活性相同的效果。在采用體積排斥劑的那些實施方案中，在方法的下一步之前，由于解釋體積排斥劑的存在可以根據(jù)所存在的體積排斥劑的量、稀釋流體的性質(zhì)等稀釋孵育混合物，例如稀釋至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括至少約10倍或更多，其中在代表性實施方案中所述的稀釋流體為水或某些其它合適的水和一種或多種溶質(zhì)例如鹽、緩沖劑等的水性流體。替代地或除了使用體積排斥劑外，通過例如蒸發(fā)從孵育混合物中除去部分水，可以降低孵育過程中的孵育混合物的體積。在這些實施方式中，流體體積可以依照所需降低至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括至少約10倍或更多。重要的，在這些實施方案中不是將所有水從孵育混合物中除去?？梢圆捎萌魏伪憷姆桨竿ㄟ^從中除去一部分水來降低孵育混合物的體積?？梢圆捎猛ㄟ^監(jiān)測和調(diào)整濕度和溫度的用于控制蒸發(fā)速率的工具，其中在某些實施方案中例如通過持續(xù)測量孵育混合物的體積來監(jiān)測孵育混合物的體積，其中當適當蒸發(fā)后，可以如上所述加入連接和PCR混合物。根據(jù)需要，可以使用加熱器來加快蒸發(fā)。供選擇地，孵化混合物的體積可以通過濾出水來降低。在代表性實施方案中，體積排阻濾器用于選擇性地保留尺寸大于臨界值的分子，同時通過使小分子和水通過濾器而將其除去?？梢酝ㄟ^離心或真空抽吸對溶液施加力而使其通過濾器移動。當鄰位探針的結合結構域與分析物結合后，鄰位探針的合適結構域互相緊密鄰近。因此，如果使用夾板寡核苷酸，則能夠結合(雜交)于第一和第二探針的核酸結構域。在樣品與阻斷試劑和鄰位探針組合后，如果使用的話，可以加入間隔/盒式寡核苷酸并使其雜交?？梢噪s交于夾板的第一和第二探針的核酸結構域隨后可以通過第一和第二鄰位探針的核酸結構域的游離3'羥基和5'磷酸酯末端的核酸連接相互連接。然后檢測反應混合物中相互作用的存在。因此，通常通過檢測其連接產(chǎn)物來檢測第一和第二核酸結構域的連接。通常，可以采用任何能夠檢測鄰位依賴性相互作用的存在的便利方案。檢測方案可以需要或不需要分離步驟。在這些代表性實施方案中，通過與例如由合適的核酸連接酶提供的具有核酸連接活性的反應混合物接觸來實現(xiàn)穩(wěn)定第一和第二鄰位探針的核酸結構域的夾板的連接，并將混合物維持在足以發(fā)生核酸結構域的連接的條件下。如本領域已知的，當兩個緊鄰的核酸退火并雜交于與其互補的第三核酸序列(SP，模板)時，連接酶催化該兩個緊鄰的核酸的并列3'-羥基和5'-磷酸末端之間的二酯鍵的形成。可以采用任何便利的連接酶，其中感興趣的代表性連接酶包括但不限于:溫度敏感性的和熱穩(wěn)定連接酶。溫度敏感性的連接酶包括但不限于噬菌體T4DNA連接酶、噬菌體T7DNA連接酶和大腸桿菌(E.coli)連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶包括但不限于Taq連接酶、Tth連接酶和Pfu連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶可以由嗜熱性或極端嗜熱性有機體獲得，所述有機體包括但不限于原核、真核或古微生物。在本發(fā)明所述方法中也可采用某些RNA連接酶。在該連接步驟中，必要和/或所需的合適的連接酶和任何試劑與反應混合物組合，并保持在足夠發(fā)生雜交的連接寡核苷酸的連接的條件下。本領域技術人員熟知連接反應條件。在連接過程中，在某些實施方案中將反應混合物保持在約4° C至約50° C的溫度下，如約20° C至約37° C下一段時間，所述時間為約5秒至約16小時，如約I分鐘至約I小時。在又一個實施方案中，可以將反應混合物維持在約35° C至約45° C的溫度下，例如在或約37° C至約42° C，例如在或約38° C、39° C、40° C或41° C下一段時間，所述時間為約5秒至約16小時，如約I分鐘至約I小時，包括約2分鐘至約8小時。在一個代表性實施方案中，連 接反應混合物包括50mM Tris pH7.5U0mM MgCl2UOmM DTTUmM ATP、25mg/ml BSA、0.25單位/mlRNA酶抑制劑、和0.125單位/ml的T4DNA連接酶。在又一個代表性實施方案中，采用2.125mM鎂離子、0.2單位/mlRNA酶抑制劑；和0.125單位/mlDNA連接酶。連接后，檢測連接產(chǎn)物(第一和第二探針的連接的核酸結構域)作為樣品中分析物存在的指示，或作為量和任選的位置的測量。在這些實施方案中，連接產(chǎn)物包括在分析物結合結構域的每個末端處終止的單鏈核酸分子(其為第一和第二探針的兩個鄰近核酸結構域的連接產(chǎn)物，以及任意中間間隔/盒式寡核苷酸，如果使用的話)。連接步驟之后此方法的下一個步驟是測定連接產(chǎn)物在反應混合物中的存在以檢測樣品中的靶分析物。換言之，針對任何所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的存在對反應混合物進行篩選等(即，試驗、評估、評價、測試等)以檢測所試驗的樣品中靶分析物的存在。如上所述，在鄰位試驗的供選擇的實施方案中，鄰位探針的核酸結構域的相互作用的產(chǎn)物可以是延伸產(chǎn)物，例如其中至少一個鄰位探針的核酸結構域發(fā)生延伸(例如使用其它核酸結構域作為延伸模板)，或其中探針的核酸結構域雜交到普通的加入的寡核苷酸(例如加入的雜交模板，所述雜交模板可以預雜交于核酸結構域之一)，并且分別使用所加入的寡核苷酸或核酸結構域作為延伸模板，可以延伸至少一個核酸結構域和/或所加入的寡核苷酸?？梢詸z測該延伸，所述檢測類似于本文所述的連接產(chǎn)物的檢測。
在最廣泛的意義中，可以使用任何便利的方案檢測由上述方法產(chǎn)生的相互作用產(chǎn)物例如連接產(chǎn)物或延伸產(chǎn)物。特定的檢測方案可以根據(jù)所需的靈敏度和實施方法的應用而有所不同。在某些實施方案中，可以直接檢測核酸連接或延伸產(chǎn)物而不進行任何擴增，而在其它實施方案中檢測方案可以包括擴增部分，其中連接或延伸產(chǎn)物核酸的拷貝數(shù)增加，以例如提高特定試驗的靈敏度。當可以不擴增進行檢測時，可以按照許多不同的方式檢測核酸連接或延伸產(chǎn)物。例如，可以直接標記一個或多個鄰位探針的核酸結構域，所述的標記例如熒光標記、或分光光度標記、或放射性同位素標記或使用任何產(chǎn)生信號的標記物，以使連接產(chǎn)物直接標記。在這些實施方案中，可以按照大小將直接標記連接產(chǎn)物從剩余的反應混合物中分離，包括未連接的直接標記的連接寡核苷酸(即，核酸結構域寡核苷酸或盒式寡核苷酸)，以檢測連接核酸。供選擇地，構象選擇性探針，例如可以采用分子信標(beacon)(如以下更加詳細的描述的)檢測連接產(chǎn)物的出現(xiàn)，其中這些探針連接于跨過連接的核酸的序列，因此僅以其整體存在于連接產(chǎn)物中。可以類似地檢測延伸產(chǎn)物，例如使用設計用于結合于延伸產(chǎn)物的探針，或通過摻入標記的核苷酸的探針等。如上所述，在題述方法的某些實施方案中，檢測步驟包括擴增步驟，其中連接或延伸核酸的拷貝數(shù)增加，例如為了提高實驗的靈敏度。根據(jù)需要，擴增可以是線性的或指數(shù)的，其中感興趣的代表性擴增方案包括但不限于:聚合酶鏈反應(PCR);恒溫擴增等。當檢測步驟包括擴增步驟時(更具體地綴合產(chǎn)物的體外擴增步驟)，可以檢測到擴增產(chǎn)物(或擴增產(chǎn)物)以檢測分析物。本領域熟知聚合酶鏈反應(PCR)，在第4，683，202號、第4，683，195號、第4，800，159號、第4，965，188號和第5，512，462號美國專利中有所描述，將其公開引入本文作為參考。在代表性的PCR擴增反應中，將包括上述連接核酸或連接產(chǎn)物或延伸產(chǎn)物(也將其視為擴增反應中的模板核酸)的反應混合物與在引物延伸反應例如PCR弓丨物中采用的一種或多種引物組合(如在幾何(或指數(shù))擴增中采用的正向和反向引物，或在線性擴增中采用的單一引物)。模板核酸(為了方便以下稱為模板DNA)所接觸的寡核苷酸引物應具有足夠的長度以在退火條件下(以下更加詳細地描述)提供與互補模板DNA的雜交。