專利名稱：基于非損傷微測技術(shù)的水稻生理性青枯病評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻生理性青枯病的評價方法，具體涉及一種基于非損傷微測技術(shù)的水稻生理性青枯病評價方法。
背景技術(shù)：
水稻青枯病是水稻常見病害，多發(fā)生于水稻育苗期及晚水稻灌水稻灌漿期，癥狀表現(xiàn)為葉片卷曲萎蔫，葉片水分含量下降，青灰色，莖稈干癟柔軟。水稻生理性青枯病的發(fā)生多由于生理性失水所致，另外土層淺、肥力不夠、缺氮肥也容易導(dǎo)致水稻生理性青枯病的發(fā)生。水稻發(fā)生生理性青枯病時根系枯黃、根生長緩慢，因此，作為吸收水分及營養(yǎng)的主要器官其吸收功能下降，尤其是對無機(jī)離子的吸收表現(xiàn)最為明顯，因此，檢測評價水稻生長期間根系對無機(jī)離子的吸收情況可以判別是否會發(fā)生水稻生理性青枯病。以往分析植物材料中無機(jī)離子含量時都是通過前處理，然后利用原子吸收光譜法檢測離子含量，如，王寶山等對小麥葉片中Na+、K+離子含量的測定就采用了原子吸收光譜法(王寶山，趙可夫小麥葉片中Na，K提取方法的比較植物生理學(xué)通訊[J]. 1995，31(1)50-52)；陳貴桂林等研究NaCl對白刺離子含量影響時也采用了原子吸收光譜法(陳貴林，王晨霞，陳建英NaCl脅迫對白刺試管苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及離子含量的影響西北植物學(xué)報[J]. 2009,6 :1233-1239)；董桃杏等檢測茉莉酸甲酯對水稻葉片無機(jī)離子含量的影響時也采用了原子吸收光譜法，以上方法對于檢測特定時間點(diǎn)材料中的離子含量是非常有效的，但是對離子進(jìn)出植物材料的動態(tài)檢測是無法實(shí)現(xiàn)的(董桃杏，蔡昆爭酸甲酯對水稻葉片質(zhì)膜透性及無機(jī)離子含量的影響華北農(nóng)學(xué)報[J].2010，25(l)起止頁碼136-140)。非損傷微測技術(shù)(Non-InvasiveMicro-Test ^Technology，NMT)，是通過微電極和微傳感器獲取離子和分子的信號，基于Nernst方程和Fick' s第一擴(kuò)散定律計算離子和分子的濃度和流速的技術(shù)，可獲得10-12mol/Cm2.S數(shù)量級的離子流信號，該技術(shù)能夠以對被測材料無損檢測的的方式在細(xì)胞、器官、組織外周測量進(jìn)出的離子或分子的運(yùn)動速率、方向及濃度信息等。這種技術(shù)主要應(yīng)用在植物學(xué)、動物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域。2011年澳大利亞的Siabala等人報道了用馬鈴薯病毒X(Potatc) virusX，PVX)侵染煙草，并暴露在氧化脅迫中，用非損傷性離子流檢測技術(shù)(non-invasive ionflux measuring technique, MIFE)測定了 Ca2+和K+流速，結(jié)合藥理學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法研究了植物整體的適應(yīng)性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)病毒對植物的抗逆性具有重要的作用(Plant，Cell andEnvironment, 2011, 34 :406-417)。非損傷微測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)動態(tài)、不間斷的對植物材料的檢測，從而發(fā)現(xiàn)植物材料在不同環(huán)境及外界因素影響下的離子轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，從而判斷植物所處的狀態(tài)。非損傷微測技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對植物材料無損、動態(tài)離子流的測量。Chen等利用非損傷微測技術(shù)檢測了 NaCl處理下的小麥K+動態(tài)離子流，通過該種方法篩選耐鹽性小麥品禾中(Chen Ζ.，Newman I.，Zhou Μ.，Mendham N.，Zhang G. Shabala S :Screening plantsfor salt tolerance by measuring K+flux -.a case study for barley [J]. Plant, Cell&Environment，2005，28 :1230-1246) ；Shabala等利用非損傷微測技術(shù)研究鹽脅迫下Ca2+對擬南芥耐鹽性的影響時發(fā)現(xiàn)不同濃度的外源Ca2+調(diào)節(jié)的NaCl引起的擬南芥根部K+外流(Shabala S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ,Davies JM, NewmanIA :Extracellular Ca2+ameIiorates NaCl-induced K+Ioss from Arabidopsisroot andleaf cells by controlling plasma membrane K+-permeable channels [J]. PlantPhysiol,2006,141(4) :1653-1665)。目前對植物病害評價報道很少，申請?zhí)枴?00910192176”的中國專利用香蕉組培苗接種香蕉鐮刀菌枯萎病(fusarium wilt)，接種對天，按照0_6級的病害評價等級對單株生根試管苗進(jìn)行病害等級鑒定；申請?zhí)枴?01010164237”的中國專利在室內(nèi)條件下以一定數(shù)量的接種體在水稻特定生育期接種待測水稻一定時間，培養(yǎng)待測水稻至發(fā)病顯癥后，根據(jù)病害發(fā)生的嚴(yán)重度評價待測水稻對水稻黑條矮縮病的抗性水平，而水稻生理性青枯病發(fā)生的評價至今未見公開。

