專利名稱：一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。
背景技術(shù)：
微生物可以產(chǎn)生特有的代謝產(chǎn)物和代謝譜，這是它本身特點(diǎn)的一部分，鑒定其產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的種類和特點(diǎn)，即可確定某種微生物的存在，從而可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生某種具有生理活性物質(zhì)的微生物。紫杉醇是一種對(duì)腫瘤有抑制作用的化合物，其抗癌機(jī)理獨(dú)特，對(duì)多類癌癥都有特殊的療效。近年來，紫杉醇已經(jīng)成為最熱點(diǎn)的天然植物藥物研究領(lǐng)域之一。目前臨床上使用的紫杉醇主要來源于紅豆杉屬植物，但含量很低，而且紅豆杉屬植物生長(zhǎng)緩慢，天然更新能力弱，資源十分有限。藥源不足已成為限制紫杉醇在臨床中大量應(yīng)用的瓶頸。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極研究開發(fā)紫杉醇的新藥源。目前的方法主要有紅豆杉人工栽培、尋找紅豆杉的替代植物、化學(xué)全合成和半合成、組織與細(xì)胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵等途徑，并積極探索研究取得了巨大的進(jìn)展。其中微生物發(fā)酵法具有較大的潛在優(yōu)勢(shì)，不僅是開發(fā)紫杉醇的新藥源，而且可以保護(hù)自然資源和生態(tài)環(huán)境，因此具有巨大的生態(tài)環(huán)境效益和良好的開發(fā)前景。但是從眾多的微生物資源中篩選出產(chǎn)生紫杉醇菌株的工作不僅繁瑣，而且更需要一個(gè)準(zhǔn)確科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法，以免假陽性菌的出現(xiàn)。在現(xiàn)有產(chǎn)紫杉醇菌的鑒定方法中，高效液相色譜的樣品檢測(cè)液中的紫杉醇是通過將薄層色譜法的初步鑒定方法中得到的以與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)處的Icm2正方形面積的硅膠刮取下來得到的，操作不方便，紫杉醇回收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法中存在用于高效液相色譜檢測(cè)的紫杉醇制取困難，并且紫杉醇回收率低的問題，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。本發(fā)明產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的一、供鑒定溶液的制備將微生物發(fā)酵培養(yǎng)物過濾得微生物菌體和過濾液，然后將微生物菌體粉碎，得到能經(jīng)過20目標(biāo)準(zhǔn)篩的破碎微生物菌體，然后用乙酸乙酯提取，再過濾得到微生物菌體乙酸乙酯提取液；將過濾液用乙酸乙酯萃取3次，再將萃取液合并得過濾液乙酸乙酯萃取液，然后將微生物菌體乙酸乙酯提取液和過濾液乙酸乙酯萃取液合并得總乙酸乙酯提取液，然后向總乙酸乙酯提取液中加入無水硫酸鈉脫水，得到微生物培養(yǎng)物無水乙酸乙酯提取液，即為供鑒定溶液，其中用于提取的乙酸乙酯的體積與破碎微生物菌體重量的比例為IOmL lg，過濾液與萃取劑乙酸乙酯的體積比為1 1;二、初步鑒定取步驟一制備得到的供鑒定溶液，按體積比為500 1的比例將供鑒定溶液濃縮，得到樣品液，然后取紫杉醇溶液作為對(duì)照品溶液，然后將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積一致，以環(huán)己烷、異丙醇和甲醇按體積比為30 1 1的比例混合的混合溶液作為展開劑，展層至薄層板上端1厘米處，然后取出晾干，然后再用濃度為的香草醛濃硫酸溶液(Ig香草醛溶解至IOOmL濃硫酸中得到的)噴板顯色；三、與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的微生物進(jìn)行確認(rèn)鑒定a、樣品檢測(cè)液的制備取該微生物步驟一中制備得到的供鑒定溶液，首先讓供鑒定溶液流過裝有吸附劑的帶有篩板的柱子，然后用乙酸乙酯洗滌吸附劑后，負(fù)壓抽干，再用洗脫液對(duì)吸附劑進(jìn)行洗脫處理得洗脫液，然后將洗脫液在低于50°C條件下蒸干得固形物， 再將固形物用2mL乙腈溶液溶解得到樣品檢測(cè)液，其中，吸附劑為氨基鍵合硅膠，洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比5 9 1的比例混合的混合溶液，吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯溶液體積的比例為Ig 200 IOOOmL,吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 1 20mL ；b、確認(rèn)鑒定采用高效液相色譜法進(jìn)行，以苯基柱為高效液相柱，以乙腈和雙蒸水按體積比4 6的比例混合的混合溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為lmL/min，量取 a步驟中制備得到的樣品檢測(cè)液，上樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品出現(xiàn)與紫杉醇對(duì)照品高效液相色譜譜圖上一致的物質(zhì)峰，即可確認(rèn)此微生物為產(chǎn)紫杉醇微生物。