引物的長度通常為至少10bp，長度通常為至少15bp，長度更通常為至少16bp，長度可以長至30bp或 更長，其中引物的長度通常為18至50bp，長度通常為約20至35bp。模板DNA可以接觸單一引物或一組兩個引物(正向和反向引物)，想要模板DNA的線性或指數(shù)擴增，取決于引物是否擴增。除了上述成分，題述方法中制備的反應混合物通常包括聚合酶和三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)。所需聚合酶活性可通過一種或多種不同的聚合酶提供。在許多實施方案中，反應混合物包括至少家族A聚合酶，其中感興趣的代表性家族A聚合酶包括但不限于:棲熱水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶,其包括天然存在的聚合酶(Taq)及其衍生物和同源物，如 Klentaq (如 Barnes 等,Proc.Natl.Acad.SciUSA(1994) 91:2216-2220 所描述)；嗜熱菌(Thermus thermophilus)聚合酶,其包括天然存在的聚合酶(Tth)及其衍生物和同源物等。在高保真反應中實施擴增反應的某些實施方案中，反應混合物可以進一步包括具有
-5'外切酶活性的聚合酶，例如由家族B聚合酶所提供的，其中感興趣的家族B聚合酶包括但不限于:嗜熱高溫球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent),如Perler等A , Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1992) 89:5577-5581 所描述的，火球菌屬(Pyrococcus)物種GB-D (Deep Vent);強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus) DNA 聚合酶(Pfu),如 Lundberg等人，Gene (1991) 108:1-6所描述的,焦酹熱球菌(Pyrococcus woesei) (Pwo)等。其中反應混合物包括家族A和家族B聚合酶，家族A聚合酶可以按照多于家族B聚合酶的量存在于反應混合物中，其中活性的差異通常為至少10倍，更通常為至少約100倍。通常反應混合物會包括四種不同類型的dNTP，其對應于四種天然存在的堿基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在題述方法中，每種dNTP通常以約10至5000 μ M的量存在，通常為約20至1000 μ Μ。在題述方法的該檢測步驟中制備的反應混合物可以進一步包括水性緩沖介質(zhì)，所述緩沖介質(zhì)包括單價離子源、二價陽離子源和緩沖劑?？刹捎脝蝺r離子的任何便利的來源，如KCl、K-醋酸鹽、NH4-醋酸鹽、K-谷氨酸鹽、NH4C1、硫酸銨等。二價陽離子可以是鎂、錳、鋅等，其中陽離子通常為鎂?？刹捎面V離子的任何便利來源，包括MgCl2、Mg-醋酸鹽等。存在于緩沖液中的Mg2+的量可以為0.5至10mM，但優(yōu)選地為約3至6mM，理想地為約5mM。存在于緩沖液中的代表性的緩沖劑或鹽包括Tris、TriCine、HEPES、MOPS等，其中緩沖劑的量通常為約5至150mM，通常為約10至IOOmM,更通常為約20至50mM，其中在某些優(yōu)選的實施方案中緩沖劑存在的量足以提供約6.0至9.5的pH，其中最優(yōu)選的是在72° C下pH為
7.3。存在于緩沖介質(zhì)中的其它試劑包括螯合劑，如EDTA、EGTA等。在制備題述方法的該步驟的反應混合物時，各種組成成分可以以任何便利的順序組合。例如，緩沖液可以與引物、聚合酶、然后與模板DNA組合，或所有的各種組成成分可以同時組合以產(chǎn)生反應混合物。可以使用任何便利的方案檢測擴增反應的擴增產(chǎn)物，只要其中所采用的特定方案可以非特異性地或特異性地檢測擴增產(chǎn)物，如下文更加詳細地描述的。感興趣的代表性的非特異性檢測方案包括采用信號生成系統(tǒng)的方案，所述信號生成系統(tǒng)例如通過相互作用選擇性地檢測雙鏈DNA產(chǎn)物。在該實施方案中使用的代表性的可檢測分子包括熒光核酸染色劑，如溴乙啡啶染料，包括其單體或同或異二聚體，當與核酸復合時熒光增強。溴乙啡啶染料的實例包括乙啡啶同二聚體、溴化乙錠、碘化丙啶、和其它烷基取代的溴乙啡啶染料。在本發(fā)明的另一個實施方案中，核酸染色劑為或包含了吖啶染料、或其同或異二聚體，如吖啶橙、吖啶同二聚體、乙啡啶-吖啶異二聚體、或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本發(fā)明的另一個實施方案中，核酸染色劑為吲哚或咪唑染料，如Hoechst33258、Hoechst33342、Hoechst34580 (B10PR0BES34, Molecular Probes, Inc.Eugene, Oreg., (May2000)) DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI (4'，6-( 二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允許使用的合適染色劑包括但不限于7-氨基放線菌素D、羥基二脒替、LDS751、選擇的補骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金屬復合物如釕復合物、和過渡金屬復合物(例如摻入Tb3+和Eu3+)。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸染色劑為青色素染料或青色素染料的同或異二聚體，當與核酸連接時熒光增強?？梢允褂肔ee的第4，883，867號(1989)、Yue等人的第5，582,977號(1996)、Yue等人的第5，321，130號(1994)、和Yue等人的第5，410，030號(1995)美國專利申請中所述的任意染料，將所有四篇專利引入本文作為參考，包括來自 Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg 的商標為 Τ0Τ0、Β0Β0、P0P0> Υ0Υ0、T0-PR0, B0-PR0, P0-PR0和Y0-PR0的市售核酸染色劑?？梢允褂肏augland等人的第5，436，134 號(1995),Yue 等人的第 5，658，751 號(1997)、和 Haugland 等人的第 5，863，753號(1999)美國專利申請中所述的任意染料(將所有三篇專利引入本文作為參考)，包括來自Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg 的商標為 SYBR、SYT0、SYT0X、PIC0GREEN、0LIGREEN、和RIBOGREEN的市售核酸染色劑。在本發(fā)明的其它實施方案中，核酸染色劑為摻入氮雜或多聚氮雜苯唑啉(polyazabenzazolium)雜環(huán)的單體、同二聚體、或異二聚體青色素染料，如氮雜苯并噁唑、氮雜苯并咪唑、或氮雜苯并噻唑，當與核酸相連時熒光增強，包括來自Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg 的商標為 SYTO、SYTOX, JOJO, JO-PRO, L0L0, L0-PR0的市售核酸染色劑。在又一個其它實施方案中，與通常雙鏈分子相反的是，可以采用對擴增產(chǎn)物具有特異性的信號生成系統(tǒng)來檢測擴增。在這些實施方案中，信號生成系統(tǒng)可以包括特異性結合于擴增產(chǎn)物中存在的序列的探針核酸，其中可以使用直接或間接可檢測的標記物對所述探針核酸進行標記。直接可檢測的標記物是能夠直接檢測而無需使用其它試劑的標記物，而間接可檢測的標記物是通過采用一種或多種其它試劑而可檢測的標記物，例如，其中標記物為兩個或多個成分構成的信號生成系統(tǒng)。在許多實施方案中，標記物為直接可檢測的標記物，其中感興趣的直接可檢測的標記物包括但不限于:熒光標記物、放射性同位素標記物、化學發(fā)光標記物等。