專利名稱：一種微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種使用Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)檢測(cè)微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來飲用水(源)中有機(jī)污染物的種類日益增多，水質(zhì)的安全評(píng)價(jià)至關(guān)重要，進(jìn)行水質(zhì)檢測(cè)，綜合分析水質(zhì)污染狀況，對(duì)于保證各行業(yè)用水及生活用水的質(zhì)量有很重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。除了在生產(chǎn)，運(yùn)輸過程中化學(xué)物質(zhì)的泄漏，污染物在飲用水源地的直接排放等因素外，飲用水相關(guān)材料中有害物質(zhì)的溶出也是一個(gè)重要原因。日常飲用水相關(guān)材料中有較大比例是有機(jī)制品，在常溫或高溫下長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)導(dǎo)致部分有機(jī)物質(zhì)滲入飲用水中。這些物質(zhì)具有三個(gè)顯著的特點(diǎn)一是大多數(shù)是非極性有機(jī)物；二是濃度極低，一般為 ng μ g/L級(jí)，但是濃度低并不代表毒性小，有很多有機(jī)物有很強(qiáng)的積累性或具有致癌、致畸、致突變的效應(yīng)，對(duì)人體健康造成巨大的隱患；三是種類繁多，多種污染物之間可能存在協(xié)同、加合或拮抗等作用，雖然每種污染物的濃度都在安全濃度之內(nèi)，多種污染物一起也可能對(duì)人體造成危害。因此為了檢測(cè)這種情況下污染物對(duì)人體的危害程度，需要檢測(cè)方法滿足兩個(gè)方面的要求一是靈敏度要高，否則難以檢測(cè)低濃度的污染物；二是能判斷多種污染物的綜合毒性。因此根據(jù)目前的發(fā)展方向，常用的水質(zhì)檢測(cè)方法包括化學(xué)法、儀器法和生物法。化學(xué)分析法是以化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，分為稱量分析法和滴定分析法兩種。儀器分析法則分為光學(xué)分析法、電化學(xué)分析法和色譜分析法三種。在水質(zhì)檢測(cè)分析中， 化學(xué)分析法和儀器分析法中的光學(xué)分析法、電化學(xué)分析法屬于常規(guī)分析方法，主要用于物理指標(biāo)和金屬指標(biāo)的測(cè)定，而有機(jī)物的測(cè)定主要依靠色譜法進(jìn)行。近年來，由于色譜新技術(shù)的不斷出現(xiàn)以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)的發(fā)展，能同時(shí)對(duì)污染物進(jìn)行分離、定性和定量檢測(cè)，使色譜法成為飲用水中有機(jī)物檢測(cè)的主要方法之一?；瘜W(xué)法可以快速準(zhǔn)確地判斷污染物的濃度，但首先要預(yù)測(cè)水樣中可能含有的污染物質(zhì)，然后對(duì)其進(jìn)行定量分析。而飲用水中化學(xué)物質(zhì)種類繁多，要全部分析檢測(cè)這些污染物成分，工作量巨大，通常較難測(cè)定。同時(shí)， 兩種或多種污染物之間可能存在協(xié)同作用、相加作用、獨(dú)立作用或拮抗作用。因此化學(xué)法和儀器法無法滿足評(píng)價(jià)有機(jī)污染物綜合毒性的要求。而生物檢測(cè)法是一種有效的飲用水綜合安全評(píng)價(jià)手段。污染物對(duì)生物體的毒性作用可發(fā)生在個(gè)體、細(xì)胞及分子水平上。個(gè)體水平的生物毒性評(píng)價(jià)常用的指示生物包括微生物、藻類、大型蚤、魚類和哺乳動(dòng)物。前幾種生物與人類的同源性較低，難以較為準(zhǔn)確地反應(yīng)毒物對(duì)人體的影響。同時(shí)生物體是一個(gè)有機(jī)的整體，生物體本身的排毒、解毒、免疫等能力， 有時(shí)可能會(huì)掩蓋污染物對(duì)機(jī)體造成的影響，機(jī)體的活力、外在表現(xiàn)可能未出現(xiàn)異常，但實(shí)際上機(jī)體內(nèi)部的組織、器官可能已出現(xiàn)損傷，這種情況下就難以靈敏地檢測(cè)有毒物質(zhì)的存在。 因此需要建立一種快速、經(jīng)濟(jì)的生物檢測(cè)方法，代替活的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于毒性實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞毒性檢測(cè)的方法應(yīng)運(yùn)而生。