發(fā)明內(nèi)容
為克服目前尚無水稻生理性青枯病有效評價方法的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種高效、快速、準(zhǔn)確的水稻生理性青枯病評價方法。本發(fā)明所述的水稻生理性青枯病評價方法采用非損傷微測技術(shù)檢測水稻苗根部無機(jī)離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態(tài)的水稻苗即為發(fā)生了生理性青枯病，所述無機(jī)離子為K+、NH4\ Ca2+中的一種或兩種以上。在非損傷微測技術(shù)檢測植物離子流時，通常，植物體對離子的外排，即離子由植物體流向測試液稱為外流；相反地，植物體對離子的吸收，即離子由測試液流向植物體則稱為內(nèi)流。所述非損傷微測技術(shù)中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。所述水稻苗為2葉1心期水稻苗，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 50 μ m處。所述評價方法進(jìn)一步包括以下步驟(1)向微電極末端灌入測試離子灌充液至充滿所述電極尖端0. 8 1. 5cm，再將所述電極的前端吸入測試離子的液體離子交換劑；(2)將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡20 50min，再用校正后的電極對待測水稻苗進(jìn)行檢測10 20min ；(4)對檢測結(jié)果進(jìn)行處理和分析。步驟(1)所述電極的前端吸入液體離子交換劑的長度為K+::150 -200 μ m
NH4+ 30 -、50 μ m ；
Ca2+ 10 -、30 μ m。 步驟⑴所述灌充液為
K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。步驟( 所述的校正液通常與測試緩沖液的成分相似，由低濃度校正液和高濃度校正液組成，具體為K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0· 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后電極的Nerst方程計算理想值是K+:55 60mV;NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。步驟(3)所述的測試緩沖液為K+或 Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2、0· 05 0. 15mMNH4Cl。所述K+離子流的流速為3 IOpmol. cm"2, s4，NH4+離子流的流速為100 150pmol.cm_2. Ca2+ 離子流的流速為 50 IOOpmol. cm_2. s—1。非損傷微測技術(shù)(^T)是以無損、活體、動態(tài)實(shí)時監(jiān)測的方式獲得進(jìn)出水稻根系的凈離子濃度、流速及方向信息的技術(shù)。將水稻沖洗根至干凈后置于測試液中利用該技術(shù)測試水稻根部無機(jī)離子的離子流，通過無機(jī)離子流的變化規(guī)律可評價生理性青枯病的發(fā)生。K+在植物體內(nèi)參與多種代謝途徑，調(diào)控細(xì)胞的膨壓，參與離子運(yùn)輸調(diào)控，因此正常水稻苗對K+是吸收的，而青枯病苗K+處于明顯的外排；NH4+作為植物氮素吸收的主要形式對于植物的生長發(fā)育都很重要，氮元素參與機(jī)體內(nèi)各種代謝途徑，尤其在蛋白質(zhì)的合成中是必須的無機(jī)元素，正常水稻苗對NH4+是吸收的，而青枯病苗NH4+處于明顯的外排；鈣是植物必須的營養(yǎng)元素，同時也是植物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第二信使，正常水稻苗對Ca2+是吸收的，而青枯病苗Ca2+則處于明顯的外排。因此，K+、NH4+或Ca2+的吸收和外排可作為判別水稻是否發(fā)生了生理性青枯病的依據(jù)。生理性青枯病苗中K+、NH4+、Ca2+等無機(jī)離子在流向發(fā)生變化的同時，其流速也與正常稻苗有很大的不同，因此，在明確的測試條件下，離子流速也可作為判斷水稻苗是否發(fā)生了生理性青枯病的依據(jù)之一。本發(fā)明的另一項技術(shù)方案是提供了非損傷微測技術(shù)在評價水稻生理性青枯病中的用途。本發(fā)明所述的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對水稻生理性青枯病的無損、活體、快速檢測，發(fā)病水稻苗與正常水稻苗凈離子流對比明顯，檢測一個樣本只需要幾分鐘最多十幾分鐘，耗時短；相對于感官識別的評價方法，檢測準(zhǔn)確性高?？傊?