在許多實施方案中，標記物為熒光標記物，其中在該實施方案中所采用的標記試劑為熒光標記的核苷酸(或多種核苷酸)，例如熒光標記的CTP (如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等?？捎糜跇擞浐塑账嵋灾苽錁擞浱结樅怂岬臒晒獠糠职ǖ幌抻?熒光素、青色素染料如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy630/650等。本領域已知也可采用其它標記物，例如上文所述的那些。 在某些實施方案中，使用“能量轉(zhuǎn)移”標記物對特異性標記的探針核酸進行標記。如本文所使用的，“能量轉(zhuǎn)移”是指一個過程，熒光修飾基團借助所述過程改變熒光基團的熒光發(fā)射。如果熒光修飾基團是淬滅基團，那么來自熒光基團的熒光發(fā)射會減弱(淬滅)。能量轉(zhuǎn)移可以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移或通過直接能量轉(zhuǎn)移來發(fā)生。在這兩種情況下，能量的具體轉(zhuǎn)移機制是不同的。應懂得在本申請中對能量轉(zhuǎn)移的任何提及包括所有這些機制不同的現(xiàn)象。如本文所使用，“能量轉(zhuǎn)移對”是指參與能量轉(zhuǎn)移的任意兩個分子。通常一個分子充當熒光基團，另一個充當熒光修飾基團?！澳芰哭D(zhuǎn)移對”用來指形成單一復合物的一組分子，在其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。該復合物可以包括例如彼此不同的兩個熒光基團，和一個淬滅基團，兩個淬滅基團和一個熒光基團，或多個熒光基團和多個淬滅基團。在有多個熒光基團和/或多個淬滅基團的情況下，單個基團可以彼此不同。如本文所使用的，“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”或“FRET”是指能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其中激發(fā)的熒光基團所發(fā)射的光至少部分被熒光修飾基團吸收。如果熒光修飾基團為淬滅基團，那么該基團能夠?qū)⑺盏墓廨椛錇椴煌ㄩL的光，或其可以由于加熱而消散。FRET依賴熒光基團的發(fā)射光譜和淬滅基團的吸收光譜之間的重疊。FRET也取決于淬滅基團和熒光基團之間的距離。在某些臨界距離以上時，淬滅基團不能夠吸收由熒光基團發(fā)射的光，或僅能夠微弱地吸收。如本文所使用的“直接能量轉(zhuǎn)移”是指能量轉(zhuǎn)移機制，其中熒光基團和熒光修飾基團之間不存在光子的通過。不被單一機制所束縛，認為在直接能量轉(zhuǎn)移中，熒光基團和熒光修飾基團干擾彼此的電子結構。如果熒光修飾基團為淬滅基團，這甚至可 導致淬滅基團防止熒光基團發(fā)射光?？梢砸远喾N不同方式構造能量轉(zhuǎn)移標記探針核酸，所述的核酸例如寡核苷酸，只要其包括供體、受體和靶核酸結合結構域。同樣地，在這些實施方案中采用的能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸為核酸檢測子，所述檢測子包括熒光能量供體即供體所處的熒光團結構域，和熒光能量受體即受體所處的受體結構域。如上所述，所述的供體結構域包括供體熒光團。所述的供體熒光團可處于核酸檢測子中的任何位置，但是通常存在于檢測子的5’末端。受體結構域包括熒光能量受體。受體可以位于受體結構域的任何位置，但通常存在于核酸檢測子或探針的:V末端。除了熒光團和受體結構域，能量轉(zhuǎn)移標記探針寡核苷酸也包括靶核酸結合結構域，所述靶核酸結合結構域結合于感興趣(如上所述)的擴增產(chǎn)物中存在的靶核酸序列，例如在(如上所定義的)嚴格的雜交條件下。該靶結合結構域的長度通常為約10至約60個核苷酸，通常為約15至約30nt。根據(jù)寡核苷酸和試驗本身的性質(zhì)，靶結合結構域可以雜交于模板核酸區(qū)域或引物延伸產(chǎn)物區(qū)域。例如，當試驗為5'核酸酶試驗時，例如當采用TaqMan 類型的寡核苷酸探針時，靶結合結構域在嚴格的條件下雜交于模板核酸的靶結合位點，所述位點為引物結合位點的下游或3,端。在一個供選擇的實施方案中，例如在分子信標類型試驗中，靶結合結構域雜交于引物延伸產(chǎn)物的結構域。在這些實施方案中采用的包括所有上述三個結構域的能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸的總長度通常為約10至約60個核苷酸，通常為約15至約30個核苷酸。在某些實施方案中，當能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸不雜交于靶核酸時，對能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸進行構造以在熒光團激發(fā)后，能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸探針的熒光團和受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，寡核苷酸為單鏈分子，其中不形成分子內(nèi)結構并且由于供體和受體的間隔提供單鏈線性形式的能量轉(zhuǎn)移而在其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。在這些實施方案中，當標記寡核苷酸探針雜交于靶核酸時，在熒光團激發(fā)后，標記寡核苷酸探針的熒光團和受體之間也發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。該標記 寡核苷酸探針的具體實例包括TaqMan 類型探針，如第6，248，526號美國專利所描述，將其公開引入本文作為參考(以及Held等人，Genome Res.(1996)6:986-994; Holland等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA (1991) 88:7276-7280;和 Lee 等人，Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766)。在許多這些實施方案中，靶核酸結合結構域為雜交于即互補于模板核酸序列的結構域，即靶核酸結合結構域的靶核酸為存在于模板核酸中的序列(即，偽目標或替代核酸)。在其它實施方案中，當能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸探針雜交于靶核酸時，對探針寡核苷酸進行構建以使在熒光團激發(fā)后在能量轉(zhuǎn)移標記寡核苷酸探針的熒光團和受體之間不發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這些類型的探針結構的實例包括=Scorpion探針(如Whitcombe等人，Nature Biotechnology(1999) 17:804-807 ；第 6,326，145 號美國專利所描述的，將其公開引入本文作為參考)，Sunrise探針(如Nazarenko等人，Nuc.Acids Res.(1997)25:2516-2521;第6，117,635號美國專利所描述的，將其公開引入本文作為參考)，分子信標(Tyagi 等人,Nature Biotechnology (1996) 14:303-308;第 5, 989, 823 號美國專利，將其公開引入本文作為參考)，和構象輔助探針(如W02000/75378所描述的，將其公開引入本文作為參考)。在許多該實施方案中，靶結合序列或結構域包括與擴增反應的引物延伸產(chǎn)物的序列互補并且不與偽靶核酸中存在的序列互補的雜交結構域。在題述方法中的下一步為檢測來自感興趣的標記擴增產(chǎn)物的信號，其中信號檢測可以根據(jù)所采用的特定信號生成系統(tǒng)而有所不同。在某些實施方案中，僅測定了可檢測信號例如熒光的存在或不存在，并且用于題述試驗中，例如通過檢測偽靶核酸和/或其擴增產(chǎn)物來測定或確定靶核酸的存在或不存在。根據(jù)所采用的特定標記，信號的檢測可以表明靶核酸的存在或不存在。