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細(xì)胞毒性主要表現(xiàn)為增殖速度、代謝產(chǎn)物的變化以及形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變等。通過檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞的存活與死亡等作為檢測(cè)指標(biāo)的方法有中性紅吸收法、MTT比色法、蛋白含量測(cè)定法、臺(tái)盼藍(lán)排斥法、乳酸脫氫酶酶活測(cè)定法、ATP含量測(cè)定法、蛋白質(zhì)和 DNA合成測(cè)定法、氧化壓力法等。這些方法可以對(duì)污染物的細(xì)胞毒性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，但是它們本身也存在靈敏度不高的缺點(diǎn)，難以滿足對(duì)微量有機(jī)物的毒性進(jìn)行判斷的要求。通過觀察細(xì)胞形態(tài)的變化只能定性判斷污染物毒性，如果觀察到細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞不再貼壁，細(xì)胞器變形等現(xiàn)象時(shí)，說明細(xì)胞受到毒物作用。Vero細(xì)胞變形法是其中的一種，該方法是上世紀(jì)90年代，英國(guó)建立的一種用于飲用水及相關(guān)材料綜合安全評(píng)價(jià)的生物檢測(cè)法-Vero細(xì)胞變形法(BS6920 Suitability of water and non-metalic products for use in contact with water intended for human consumption with regard to their effect on the qualith of the water-Section 25，British Standards Insistution，1992)。該方法原理是利用來源于非洲綠猴腎臟的Vero細(xì)胞在正常情況下生長(zhǎng)時(shí)呈不規(guī)則三角形狀，而在含一定濃度有害化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)則由三角形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形的特點(diǎn)來判斷飲用水及相關(guān)材料的綜合安全性(材料的安全性評(píng)價(jià)通過測(cè)定材料浸泡液的綜合生物毒性)。 Vero細(xì)胞變形法的靈敏度較高，可以檢測(cè)低濃度污染物的水體，同時(shí)Vero細(xì)胞與人體高度同源，檢測(cè)時(shí)間僅需48h，因此該方法是一種理想的飲用水綜合安全評(píng)價(jià)手段。但Vero細(xì)胞變形法也有其不足之處，該方法的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是通過低倍顯微鏡直接觀察生長(zhǎng)細(xì)胞的形狀變化，缺乏一個(gè)嚴(yán)格的科學(xué)定量標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)際操作中感性指標(biāo)判斷的準(zhǔn)確性往往受到質(zhì)疑(特別是污染物濃度處于臨界狀態(tài)下)，導(dǎo)致該方法不能作為一個(gè)最終的評(píng)價(jià)手段，一般只作為一種毒性初篩的手段，在全球范圍未得到廣泛推廣(我國(guó)也未將該方法列為標(biāo)準(zhǔn)方法)。污染導(dǎo)致的最初反應(yīng)是從分子相互作用開始的，因此分子生物標(biāo)志物直接反映外來理化因素與細(xì)胞靶分子，特別是生物大分子如核酸和蛋白質(zhì)的相互作用及其后果，因而具有較高的敏感性。不過分子標(biāo)志物判斷污染物毒性也有不足之處。在現(xiàn)階段的研究中， 研究者的工作多集中在單一化合物和單一暴露途徑的風(fēng)險(xiǎn)問題，但實(shí)際中生物往往暴露于來自多重途徑的多種化合物的綜合影響。同時(shí)，不同的分子標(biāo)志物比較專一，普適性不高， 例如有些只能用于檢測(cè)重金屬污染，有些只能反映DNA損傷情況。而細(xì)胞與分子標(biāo)志物相比，更能反映出多種污染物對(duì)生物的綜合毒性效應(yīng)，有更高的普適性。綜上所述，要判斷污染物的綜合毒性，細(xì)胞水平的判斷更為敏感且普適性更高。 但通過檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞的存活與死亡等作為檢測(cè)指標(biāo)的方法的敏感度不足以判斷微量污染物的毒性，而細(xì)胞變形法的靈敏度雖然高，但難以定量判斷。因此需要找到一種基于細(xì)胞水平、靈敏度高、且能夠?qū)ξ⒘糠菢O性有機(jī)污染物的毒性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法。研究表明細(xì)胞變形可能是細(xì)胞膜受損的宏觀表征，因此根據(jù)膜損傷的原理設(shè)計(jì)基于Vero細(xì)胞的定量毒性分析技術(shù)是一個(gè)發(fā)展方向(Tingting Liao, Sensitivity of morphological change of Vero cells exposed to lipophilic compounds and its mechanism. Journal of Hazardous Materials, 2010, Vol. 179 :1055 1064)。事實(shí)上乳酸脫氫酶法(LDH)也是一種基于細(xì)胞膜受損的方法，其原理是細(xì)胞膜受損后，細(xì)胞會(huì)釋放LDH 到培養(yǎng)基中。然而，LDH的分子量是140，OOODa,當(dāng)LDH釋放時(shí)表示細(xì)胞已經(jīng)嚴(yán)重受損，所以 LDH的釋放意味著不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，LDH法和MTT法的靈敏度相似(Putnam K P, Bombick D W, Doolittle DJ. Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate. Toxicology in Vitro, 2002, Vol. 16(5) :599 607 ；Repetto G, JosA, Hazen M J, et al. A test battery for the ecotoxicological evaluation of pentachlorophenol. Toxicology in Vitro,2001, Vol. 15(4 5) 503 509)。而碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染料——一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑，其分子量小，只有668. 4Da，不能透過完整的細(xì)胞膜，但可能在細(xì)胞膜受損程度很小時(shí)即可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并與核酸結(jié)合，所以PI染色法可能要比LDH法更靈敏。PI染料能穿過破損的細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染色，釋放紅色熒光。PI在綠色光(540nm波長(zhǎng))的激發(fā)下，會(huì)在600nm處發(fā)出明亮的熒光，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合的PI發(fā)出的熒光與未結(jié)合的PI相比，強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)20-30倍。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的是提供一種微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，該方法靈敏度高。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了一種微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟1)配制含有非極性有機(jī)污染物的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基；2)采用步驟1)配制的培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行受試；3)受試后，除去培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入PI (碘化丙啶)染液，于暗處室溫下
孵育；4)將孵育后細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PI染液吸出，測(cè)所吸出的PI染液的熒光度；通過計(jì)算PI攝入率來判斷細(xì)胞膜的受損程度，進(jìn)而判斷非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性大小。所述的非極性有機(jī)污染物選自2，4，6-三氯苯酚或全氟辛烷磺?；衔镏械囊环N或兩種。所述的非極性有機(jī)污染物的濃度為O 50mg/L的培養(yǎng)基。所述的步驟2)的受試包括以下步驟將Vero細(xì)胞以IO4 IO6個(gè)/mL的密度接種到培養(yǎng)皿中，加入步驟1)所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 Mh。所述的步驟3)包括以下步驟加入1 5mL濃度為10 100 μ g/mL的PI染液， 每個(gè)培養(yǎng)皿中加入的PI染液量一致，于暗處室溫下孵育10 20min。所述的步驟幻中加入PI染液前進(jìn)一步包括用磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)沖洗細(xì)胞的步驟。所述的步驟4)包括以下步驟將PI染液分別加入96孔板中，100 200 μ L/孔， 用酶標(biāo)儀測(cè)其熒光度，其中酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm。所述的PI攝入率計(jì)算公式如下各濃度污染物受試細(xì)胞，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的 PI染液的比例；PI 攝入率=[(U0-U) /U0] X 100%無細(xì)胞空白時(shí)的PI的熒光值為Utl，未進(jìn)入細(xì)胞的剩余PI量的熒光值為U。本發(fā)明的原理如下PI染液無法透過完整的細(xì)胞膜，但可以透過受損的細(xì)胞膜，已有研究表明非極性有機(jī)物導(dǎo)致Vero細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，因此進(jìn)入細(xì)胞的PI染液的量越多，即未進(jìn)入細(xì)胞的PI染液的量越少，說明細(xì)胞膜受損程度越嚴(yán)重，進(jìn)而說明非極性有機(jī)物的細(xì)胞毒性越強(qiáng)。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)法和儀器法僅能對(duì)飲用水中事先預(yù)測(cè)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定量判斷，而本發(fā)明的測(cè)定方法——PI染色法可以評(píng)價(jià)微量非極性有機(jī)污染物的綜合毒性。