，本發(fā)明所述的檢測方法簡單、可靠，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明所述評價方法的流程圖；圖加是生理性青枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(實(shí)時流速)；圖2b是生理性青枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(平均流速)；圖3a是生理性青枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(實(shí)時流速)；圖北是生理性青枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(平均流速)；圖如是生理性青枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(實(shí)時流速)；圖4b是生理性青枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(平均流速)；其中，圖h、3a3a中縱坐標(biāo)為離子流速，單位為pmol. cm_2. s—1，橫坐標(biāo)為時間，單位為s ；圖2b、3b、4b中縱坐標(biāo)為離子流速，單位為pmol. cm—2· s\
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。1、秧苗培養(yǎng)材料及培養(yǎng)條件為水稻品種龍粳沈(由黑龍江省農(nóng)科院佳木斯水稻研究所提供)，種子經(jīng)過曬種3天，鹽水04斤食鹽/100斤水)篩選后，20°C浸種2天，25°C催芽1天，播種在育苗秧盤中，土壤營養(yǎng)土 = 3 1，施底肥硫酸銨(1斤/1000斤土壤)和磷酸二銨O斤/1000斤土壤)，自然光照，溫度在25-30°C，培養(yǎng)地點(diǎn)在國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心溫室，秧苗在2葉1心時青枯病開始發(fā)生，此時開始離子流檢測。2、儀器及耗材離子流檢測用非損傷微測系統(tǒng)(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)，軟件imFlux，微電極采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3、試劑及溶液(1)液態(tài)離子交換劑(LIX)K+ :Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, M063103, USA ；NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103,USA ；Ca2+ Calcium ionophore I-cocktail A ;Sigma_Aldrich, Louis, M063103, USA。(2)測試緩沖液離子流測試時，測試不同的離子需要不同的測試液，如下K+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMESNH4+離子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM KCl、0· ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMES(3)電極灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2
(4)校正液K+ 離子0. ImM 和 ImM KClNH4+ 離子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM 和 ImM CaCl24、操作方法從電極末端灌入Icm左右的相應(yīng)測試離子的灌充液至電極尖端充滿，電極前端吸入適當(dāng)長度(K+ 180 μ m、NH4+ :40 μ m、Ca2+ :20 μ m)的液體離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應(yīng)的校正液中校正，其Nerst方程計算理想值分別是K+、NH4+ :58mV，Ca2+ J9mV。測試前，水稻苗測試材料在相應(yīng)的測試緩沖液中平衡30min，然后在距離水稻根尖分生區(qū)(距離根尖400 μ m左右)表面30 μ m的地方振動檢測，每個樣品檢測IOmin。5、數(shù)據(jù)處理離子流處理基于Fick擴(kuò)散定律，并通過在線軟件MageFluX-3D Ion FluxPlotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)計算得出。由 4 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析，利用EXcel2003分析作圖。6、結(jié)果分析由圖加和圖2b可以看出，正常水稻苗K+處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-50. 3pmol.cm-2. S"1 ；發(fā)生生理性青枯病水稻苗K+處于明顯的外流狀態(tài)，平均流速為5. 4pmol. cm_2. s—1。由圖3a和圖北可以看出，正常水稻苗的NH4+處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-118. 57pmol. cm—2, s—1 ；發(fā)生生理性青枯病的水稻苗的NH4+處于外流狀態(tài)，平均流速為123. 78pmol. cm 2· s 1O由圖如和圖4b可以看出，正常的水稻苗的Ca2+處于內(nèi)流狀態(tài)，平均流速為-105. 68pmol. cm_2. s—1，發(fā)生生理性青枯病的水稻苗Ca2+處于外流狀態(tài)，平均流速為86. 6 lpmol. cm 2. s 1O根據(jù)幾種離子中的一種或多種流向方向可以判斷出水稻苗是否發(fā)生了生理性青枯病。雖然上文中已經(jīng)用一般性說明具體實(shí)施方式