在信號生成系統(tǒng)為熒光信號生成系統(tǒng)的那些實施方案中，信號檢測通常包括檢測來自反應混合物的熒光信號的改變以獲得試驗結果。換言之，評估反應混合物所生成的熒光信號的任意調(diào)整。根據(jù)所采用的標記的性質(zhì)，改變可以是熒光增強或減弱，但是在某些實施方案中是熒光增強?？梢允褂萌魏伪憷氖侄魏Y選熒光增強的樣品，例如合適的熒光計，如熱穩(wěn)定電池或讀板式熒光計。使用已知的熒光計對熒光進行合適的監(jiān)測。來自這些部件的信號，例如以光電倍增電壓的形式發(fā)送到數(shù)據(jù)處理面板并轉(zhuǎn)化為與各樣品管相關的光譜?？梢酝瑫r評估多管，如96管。當檢測方案為實時方案，例如，當在實時PCR反應方案中采用時，在整個反應中可以按照該方式在頻繁的間隔下收集數(shù)據(jù)，例如每3分鐘。通過監(jiān)測每個循環(huán)中來自樣品的反應性分子的熒光，能夠以各種方式監(jiān)測擴增反應進程。例如可以分析熔融峰提供的數(shù)據(jù)，例如通過計算熔融峰下的面積和根據(jù)將這些數(shù)據(jù)對循環(huán)數(shù)作圖?？梢岳缡褂妙A選擇的熒光部分如染料的“擬合”來分辨以該方式生成的光譜，以形成代表每個發(fā)出信號的部分(即，熒光團)的峰?？梢詼y定峰下的面積，此面積代表每個信號的強度值，如果需要，將其表達為彼此的商。信號強度和/或比例的微分使得能夠通過反應或在不同反應條件下如不同溫度下記錄標記的探針變化。所述的改變與寡核苷酸探針和靶序列之間的結合現(xiàn)象或結合于靶序列的寡核苷酸探針的降解相關。在微分峰下的面積的積分使得能夠計算標記效果的強度值。針對熒光改變篩選混合物提供一個或多個試驗結果，這取決于是否在引物延伸反應末篩選樣品一次或多次，例如在擴增反應的每個循環(huán)后(例如，如在實時PCR監(jiān)測中所進行的)。 可以以各種方式解釋上述生成的數(shù)據(jù)。在其最簡單的形式中，在擴增反應的過程中或末期來自樣品的熒光增強或降低表示存在于樣品中的靶分析物的量升高，例如，與在反應混合物中檢測到的擴增產(chǎn)物的量相關，表明擴增反應進行的事實，因此靶分析物實際上存在于初始樣品中。也可以通過監(jiān)測整個擴增過程的擴增反應來定量。如上所述，定量也可包括在反應混合物中測試一種或多種核酸對照。以這種方式可容易地針對靶分析物(或多種靶分析物)的存在篩選(或評估或測試等)反應混合物。此方法適合檢測單一靶分析物以及多重分析，在所述的多重分析中測試樣品中的兩種或多種靶分析物。在這些后面的多重情況下，可以采用的不同探針組的數(shù)量通常為約2個至約20個或更高，例如高達100個或更高，1000個或更高，等等。當使用本發(fā)明所述的阻斷試劑時，使用若干不同的鄰位探針組(多重)同時以及在單一反應中對許多分析物進行的分析通過所獲得的升高的特異性和靈敏度而得到提高，并且可進一步通過使用結合夾板方法將其提高?？梢栽O計每個探針組以產(chǎn)生獨特的相互作用(例如連接)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可用于測定探針組所尋找的分析物的存在或不存在、數(shù)量和/或位置?？芍苯踊蛟跀U增后使用任何由文獻中已知的已建立的核酸分子的分析方法檢測相互作用產(chǎn)物，包括液相色譜法、電泳法、質(zhì)譜法、顯微鏡法、實時PCR、熒光探針等。特別感興趣的是結合夾板方法與具有“DNA陣列”讀出格式的組合。來自多重鄰位試驗的若干獨特的相互作用產(chǎn)物可以雜交于標準化的DNA陣列，所述標準化的DNA陣列攜帶許多與連接產(chǎn)物序列互補的寡核苷酸序列(標簽)。可通過在DNA陣列上的位置識別每種雜交于陣列的相互作用產(chǎn)物，并且在給定雜交地點的檢測強度將表示特異性相互作用產(chǎn)物的量，因此表示導致該相互作用產(chǎn)物的分析物的量。相互作用產(chǎn)物的檢測可通過光譜測定、熒光、放射性同位素等實現(xiàn)。在擴增反應(PCR)中，可以使用熒光標記的引物或熒光標記的核苷酸將熒光部分便利地引入相互作用產(chǎn)物中。DNA陣列可以是膜上的簡單的斑點印跡陣列，其含有少量斑點或攜帶成百上千個斑點的高密度的陣列。可以對本發(fā)明所述方法的檢測步驟進行改變以進一步降低與非特異性核酸雜交事件相關的背景。該改變包括調(diào)整為能夠降低任何非特異性核酸雜交事件的方法。在某些實施方案中，可以將蛋白加入含有樣品和鄰位探針的混合物中以降低較弱的和非特異性的DNA雜交事件。例如，大 腸桿菌單鏈DNA結合蛋白已用于提高引物延伸反應和PCR反應的產(chǎn)率和特異性(第5，449，603號和第5，534，407號美國專利)。噬菌體T4的基因32蛋白(單鏈DNA結合蛋白)可以明顯提高擴增較大DNA片段的能力(Schwartz等人，Nucl.Acids Res.18:1079 (1990))并提高 DNA 聚合酶的保真度(Huang, DNA Cell.Biol.15:589-594(1996))。當采用時，該蛋白可用于使反應混合物中的濃度達到約0.0lng/μ L 至約 I μ g/ μ L ;如約 0.1ng/ μ L 至約 IOOng/ μ L ;包括約 lng/ μ L 至約 IOng/ μ L。在其它實施方案中，雙鏈核酸可用作第一和第二鄰位探針的核酸結構域以降低較弱的和非特異性的DNA雜交事件。如上所述，如此設計本發(fā)明所述方法以使第一和第二探針的核酸結構域之間的相互作用(例如連接)僅在鄰位探針與分析物結合時發(fā)生。然而，在所有該類型的試驗的情況下，不能總是保證這樣，并且可能有一些背景相互作用，例如，核酸結構域的連接；如果探針與在溶液中隨機鄰近(通過借助夾板要求所有探針的核酸結構域互相雜交可降低其可能性，以使該相互作用發(fā)生)。因此，為了進一步使得由于未反應的(即未結合的)探針導致背景的可能性降低或者最小化，除上述阻斷試劑外，可以使用阻斷寡核苷酸。阻斷寡核苷酸與第一和第二鄰位探針的核酸結構域的游離末端結合(即雜交或退火)。因此阻斷寡核苷酸可以結合于5’鄰位探針的核酸結構域的游離3' OH末端和3'鄰位探針的核酸結構域的游離Y磷酸酯末端。阻斷寡核苷酸的結合在局部高濃度夾板的存在下可以勝出，如當所有探針一起結合于分析物上時會發(fā)生的那樣。阻斷寡核苷酸可以按照這種方式防止第一和第二結構域在分析物結合不存在時雜交到夾板。因此可以在與分析物的結合不存在時防止5'和3'探針的游離末端相互作用。當所有探針結合于分析物時，夾板的局部濃度，尤其是當夾板形成了第三鄰位探針的核酸結構域時，足以超過阻斷寡核苷酸；第一和第二結構域雜交于夾板并且取代阻斷寡核苷酸。因此阻斷寡核苷酸允許使用基于競爭的策略來降低背景并進一步提高試驗的靈敏度。阻斷寡核苷酸的長度可以為約4-100個核苷酸，例如6-75或10_50個。它們可以雜交于第一或第二探針的核酸結構域的游離末端處或附近(“附近”是指在游離3'或Y末端的1-20或1-10個以內(nèi)，例如1-6個核苷酸以內(nèi))。雜交區(qū)域可以是3-15個核苷酸長度,例如 3-12、3-10、3-8、4-8、3-6、4-6 個?？梢员憷卦O計阻斷寡核苷酸以具有發(fā)夾結構以使阻斷寡核苷酸可以連接于不能雜交于夾板的鄰位探針的末端。通常以超過各自探針的量使用阻斷寡核苷酸，例如過量2-1000倍，例如20-500、50-300、100-500 或 100-300 倍，例如 20,200 或 300 倍。在使用低親和力和慢結合動力學的鄰位探針檢測分析物的情況下，鄰位探針可以與樣品接觸并在足夠高以促進鄰位探針與分析物結合的濃度下孵育。該孵育步驟可以迅速稀釋成大批的的冷緩沖液(例如，不包括分析物或鄰位探針的緩沖液)，并且隨后將一部分該稀釋液加入連接反應混合物中。該連接反應混合物可以含有盒式寡核苷酸(如果使用)、ATP和連接酶。低溫，例如約0° C至約20° C，包括約4° C至約10° C，使已存在的鄰位探針分析物復合物的解離最小化，而大量的稀釋導致未結合的鄰位探針濃度下降，從而降低其反應性并使背景信號最小化。