2、本發(fā)明的測(cè)定方法是評(píng)價(jià)非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性，與個(gè)體水平的生物毒性評(píng)價(jià)方法相比，具有更快速、經(jīng)濟(jì)，以及采用的Vero細(xì)胞與人類高度同源的優(yōu)點(diǎn)。3、本發(fā)明的測(cè)定方法與現(xiàn)有技術(shù)中的評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的測(cè)定方法相比，Vero細(xì)胞變形法僅能定性表征有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性，難以定量，而PI染色法可以定量評(píng)價(jià)；常用的基于細(xì)胞增殖抑制的方法(如MTT法)的靈敏度更適用于判斷污染物的半致死劑量，而PI 染色法的靈敏度更高，特別適用于評(píng)價(jià)微量非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性，彌補(bǔ)了 MTT法的不足；因此PI染色法可以應(yīng)用于一種或多種非極性有機(jī)污染物的毒性檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明方法測(cè)得的經(jīng)不同濃度的TCP受試后Vero細(xì)胞的PI攝入率。圖2為MTT方法測(cè)定的TCP對(duì)Vero細(xì)胞增殖的抑制率。圖3為本發(fā)明方法測(cè)得的經(jīng)不同濃度的PFOS受試后Vero細(xì)胞的PI攝入率。圖4為MTT方法測(cè)定的PFOS對(duì)Vero細(xì)胞增殖的抑制率。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖所示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明中，選取了兩種典型的非極性有機(jī)污染物2，4，6_三氯苯酚(TCP)和全氟辛烷磺?；衔?PF0Q進(jìn)行測(cè)試，目的是為了更好地說明本發(fā)明的方法，而并不受其限制。TCP是一種非極性有機(jī)物，難溶于水，易溶于酒精和乙醚等有機(jī)溶劑。TCP是一種重要的化工原料，普遍用作除草劑、木材的防腐劑、殺菌劑、溶劑、熱交換劑等。TCP是一種持久性有機(jī)物(POPs)和內(nèi)分泌干擾素(EDCs)的代表物質(zhì)，有蓄積作用，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。TCP具有較大的生物毒性，被人體吸入或經(jīng)皮膚吸收可引起頭痛、疲倦、眼睛和皮膚的刺激癥狀、神經(jīng)痛、呼吸困難、肝腎損害等，屬于三致物質(zhì)，已被我國(guó)國(guó)家環(huán)?？偩至腥雰?yōu)先控制污染物黑名單。TCP已在水體、土壤及木材中被普遍檢測(cè)到，而且有報(bào)道指出85%的TCP在使用后被排入水體，對(duì)水生生物產(chǎn)生危害。PFOS是一種典型的兩性分子，既具有疏水性，也具有疏油性，所以被廣泛應(yīng)用于防水劑、防油劑、防塵劑和防脂劑(如用于織物、皮革、紙張、包裝、毛皮和地毯)及表面活性劑等各種用途中。不粘鍋、食品包裝袋的內(nèi)表面、部分洗發(fā)劑、沐浴露、肥皂、洗滌劑中均含有 PFOS0 PFOS具有極強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，即使在硝酸或硫酸中煮沸，C-F鍵也不會(huì)斷裂，熱解溫度高達(dá)1200°C。目前環(huán)境中還未發(fā)現(xiàn)PFOS自然降解的跡象，人體內(nèi)PFOS的半衰期長(zhǎng)達(dá)14 天。試驗(yàn)研究表明，PFOS可以在有機(jī)生物體內(nèi)聚積。水生食物鏈生物對(duì)PFOS有較強(qiáng)的富積作用，通過食物鏈向包括人類在內(nèi)的高位生物轉(zhuǎn)移。PFOS可引起生物各個(gè)層次的效應(yīng)，包括動(dòng)物繁殖與生育能力的降低，幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育延緩，肝組織受損，甲狀腺功能的改變等。大量的研究發(fā)現(xiàn)，PFOS具有遺傳毒性、生殖和生育毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾作用等多種毒性，被認(rèn)為是一類具有全身多器臟毒性的化學(xué)污染物。實(shí)施例中所用的PBS溶液配制方法8g NaCl,0. 2g KClU. 44g Na2HPO4和0. 24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7· 4， 加水定容至1L。實(shí)驗(yàn)材料與儀器UVero (CCL-81)細(xì)胞由杭州遠(yuǎn)方生物科技有限公司提供；2、MEM培養(yǎng)基粉末，新生牛血清和胰酶由美國(guó)GIBCO公司提供；3、MTT粉劑來自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；4、2，4，6_三氯苯酚(TCP)單標(biāo)購(gòu)自美國(guó)SUPELC0公司；PFOS購(gòu)于Sigma公司；5、PI染料粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于雙蒸水中至終濃度為50μ g/ml，分裝后儲(chǔ)藏于-20°C，三個(gè)月之內(nèi)用完；6、酶標(biāo)儀采用Bio-RAD公司Model 550型酶標(biāo)儀；7、96孔板選用加拿大G&H公司標(biāo)準(zhǔn)孔板。