及實(shí)驗(yàn)，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種水稻生理性青枯病的評價方法，其特征在于，采用非損傷微測技術(shù)檢測水稻苗根部無機(jī)離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態(tài)的水稻苗即為發(fā)生了生理性青枯病，所述無機(jī)離子為K+、NH4+、Ca2+中的一種或兩種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評價方法，其特征在于，所述非損傷微測技術(shù)中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評價方法，其特征在于，所述水稻苗為2葉1心期水稻苗，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 50 μ m處。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的評價方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極末端灌入測試離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1. 5cm，再將所述電極的前端吸入測試離子的液體離子交換劑；(2)將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡20 50min，再用校正后的電極對待測水稻苗進(jìn)行檢測10 20min ；(4)對檢測結(jié)果進(jìn)行處理和分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述電極的前端吸入液體離子交換劑的長度為K+ 150 ~ 200 μ m ；NH4+ :30 50μπι ；Ca2+ 10 30 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述灌充液為K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(2)所述的校正液為K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后電極的能斯特方程計算理想值為K+ 55 60mV ；NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(3)所述的測試緩沖液為K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mMNaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMNH4Cl。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評價方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為3 IOpmol.cm_2. S^NH4+離子流的流速為100 150pmol. cm_2. Ca2+離子流的流速為50 IOOpmol.-2 -1cm . s ο
10.非損傷微測技術(shù)在評價水稻生理性青枯病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻生理性青枯病的快速評價方法，所述方法采用非損傷微測技術(shù)檢測水稻苗根部無機(jī)離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態(tài)的水稻苗即為發(fā)生了生理性青枯病，所述無機(jī)離子為K+、NH4+、Ca2+中的一種或兩種以上。本發(fā)明還提供了非損傷微測技術(shù)在檢測水稻生理性青枯病中的用途。本發(fā)明所述的評價檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對水稻生理性青枯病的無損、活體、快速檢測，發(fā)病水稻苗與正常水稻苗凈離子流對比明顯，檢測一個樣本只需要幾分鐘最多十幾分鐘，耗時短；相對于感官識別的評價方法，檢測準(zhǔn)確性高。本發(fā)明所述的檢測方法簡單、可靠，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/416GK102393416SQ201110246849
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者于春花, 侯佩臣, 侯瑞鋒, 潘大宇, 王成, 王曉冬, 高權(quán) 申請人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心