在該實施方案中，通過使用較小的樣品孵育體積進行試驗，所述較小的孵育體積為約I μ I至約20 μ 1，如約I μ 1、或約2 μ 1、或約3 μ 1、或約4 μ 1、或約5 μ I或約6 μ I的樣品，然后將較大的孵育體積加入阻斷試劑和鄰位探針加入盒中，所述較大的孵育體積為8 μ I至約1.5ml或更多，如約20 μ I至約1.3ml,如約50 μ I至約Iml,如約75 μ I至約800 μ 1，如約100 μ I至約500 μ 1，如約200 μ I至約300 μ I。由于探針和分析物之間的結合在第一和第二核酸結構域連接或雜交和延伸之前沒有時間解離，因此在最終孵育體積中的鄰位探針的有效濃度得到稀釋，在保持信號的同時降低了背景。只要能夠從較大如超過100 μ I或更多的體積中濃縮連接或延伸產(chǎn)物，然后檢測鄰位依賴性相互作用，該方法就能夠?qū)崿F(xiàn)極高的靈敏度。在該實施方案中，可以通過使用單鏈結合蛋白降低探針-探針相互作用。與復雜樣品相關的問題可以進一步通過在分析前稀釋復雜樣品來解決。然而，本發(fā)明所述檢測方法的一個優(yōu)勢是阻斷試劑通過占據(jù)潛在的非靶向特異性結合位點而有效地降低樣品的復雜度。然而，復雜樣品的稀釋可以與本發(fā)明所述阻斷試劑組合而進一步降低背景信號。實際上，稀釋樣品的步驟會大大降低探針非特異性結合的蛋白的量，從而降低所需探針的濃度。雖然也稀釋分析物，但是鄰位探測的高靈敏度將提供良好的檢測和定量?？删|(zhì)地(即在溶液中)采用上述本發(fā)明的方法，或供選擇地異質(zhì)地進行，使用固相，例如其中分析物固定于固相上，允許使用洗滌步驟。固相試驗的使用帶來了優(yōu)勢，特別是對于檢測困難的樣品而言:洗滌步驟可以輔`助抑制性成分的去除，并且可以從不想要的大樣品體積中濃縮分析物。由于未結合的分析物和探針可以通過洗滌除去，因此可以使用更高濃度和更大量的鄰位探針。通過洗滌除去未結合探針或未相互作用的探針的能力也意味著固相試驗與均質(zhì)試驗相比可以耐受更低純度的鄰位探針?？梢砸远喾N方式將分析物固定于固相上。因此，考慮固相試驗的若干實施方案，例如固相結合夾板試驗。在一個這樣的實施方案中，可以將一個(或多個)第一或第二 (或第三，如果使用)鄰位探針(或可能能夠)固定于固相(或固體支持物)上。分析物能夠首先被一個(或多個)固定的(或可固定的)探針捕獲，其次被隨后加入的探針(或多個探針)結合。在該方案中，前述活動性作用可以不存在于結合步驟中但與洗滌步驟相關。優(yōu)選地，含有分析物的樣品在與固相結合(即固定化的，或可固定的)探針(或多個探針)接觸之前與阻斷試劑接觸，優(yōu)選地與非固定化的/不可固定的探針(或多個探針)同時加入反應混合物中，以使活動性作用也有助于檢測(結合)步驟。固定化的鄰位探針可以以任意便利的方式固定于，即結合于支持物上。因此固定化的方式或手段和固體支持物可以根據(jù)選擇選自任意數(shù)量的如本領域廣泛已知的和文獻中所描述的固定手段和固體支持物。因此，探針可以直接結合于支持物，例如通過分析物結合結構域(例如化學交聯(lián)的)，可以借助連接基團，或通過中間結合基團(或多個基團)(例如，借助生物素-鏈酶親和素相互作用的方式)間接結合。因此，可以將鄰位探針以及支持物上提供的固定手段一起提供(例如，親和結合配偶體，例如能夠結合其結合配偶體的生物素或半抗原，即同源結合配偶體，例如鏈酶親和素或抗體)?？梢栽诮Y合于分析物之前或之后對探針進行固定。此外，該“可固定的”探針可以與樣品和支持物一起接觸。固體支持物可以為任意熟知的目前廣泛用于或提議用于固定、分離等的支持物或基質(zhì)。這些可采用顆粒(例如，磁性或非磁性珠子)、片狀物、凝膠、濾膜、膜、纖維、毛細管或微滴定條、管、板或孔等的形式。所述的支持物可以由玻璃、二氧化硅、乳膠或聚合材料制成。合適的是具有用于結合分析物的高表面積的材料。這樣的支持物可以具有不規(guī)則表面并且可以是例如多孔的或微粒狀的，例如顆粒、纖維、網(wǎng)、燒結物或篩。微粒材料例如珠子由于其更大的結合能力而有用，特別是聚合珠子。便利地，根據(jù)本發(fā)明使用的微粒固體支持物可以包括球形珠子。珠子的大小不是關鍵的，但是它們的直徑的級數(shù)例如可以為至少1，以及優(yōu)選至少2 μ m，最大直徑優(yōu)選地不大于10，以及例如不大于6 μ m。單分散顆粒，即大小基本均勻的顆粒(例如直徑標準偏差小于5%的尺寸)的優(yōu)勢在于其提供非常均勻的反應重現(xiàn)性?？梢酝ㄟ^如US-A-4336173中所述的技術制備典型的單分散聚合物顆粒。然而，為了有助于操縱和分離，磁珠是有利的。如本文所使用的術語“磁性”是指當置于磁場中是支持物能夠具有賦予的磁矩，因此在磁場作用下可移動。換言之，包括磁性顆粒的支持物可以容易地通過磁聚集來除去，其在分析物結合步驟之后提供快速、簡單和有效的分離顆粒的方式。在另一個實施方案中，除了均質(zhì)結合夾板試驗的非固定化的鄰位探針外，可以使用僅包括結合結構域的固定化的(或可固定的)分析物特異性探針(即分析物捕獲探針)。因此在該實施方案中分析物首先被固定化的或可固定的捕獲探針捕獲，所述的捕獲探針僅用于將分析物固定于固相上，隨后將固定的分析物與阻斷試劑和鄰位探針進行孵育。在該實施方案中，捕獲探針可以為任意能夠直接或間接結合分析物的結合配偶體(例如，如以上所討論的關于鄰位探針的分析物結合結構域)。更特別地，該捕獲探針特異性地結合于分析物上。由于方法的該實施方案需要至少三個探針(結合結構域)同時結合于分析物或分析物復合物，因此可能找到至少三個不同的表位，這賦予試驗較高的特異性。在又一個實施方案中，分析物可以自身固定(或可固定)于固相，例如通過非特異性吸附。在一個特定的實施方案中，分析物可以存在于任選地固定和/或透化的細胞內(nèi)，所述分析物(能夠)連接于固體支持物。
上述方法導致對存在于反應混合物中的鄰位依賴性相互作用的檢測，轉(zhuǎn)而對所試驗的樣品中的靶分析物的量提供測量。測量可以是定性的或定量的。顯然的是，上述實施方案關于但不限于鄰位探針連接試驗。因此，上述特征可應用于利用本文所述阻斷試劑的其它基于探針和基于鄰位探針的試驗中。因此，上述檢測復雜樣品中的一種或多種靶分析物的存在的方法可用于多種不同應用中。
題述方法可以用于針對樣品中一種或多種靶分析物的存在或不存在來篩選樣品。如上所述，本發(fā)明提供了檢測樣品中一種或多種靶分析物的存在或定量的方法?？梢圆捎妙}述方法來檢測多個不同類型樣品中一種或多種靶分析物的存在，包括具有大量非靶向?qū)嶓w的復雜樣品，其中與未利用本發(fā)明所述的阻斷試劑的等價方法相比，題述方法的阻斷試劑允許更加優(yōu)越地檢測靶分析物(或多種靶分析物)。同樣地，題述方法為高度靈敏的檢測簡單或復雜樣品中的一種或多種靶分析物的方法。在題述方法中試驗的樣品在許多實施方案中來自生理來源，如以上更加詳細地討論的。除了檢測多種分析物，題述方法也可用于篩選化合物，所述化合物調(diào)節(jié)鄰位探針的分析物結合結構域與分析物的結合區(qū)域之間的相互作用，即分析物結合結構域與分析物的結合。術語調(diào)節(jié)包括降低(例如抑制)和提高兩個分子之間的相互作用。所述的篩選方法可以是體外或體內(nèi)形式，其中本領域技術人員可以容易地開發(fā)出兩種形式?？梢酝ㄟ^上述方法篩選多種不同的候選試劑。候選試劑包括多種化學物種，但它們通常為有機分子，優(yōu)選分子量大于50并且小于約2，500道爾頓的小型有機化合物。候選試劑包括與蛋白質(zhì)結構相互作用所必需的官能團，特別是氫鍵，并且其通常包括至少一種氨基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個化學官能團。候選試劑通常包括取代一種或多種以上官能團的碳環(huán)或雜環(huán)結構和/或芳香或多芳香結構。候選試劑也存在于生物分子中，包括肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。從廣泛的來源中獲得候選試劑，包括合成或天然化合物庫。例如，可用多種方式來隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子，包括隨機寡核苷酸和寡肽的表達。供選擇地，以細菌、真菌、植物和動物提取物形式存在的天然化合物庫是可用的或容易制備的。此外，可以容易地將天然或合成制備的庫和化合物通過傳統(tǒng)的化學、物理和生物化學手段進行修飾，并可以用于制備組合庫。