細(xì)胞培養(yǎng)步驟將Vero細(xì)胞以3X IO4個(gè)/mL的濃度接種到Φ IOOmm的培養(yǎng)皿中，用血清濃度為7% (ν/ν)的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，血清濃度為2% (ν/ν)的培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)， penicillin (100IU/mL)(青霉素)and str印tomycin (鏈霉素)(100g/mL)，置于 37°C，二氧化碳濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中維持生長(zhǎng)。實(shí)施例1 TCP對(duì)Vero細(xì)胞的毒性測(cè)試步驟1)TCP溶于DMSO (二甲基亞砜)中，配成200mg化―1的母液儲(chǔ)存，然后用生長(zhǎng)培養(yǎng)基將母液稀釋到不同濃度，配成含TCP濃度分別為0，1，2. 5，5，7. 5，10，12. 5，15，20mg/ L的培養(yǎng)基；步驟2)將Vero細(xì)胞從Φ 100mm的培養(yǎng)皿中消化下來，以4X IO5個(gè)/mL的密度接種到Φ60πιπι的培養(yǎng)皿中，加入含有0，1，2. 5，5，7. 5，10，12. 5，15，20mg/L的TCP培養(yǎng)基，細(xì)胞孵育Mh。步驟3)受試后，除去培養(yǎng)基，并用PBS溶液洗細(xì)胞三次，然后在每皿中加入ImL的 PI染液(50 μ g/mL)，于暗處室溫下孵育IOmin。步驟4)將孵育后細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PI染液分別吸出，移至ImL的離心管中，將離心管中的PI染液分別加入96孔板中(100 μ L/孔)。用酶標(biāo)儀測(cè)熒光度，激發(fā)波長(zhǎng)為530nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為620nm，每個(gè)污染物濃度作三個(gè)平行樣。步驟5)無細(xì)胞空白時(shí)的PI的熒光值為U。，未進(jìn)入細(xì)胞的剩余PI量的熒光值為U, 各濃度污染物受試細(xì)胞后，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的PI染液的比例，可用以下公式求出PI 攝入率=[(Utl-U)/U。] X 100%圖1為本發(fā)明方法測(cè)得的經(jīng)不同濃度的TCP受試后Vero細(xì)胞的PI攝入率。如附圖1所示，PI攝入率隨著TCP (2. 5-lOmg/L)濃度的升高而增大，說明在TCP的作用下細(xì)胞膜受損。當(dāng)TCP的濃度分別大于10mg/L時(shí)，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的PI量反而減少，這是因?yàn)樵谖廴疚锔邼舛认?，污染物?duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，因此測(cè)得的進(jìn)入細(xì)胞的PI量反而減少。比較例1為了將本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的方法的靈敏度進(jìn)行對(duì)照比較，我們還同時(shí)做了細(xì)胞增殖抑制率分析(MTT比色實(shí)驗(yàn))，MTT法是用來檢測(cè)污染物毒性的傳統(tǒng)方法，可作為現(xiàn)有的檢測(cè)細(xì)胞毒性的技術(shù)方法的代表。實(shí)驗(yàn)步驟如下以1 X IO5個(gè)/mL的密度將Vero細(xì)胞接種到96孔板，加生長(zhǎng)培養(yǎng)基至120 μ L。培養(yǎng)過夜后分別換成含不同濃度TCP污染物(0-80mg/L)的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度作6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，設(shè)對(duì)照(含0. 001 % DMS0/0. 5 %乙醇)，空白(不含細(xì)胞)。培養(yǎng)4 后加入20 μ LMTT溶液，放置4h，輕輕吸去培養(yǎng)板各孔溶液，加入120 μ L酸化異丙醇，震蕩IOmin或放置40min， 用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，650nm為參比波長(zhǎng)，做了三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。其中MTT溶液實(shí)驗(yàn)前用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)溶液新鮮配制，濃度為5mg/mL，過濾除菌后，4°C避光保存，保存時(shí)間不超過2周。圖2為MTT方法測(cè)定的TCP對(duì)Vero細(xì)胞增殖的抑制率。