已知的藥理試劑可以經(jīng)受定向或隨機化學修飾，如?；⑼榛?、酯化、酰胺化等以產(chǎn)生結構類似物。在上述篩選試驗中確定的試劑可用于各種方法中，包括調(diào)節(jié)靶分析物活性的方法，和用于與其出現(xiàn)和/或活性相關的條件中。如上所述的，也提供了用于實施題述方法的試劑盒。例如，在某些實施方案中，用于實施題述方法的試劑盒包括阻斷試劑，所述阻斷試劑包括如上所述的如核酸成分偶聯(lián)的分析物特異性結合蛋白。所述試劑盒可以進一步包括至少一組鄰位探針，其中組中的至少一個鄰位探針，但優(yōu)選至少兩個和更優(yōu)選每個鄰位探針包括如上所述的蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域。如上所述，某些方案可以采用兩個或多個不同組的該探針以同時檢測樣品中的兩種或多種靶分析物，例如，以多重和/或高通量形式。同樣地，在某些實施方案中，試劑盒將包括不同兩個或多個組的鄰位探針。此外，試劑盒成分所實施的方案中要求或需要的其它試劑是可以存在的，其中所述的其它試劑包括但不限于以下物質(zhì)的一種或多種:連接酶、間隔/盒式寡核苷酸、可連接的寡核苷酸，聚合酶，普通雜交模板(或“延伸模板”)，阻斷寡核苷酸，用于固定探針、結合結構域或分析物的固體支持物，用于固定探針、結合結構域或分析物的部件，檢測部件例如熒光標記的核苷酸或寡核苷酸，互補核酸對，單鏈結合蛋白和PCR擴增試劑(例如，核苷酸、緩沖液、陽離子等)等。在某些實施方案中，所述的試劑盒可以包括如上所述的為降低孵育混合物有效體積而采用的成分，例如體積排斥劑。試劑盒成分可以存在于獨立的容器中，或一種或多種成分可以存在于相同容器中，其中所述容器用于設計試劑盒的試驗，并且所述容器可以是儲存容器和/或在試驗過程中采用的容器。除了上述成分，題述試劑盒可以進一步包括實施題述方法的說明書。這些說明書可以以各種形式存在于題述試劑盒中，其中一種或多種可以存在于試劑盒中。這些說明書可以存在的一種形式是在合適介質(zhì)或基質(zhì)上印刷的信息，所述的介質(zhì)或基質(zhì)是例如印刷了信息的一張或多張紙、在試劑盒的包裝中、在包裝內(nèi)含物上等。另一個部件可以是計算機可讀的介質(zhì)，例如軟磁盤、⑶等，其中將信息記錄在其上?？梢源嬖诘牧硪粋€部件是網(wǎng)站地址，其中可以通過因特網(wǎng)使用所述網(wǎng)站地址得到遠端的站點的信息。任何便利的手段都可以存在于試劑盒中。因此，在進一步的方面中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中分析物的方法的試劑盒，所述試劑盒包括:(a)阻斷試劑，其包括與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白；和(b)至少一組探針，其中組中的每個探針包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中分析物的方法的試劑盒，所述試劑盒包括:(a)阻斷試劑，其包括與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白；(b)至少一組至少第一和第二鄰位探針，其中每組中的至少一個探針，更優(yōu)選的每個探針包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域，其中每個探針組中的每個探針能夠同時結合于分析物；(C)任選地，用于介導所述第一和第二鄰位探針的核酸之間的相互作用的部件(例如，夾板寡核苷酸和/或連接酶，或聚合酶和/或普通雜交模板)；和(d)任選地， 檢測所述相互作用的部件。如上所述，用于介導核酸之間的相互作用的部件可以包括一個或多個夾板寡核苷酸和/或連接酶，并且該部件可以任選地進一步包括連接反應必須的其它試劑。供選擇地，當試驗為鄰位延伸試驗時，用于介導相互作用的部件可以包括聚合酶和/或普通雜交模板，并且任選地進一步包括用于延伸反應中的試劑。用于檢測相互作用的部件可以是在以上試驗方法的上下文中所述的任意部件，例如在第一和第二探針的核酸結構域上提供的標記物，或可以是擴增部件和用于檢測其擴增產(chǎn)物的部件，例如用于PCR反應的試劑(例如，擴增引物，以及任選地聚合酶和/或核苷酸等)和用于檢測PCR擴增子等的試劑(例如，Taqman 探針等)。在一個供選擇的實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測樣品中分析物的方法的試劑盒，所述試劑盒包括:(a)阻斷試劑，其包括與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白；(b)至少一組探針，其中每組中的至少一個探針包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域；(C)任選地，用于使所述探針的核酸結構域相互作用以產(chǎn)生可檢測的信號的部件(例如，能夠雜交于所述探針的核酸結構域的環(huán)形的或可環(huán)化的核酸分子，和連接酶和/或聚合酶)，優(yōu)選地，其中所述可檢測的信號為核酸分子；和
(d)任選地，檢測所述可檢測的信號的部件。
用于使所述探針的核酸結構域相互作用以產(chǎn)生可檢測的信號的部件可以包括能夠與核酸結構域特異性相互作用以產(chǎn)生可檢測的核酸分子的任意核酸分子。例如，所述的部件可以是核酸引物和聚合酶，所述的核酸引物例如引物對，以及所述的聚合酶例如在PCR中能夠擴增至少一部分探針的核酸結構域的聚合酶。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述的部件包括能夠雜交于探針的核酸結構域的環(huán)形或可環(huán)化的核酸分子(類似于鎖式探針)。核酸結構域可以充當連接可環(huán)形化的核酸分子的模板和/或充當滾環(huán)擴增(RCA)的引物。因此，所述的部件也可包括連接酶和/或聚合酶并且該部件可以任選地進一步包括其它連接酶和/或聚合酶反應必須的其它試劑，例如用于RCA的引物，其中所述探針的核酸結構域不充當引物。用于檢測相互作用的部件可以是在以上試驗方法的上下文中所述的任意部件，例如在探針的核酸結構域上提供的標記物或相互作用的核酸(或多個核酸)，或可以是擴增部件和用于檢測其擴增產(chǎn)物的部件，例如用于PCR反應的試劑(例如，擴增引物，任選地聚合酶和/或核苷酸等)和用于檢測PCR擴增子等的試劑(例如，Taqman 探針等)。所述的試劑盒可以進一步任選地包括用于第一探針和如果存在，用于第二探針的間隔/盒式寡核苷酸和/或阻斷寡核苷酸。所述的試劑盒可以進一步任選地包括針對分析物的固定化的捕獲探針，或用于固定的部件所提供的捕獲探針。供選擇地，所述的試劑盒可包括用于捕獲或結合于分析物的固相，或一個或多個所述第一、第二或第三鄰位探針可以按照固定或由用于固定的部件提供。將參照以下非限定性實施例、參照以下附圖進一步描述本發(fā)明，其中:凰！顯示了鄰位連接試驗反應中非特異性背景信號的降低，所述的試驗使用人血漿樣品和純緩沖液樣品上的錯配PLA-探針對(NGF和IL-2)。其中“GP”為山羊阻斷探針，“P.D.”為血漿稀釋液。顯示了 PLA反應中單個成分對非特異性背景信號的影響，所述的PLA反應使用人血漿樣品或血清樣品、稀釋的人血漿或血清樣品(50/50)和純緩沖樣品上的錯配PLA-探針對(NGF和IL-2)的。其中“MO”為長度為40個核苷酸的隨機化的寡核苷酸的樣品，“IgG”為來自山羊的大批的IgG。阻斷試劑為綴合于大批的IgG的MO寡核苷酸。Si顯示了 PLA-反應中非特異性背景信號的評價，所述的PLA反應在三種人血漿樣品7P、8P、11P，和含有和不含有阻斷試劑的緩沖液中進行，所述阻斷試劑由山羊(山羊探針)制成，以及錯配靶向特異性抗體來自兔和兔(A)、小鼠和兔(B)和綿羊和小鼠(C)。圖4顯示當使用與阻斷探針(“4步innova”)不同的針對靶探針的綴合化學(“I步innova”)時，在五種人血漿樣品(3P、4P、7P、8P和IIP)和緩沖液中的阻斷試劑(山羊探針)的作用。PLA反應使用錯配的探針對51_7 (A)和7_51 (B)，其中序列號51對應于ICAM，序列號7對應于 ΜΡ-1。