TCP的濃度從30mg/L變化到80mg/L，細(xì)胞增殖抑制率從17. 增長(zhǎng)到74. 8%。然而，當(dāng)污染物的濃度較低時(shí)，MTT 的結(jié)果不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)負(fù)值，即污染物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這是不合理的。這說明 MTT法不適合檢測(cè)TCP在低濃度下的毒性，更適合判斷污染物的半致死率。實(shí)施例2PFOS對(duì)Vero細(xì)胞的毒性的測(cè)試步驟1)將PFOS溶于雙蒸水中，配成IOmM的母液，然后用生長(zhǎng)培養(yǎng)基將母液稀釋到不同濃度，配成含PFOS濃度分別為0，10，15，20，25，30，40，50mg/L的培養(yǎng)基；步驟2)將Vero細(xì)胞從Φ IOOmm的培養(yǎng)皿中消化下來，以4Χ IO5個(gè)/mL的密度接種到Φ60mm的培養(yǎng)皿中，加入含有0，10，15，20，25，30，40，50mg/L的PFOS培養(yǎng)基，細(xì)胞孵育 24h。步驟3)受試后，除去培養(yǎng)基，并用PBS溶液洗細(xì)胞三次，然后在每皿中加入ImL的 PI染液(50 μ g/mL)，于暗處室溫下孵育IOmin。步驟4)將孵育后細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PI染液分別吸出，移至ImL的離心管中，將離心管中的PI染液分別加入96孔板中(100 μ L/孔)。用酶標(biāo)儀測(cè)熒光度，激發(fā)波長(zhǎng)為530nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為620nm，每個(gè)污染物濃度作三個(gè)平行樣。步驟5)無細(xì)胞空白時(shí)的PI的熒光值為Utl，未進(jìn)入細(xì)胞的剩余PI量的熒光值為U, 各濃度污染物受試細(xì)胞后，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的PI染液的比例，可用以下公式求出PI 攝入率=[(U0-U)/UJ X 100%圖3為本發(fā)明方法測(cè)得的經(jīng)不同濃度的PFOS受試后Vero細(xì)胞的PI攝入率。PI 攝入率隨著PF0S(10-25mg/L)濃度的升高而增大，說明在PFOS的作用下細(xì)胞膜受損。當(dāng) PFOS的濃度分別大于25mg/L時(shí)，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的PI量反而減少，這是因?yàn)樵谖廴疚锔邼舛认?，污染物?duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，因此測(cè)得的進(jìn)入細(xì)胞的PI量反而減少。比較例2
為了將本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的方法進(jìn)行對(duì)照比較，我們還同時(shí)做了細(xì)胞增殖抑制率分析(MTT比色實(shí)驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)步驟如下以1 X IO5個(gè)/mL的密度將Vero細(xì)胞接種到96孔板，加生長(zhǎng)培養(yǎng)基至120 μ L。培養(yǎng)過夜后分別換成含不同濃度PFOS污染物(0-250mg/L)的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度作6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，設(shè)對(duì)照(含0. 001 % DMS0/0. 5 %乙醇)，空白(不含細(xì)胞)。培養(yǎng)4 后加入20 μ LMTT溶液，放置4h，輕輕吸去培養(yǎng)板各孔溶液，加入120 μ L酸化異丙醇，震蕩IOmin或放置40min， 用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，650nm為參比波長(zhǎng)，做了三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。圖4為MTT方法測(cè)定的PFOS對(duì)Vero細(xì)胞增殖的抑制率。PFOS的濃度從50mg/L 變化到250mg/L，細(xì)胞增殖抑制率從21. 9%增長(zhǎng)到83. 5%。然而，當(dāng)污染物的濃度較低時(shí)， MTT的結(jié)果不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)負(fù)值，即污染物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這是不合理的。這說明MTT法不適合檢測(cè)TCP或PFOS在低濃度下的毒性，更適合判斷污染物的半致死率。通過PI染色法和MTT法的結(jié)果比較，可以發(fā)現(xiàn)PI染色法要比MTT法更靈敏。在低濃度范圍內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的PI量與污染物的濃度變化一致，即隨著污染物濃度的上升，進(jìn)入細(xì)胞的PI值增多。而由MTT法得到的細(xì)胞增殖抑制率在污染物低濃度時(shí)卻上下波動(dòng)，不能準(zhǔn)確反映污染物對(duì)細(xì)胞的毒性大小。