實施例1材料和方法:抗體的綴合抗體的共價SMCC綴合:對于靶向特異性探針，多克隆或單克隆抗體為根據(jù)制造商(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)的方案綴合于 3’ 和 5’ 寡核苷酸的硫代-SMCC(硫代琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)的。為了產(chǎn)生阻斷探針，將隨機的MO寡核苷酸綴合到使用相同的綴合方案制成的多克隆IgG抗體?？贵w的共價Innova 綴合:根據(jù)制造商(Innova Biosciences, Cambridge, UnitedKingdom)的方案將10 μ g(lmg/mL)的抗體綴合于3’和5’寡核苷酸。為了產(chǎn)生阻斷探針，將隨機的MO寡核苷酸綴合到使用相同的程序制成的多克隆IgG抗體。樣品人EDTA血衆(zhòng)和血清樣品由來自Olink Bioscience的8名健康志愿者友好地提供。K3-EDTA抗凝管(Hettich Labinstrument, Sollentuna, Sweden)用于血衆(zhòng)樣品，將含有凝結激活劑的管(Hettich Labinstrument, Sollentuna, Sweden)用于血清樣品。所有樣品在RT下孵育1-2小時并在等分前進一步在3000rpm下離心10分鐘，并儲存于-20° C。樣品制備將血漿和血清樣品，以及緩沖液以1:2稀釋于Olink血漿稀釋緩沖液、PBS pH7.4、5mM EDTA、0.13mg/mL 鮭魚精 DNA、0.1%BSA、0.25mg/mLIgG、0.02% 疊氮鈉中，其中含有或不含2.5 μ M的阻斷試劑，并在室溫下孵育20分鐘。探針孵育通過在FBB (PBS pH7.4、25mM Tris ρΗ8、0.1% 魚膠、4mM EDTA、lmM 生物素、0.016mg/mL 鮭魚精 DNA,0.02% 疊氮鈉)、0.l%TritonX-100/l%BSA 中將探針稀釋至濃度為50-200pM來制備混合物。將2μ L的探針混合物轉(zhuǎn)移至每個聚丙烯蓋中(Sarstedt, Niimbrecht, Germany),接著加入2 μ L的合適稀釋的樣品中。將蓋放在聚丙烯管上，短暫離心后在+4° C下孵育過夜。連接和實時PCR 將IOOyL的連接混合物加入每4yL的孵育樣品中，在37° C下孵育10分鐘并在65° C下熱滅活10分鐘，所述的連接混合物含有25mM KC1、2.5mM MgCl2,20mMTris-HCl (pH8)、0.004ffeiss 單位的 T4DNA 連接酶(Fermentas, St.Leon-Rot, Germany)、IOOnM連接寡核苷酸、2mM DTT和80 μ M ATP。實時PCR的總反應體積為20 μ 1，含有11 μ I的 200nM TaqMan 探針，500ηΜ 通用引物、IXTE pH8.0、2X Fast Taqman Universal MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA)和9 μ I的連接產(chǎn)物。一式四份運行樣品,循環(huán)條件為95° C下2分鐘，接著在95° C下進行15s和在60° C下60s的45個循環(huán)。使用 ABI PRISM7900HT(Applied Biosystems, Foster City, CA)進行擴增和檢測。數(shù)據(jù)分析將Excel用作來自q_PCR儀器的原始數(shù)據(jù)(SDS文件)的計算和分析。實驗原理使用對兩種不同蛋白分析物具有特異性的兩種PLA探針進行以下實驗，所述兩種不同蛋白分析物不相互作用，如NGF和IL-2。當血清或血漿樣品加入該檢測反應中時，不應檢測到比“緩沖液”背景更高的信號，除非PLA探針有非特異性結合事件，使探針鄰近從而形成假陽性信號。鄰位連接試驗將蛋白分析物轉(zhuǎn)化為在以下實驗中由實時PCR讀取的DNA擴增子。平均Cts與標準偏差共同報告。實施例2PLA在阻斷試劑存在或不存在下的特異性
通過使用非匹配探針對在人血漿樣品中進行鄰位連接試驗，從而監(jiān)測非特異性信號。該非匹配或錯配探針對不應產(chǎn)生高于噪聲(來自純緩沖液)任何信號(來自血漿)。第一探針靶向NGF，以及其它探針靶向IL-2。血漿信號來自該錯配檢測，其中通過使用阻斷試劑顯著降低，并將其包括在試驗程序中(

圖1)。也在非綴合大批的IgG和非綴合隨機寡核苷酸分別和同時存在下進行試驗。這些反應不顯著提高試驗特異性，即，試劑的這些反應必須綴合以獲得非特異性背景信號的降低。實施例3證明特異性提高作用(阻斷作用)來自特異性阻斷試劑(綴合于隨機寡核苷酸的抗體)而不是來自該試劑的單個成分的試驗為了證明僅當隨機MO寡核苷酸連接于大批的IgG抗體時才獲得阻斷作用，分別研究了單個成分的作用，并與所述阻斷試劑的作用進行比較。僅加入MO寡核苷酸(7.5μΜ,在血漿或者血清的預孵化過程中，血漿或血清稀釋液(50:50，血漿或血清和緩沖液)或僅有緩沖液在RT下20分鐘的過程中未使非特異性信號產(chǎn)生任何差異。加入IgG抗體(2.5μΜ)輕微降低非特異性信號但在血漿和血清樣品中仍有顯著的交叉反應性。然而，加入阻斷探針(2.5 μ M的抗體與3-倍綴合過量的MO寡核苷酸)完全消除了交叉反應性(圖 2)。實施例4由IgG制備的阻斷試劑的阻斷作用，所述IgG來自不同于獲得靶抗體的物種為了進一步評價阻斷試劑的作用，我們研究了使用由山羊IgG制成的探針的作用是否對由來自除山羊外的物種制成的錯配探針具有相同的阻斷作用。我們測試了三種不同的錯配探針對的組合:兔+兔(圖3Α)、小鼠+兔(圖3Β)和綿羊+小鼠(圖3C)并研究了在三種不同人血漿樣品7Ρ、8 Ρ和IlP中的交叉反應性。當使用組合兔+兔(圖3Α)和綿羊+小鼠(圖3C)時，在錯配探針之間顯示任何交叉反應性的唯一樣品為11Ρ，其中在血漿稀釋劑或緩沖液中都不存在阻斷試劑。該交叉反應性表明了需要阻斷試劑以除去在某些特定樣品中能出現(xiàn)的非特異性信號。因此，當在血漿稀釋劑或緩沖液中孵育阻斷試劑時，非特異性信號的交叉反應性被消除。該實驗證明了阻斷試劑的蛋白成分不需要與靶向特異性結合結構域來自相同的物種。實施例5使用針對阻斷試劑的一種綴合化學和針對靶向特異性探針的不同綴合化學的阻斷試劑的阻斷作用在以下試驗中一種連接類型(“4步Innova”)用于阻斷試劑，以及另一種連接類型(“I步Innova”)用于靶向特異性探針。試驗中包括了五種不同的血漿樣品(3P、4P、7P、8P和11P)，并且使用了兩種錯配探針組合(51_7和7_51 ;序列號51對應于抗-1CAM抗體，以及序列號7對應于 ΜΡ-1)。當使用阻斷試劑(山羊探針)用于探針組合時，血漿樣品中的非特異性結合顯著降低(圖4A-B)。因此，用于綴合/偶合阻斷試劑的核酸結構域的方法和連接子不需要與用于綴合鄰位探針的核酸結構域和分析物結合結構域的連接子相同。該試驗還證明了雖然僅有某些血漿樣品顯示非特異性信號，但都可以使用阻斷試劑除去。
權利要求
1.與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物在基于探針的檢測試驗中作為阻斷試劑的用途，所述的檢測試驗使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針來檢測樣品中的分析物。
2.檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針，其中將與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物用作阻斷試劑。