因此，對(duì)于低濃度的有機(jī)污染物，PI染色法是一種比MTT法靈敏的毒性檢測(cè)方法。PI染色法與MTT法的結(jié)果不同，可能是因?yàn)閮煞N方法檢測(cè)細(xì)胞毒性的原理不同。 PI染色法是判斷細(xì)胞膜的受損程度，而MTT法是檢測(cè)活細(xì)胞體內(nèi)線粒體脫氫酶的活性。而細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)胞抵御外來物質(zhì)入侵的第一道屏障，它比線粒體的功能更容易受到影響，這就可以解釋為什么PI染色法比MTT法更靈敏。上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)配制含有非極性有機(jī)污染物的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基；2)采用步驟1)配制的培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行受試；3)受試后，除去培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入PI染液，于暗處室溫下孵育；4)將孵育后細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PI染液吸出，測(cè)所吸出的PI染液的熒光度；通過計(jì)算PI 攝入率來判斷細(xì)胞膜的受損程度，進(jìn)而判斷非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的非極性有機(jī)污染物選自2，4，6_三氯苯酚或全氟辛烷磺?；衔镏械囊环N或兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的非極性有機(jī)污染物的濃度為O 50mg/L的培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的步驟幻的受試包括以下步驟將Vero細(xì)胞以IO4 IO6個(gè)/mL的密度接種到培養(yǎng)皿中，加入步驟1)所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 Mh。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的步驟3)包括以下步驟加入1 5mL濃度為10 100 μ g/mL的PI染液，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入的PI染液量一致，于暗處室溫下孵育10 20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的步驟幻中加入PI染液前，進(jìn)一步包括用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的步驟4)包括以下步驟將PI染液分別加入96孔板中，100 200 μ L/孔，用酶標(biāo)儀測(cè)其熒光度，其中酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，其特征在于 所述的PI攝入率計(jì)算公式如下各濃度污染物受試細(xì)胞，PI攝入率即進(jìn)入細(xì)胞的PI染液的比例；PI 攝入率=[(U0-U) /U0] X 100%無細(xì)胞空白時(shí)的PI的熒光值為Utl，未進(jìn)入細(xì)胞的剩余PI量的熒光值為U。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種使用Vero細(xì)胞檢測(cè)微量非極性有機(jī)污染物毒性的定量檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟1)配制含有非極性有機(jī)污染物的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基；2)采用步驟1)配制的培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行受試；3)受試后，除去培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入PI染液，于暗處室溫下孵育；4)將孵育后細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PI染液吸出，測(cè)所吸出的PI染液的熒光度；通過計(jì)算PI攝入率來判斷細(xì)胞膜的受損程度，進(jìn)而判斷非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性大小。使用本發(fā)明的方法靈敏度高于常用的基于細(xì)胞增殖抑制率的細(xì)胞毒性測(cè)定方法-MTT法。本發(fā)明的測(cè)定方法特別適用于評(píng)價(jià)微量非極性有機(jī)污染物的細(xì)胞毒性，彌補(bǔ)了MTT法的不足。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102505037SQ20111032800
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者付小花, 廖婷婷, 王磊, 賈入文, 賈建偉, 陳金海 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)