3.根據(jù)權利要求1所述的用途，所述的用途為與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物在基于鄰位探針的檢測試驗中作為阻斷試劑的用途，所述的檢測試驗使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的鄰位探針來檢測樣品中的分析物。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，所述的方法為檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的鄰位探針，其中將與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物用作阻斷試劑。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的用途或方法，其中所述檢測試驗或檢測方法為免疫-PCR或免疫-RCA。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑過量于探針使用。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的非分析物特異性結合蛋白成分為血清蛋白或鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白，或其修飾物、衍生物或變體，或其組合。
8.根據(jù)權利要求7所述的用途或方法，其中所述血清蛋白成分可以為單一特異性類型 的血清蛋白，或可以包括多種不同的血清蛋白。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的用途或方法，其中所述血清蛋白成分為球蛋白和/或白蛋白。
10.根據(jù)權利要求9所述的用途或方法，其中所述球蛋白為血清球蛋白。
11.根據(jù)權利要求10所述的用途或方法，其中所述血清球蛋白包括至少70%的Y-球蛋白。
12.根據(jù)權利要求11所述的用途或方法，其中所述的Y-球蛋白為免疫球蛋白，優(yōu)選為IgG0
13.根據(jù)權利要求12所述的用途或方法，其中所述IgG為大批的IgG。
14.根據(jù)權利要求9所述的用途或方法，其中所述白蛋白為血清白蛋白。
15.根據(jù)權利要求14所述的用途或方法，其中所述血清白蛋白為不同血清白蛋白的組入口 ο
16.根據(jù)權利要求7至15中任一項所述的用途或方法，其中所述血清蛋白與鄰位探針的蛋白質(zhì)靶分析物結合結構域來自相同的物種。
17.根據(jù)權利要求7所述的用途或方法，其中所述鏈酶親和素樣蛋白為與鏈酶親和素或其修飾物、衍生物或變體具有相似結構和/或功能特性的蛋白。
18.根據(jù)權利要求7或17所述的用途或方法，其中所述鏈酶親和素或鏈酶親和素樣蛋白，或其修飾物、衍生物或變體選自鏈酶親和素、NeutrAvidin 、Extravidin 、和Neutra Lite 。
19.根據(jù)權利要求1至18中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域為自體的。
20.根據(jù)權利要求1至18中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域為異體的。
21.根據(jù)權利要求1至20中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域與探針、夾板的核酸結構域或試驗中使用的其它寡核苷酸或與用于檢測鄰位探針之間的相互作用的任意核酸的序列同源性小于80%。
22.根據(jù)權利要求1至21中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域包括一個或多個隨機生成的核酸序列。
23.根據(jù)權利要求1至22中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域包括至少8個核苷酸。
24.根據(jù)權利要求1至23中任一項所述的用途或方法，其中所述阻斷試劑的核酸結構域包括單鏈DNA。
25.根據(jù)權利要求1至24中任一項所述的用途或方法，其中所述非分析物特異性結合蛋白通過共價鍵與核酸偶聯(lián)。
26.根據(jù)權利要求25所述的用途或方法，其中所述共價鍵為化學交聯(lián)。
27.根據(jù)權利要求1至24中任一項所述的用途或方法，其中所述非分析物特異性結合蛋白通過非共價締合與核酸偶聯(lián)。
28.根據(jù)權利要求27所述的用途或方法，其中所述非共價締合是通過基于鏈酶親和素-生物素的偶聯(lián)的。
29.根據(jù)權利要求1至28中任一項所述的用途或方法，其中用于偶聯(lián)非分析物特異性結合蛋白成分和阻斷試劑的核酸結構域的連接子與偶聯(lián)探針或多種探針的核酸結構域和蛋白質(zhì)分析物結合結構域的連接子相同。
30.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述方法包括: Ca)將所述樣品與權利要求4至29中任一項所定義的阻斷試劑接觸； (b)進一步將所述樣品與至少一組至少第一和第二鄰位探針接觸，其中所述探針分別包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域，并且能夠同時結合于分析物； (c)當所述鄰位探針與所述分析物結合后，允許鄰位探針的核酸結構域彼此相互作用，其中所述相互作用包括連接反應或延伸反應；和 Cd)檢測所述連接或延伸。
31.用于檢測樣品中分析物的方法的試劑盒，所述試劑盒包括: Ca)阻斷試劑，其包括與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白；和 (b)至少一組探針，其中組中的每個探針包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域。
32.根據(jù)權利要求31所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括: Ca)阻斷試劑，其包括與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白； (b)至少一組的至少第一和第二鄰位探針，其中每組中的至少一個探針，更優(yōu)選的其中每個探針均包括蛋白質(zhì)分析物結合結構域和核酸結構域，其中每個探針組中的每個探針能夠同時結合于分析物； (c)任選地，用于介導所述第一和第二鄰位探針的核酸之間的相互作用的部件；和(d)任選地，檢測所述相互作用的部件。
33.根據(jù)權利要求31所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括: (C)用于使所述探針的核酸結構域相互作用以產(chǎn)生可檢測的信號的部件，優(yōu)選地，其中所述可檢測的信號為核酸分子；和 Cd)任選地，用于檢測所述可檢測的信號的部件。
34.根據(jù)權利要求31至33中任一項所述的試劑盒，其中所述阻斷試劑為權利要求6至29中任一項所定義的。
35.制備阻斷試劑的方法，包括: (a)從血液中提取血清蛋白； (b)制備核酸；和 (c)將(a)中的蛋白與(b)中的核酸偶聯(lián)， 其中所述血清蛋白包括多種不同的血清蛋白，并且對基于探針檢測試驗的靶分析物具有較低的結合親和力或無結合親和力。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中步驟(a)的血清蛋白為如權利要求9至16中任一項所定義的，步驟(b)的核酸為如權利要求19至24中任一項所定義的，以及步驟(c)的偶聯(lián)為如權利要求25至29中任一項所定義的。
37.根據(jù)權利要求35或36所述的方法，其中所述血清蛋白為大批的IgG。
38.通過權利要求35 至37中任一項所述的方法獲得的或通過權利要求35至37中任一項所述的方法可獲得的阻斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及與核酸偶聯(lián)的非分析物特異性結合蛋白的綴合物在基于探針的檢測試驗中作為阻斷試劑的用途，其中使用包含與核酸結構域偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分析物結合配偶體的探針檢測樣品中的分析物。
文檔編號G01N33/536GK103154266SQ201180034921
公開日2013年6月12日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權日2010年7月15日
發(fā)明者S·弗雷德里克松, B·特蘭 申請人:歐凌科公司