本發(fā)明步驟三中樣品在某時(shí)間有明顯的物質(zhì)峰出現(xiàn)，并且和紫杉醇對(duì)照品出峰時(shí)間一致，說明樣品檢測(cè)液中含有紫杉醇，即可作為該微生物是產(chǎn)紫杉醇微生物株的最終確認(rèn)判定。本發(fā)明在步驟三中可以繪制對(duì)照品溶液(紫杉醇溶液)的以紫杉醇濃度為橫坐標(biāo)，紫杉醇出峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算出樣品檢測(cè)液中紫杉醇的含量，進(jìn)而推
算出紫杉醇產(chǎn)量。本發(fā)明步驟三的高效液相色譜法確認(rèn)鑒定的進(jìn)行，是以步驟二的薄層色譜法初步鑒定中以與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)為前提的。步驟二初步鑒定中，與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，初步說明供鑒定溶液可能存在紫杉醇；若與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則說明供鑒定溶液一定不存在紫杉醇，則無需進(jìn)行步驟三的確認(rèn)鑒定。本發(fā)明步驟三的b步驟中上樣檢測(cè)時(shí)的上樣量依據(jù)具體使用的高效液相色譜儀上的定量環(huán)而定。本發(fā)明中所用到的乙酸乙酯均為無水乙酸乙酯。本發(fā)明步驟三中b步驟的高效液相色譜法精密度高，穩(wěn)定性好，加樣回收率合格， 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較好。采用步驟三中b步驟的高效液相色譜法對(duì)步驟三中a步驟得到同一樣品檢測(cè)液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定紫杉醇峰面積，計(jì)算RSD (相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)為1. 5%，精度高。 對(duì)步驟三中a步驟得到同一樣品檢測(cè)液在他之內(nèi)每隔Ih進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定紫杉醇峰面積，計(jì)算RSD為1.4%，表明方法穩(wěn)定性良好。本發(fā)明是一種簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)較少的產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。本發(fā)明在初步鑒定中采用體積比為30 1 1的環(huán)己烷、異丙醇和甲醇混合的混合溶液作為展開劑，使得顯色后紫杉醇藍(lán)色斑點(diǎn)不易擴(kuò)散，藍(lán)色更易觀察，與雜質(zhì)分離得更好。本發(fā)明在確認(rèn)鑒定中，采用將供鑒定溶液進(jìn)行先吸附再洗脫的方法制備樣品檢測(cè)液，制備速度快，紫杉醇的制取簡(jiǎn)便快捷，回收率高。


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圖1是具體實(shí)施方式
十一的步驟三中的紫杉醇對(duì)照品(lmg/mL)的高效液相色譜譜圖；圖2是具體實(shí)施方式
十一的步驟三中樣品檢測(cè)液的高效液相色譜譜圖；圖3是具體實(shí)施方式
十二的步驟三中的紫杉醇對(duì)照品(lmg/mL)的高效液相色譜譜圖；圖4是具體實(shí)施方式
十二的步驟三中樣品檢測(cè)液的高效液相色譜譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的一、供鑒定溶液的制備將微生物發(fā)酵培養(yǎng)物過濾得微生物菌體和過濾液，然后將微生物菌體粉碎，得到能經(jīng)過20目標(biāo)準(zhǔn)篩的破碎微生物菌體，然后用乙酸乙酯提取，再過濾得到微生物菌體乙酸乙酯提取液；將過濾液用乙酸乙酯萃取3次，再將萃取液合并得過濾液乙酸乙酯萃取液，然后將微生物菌體乙酸乙酯提取液和過濾液乙酸乙酯萃取液合并得總乙酸乙酯提取液，然后向總乙酸乙酯提取液中加入無水硫酸鈉脫水，得到微生物培養(yǎng)物無水乙酸乙酯提取液，即為供鑒定溶液，其中用于提取的乙酸乙酯的體積與破碎微生物菌體重量的比例為IOmL lg，過濾液與萃取劑乙酸乙酯的體積比為1 1;二、初步鑒定取步驟一制備得到的供鑒定溶液，按體積比為500 1的比例將供鑒定溶液濃縮，得到樣品液，然后取紫杉醇溶液作為對(duì)照品溶液，然后將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積一致，以環(huán)己烷、異丙醇和甲醇按體積比為30 1 1的比例混合的混合溶液作為展開劑，展層至薄層板上端1厘米處，然后取出晾干，然后再用濃度為的香草醛濃硫酸溶液(Ig香草醛溶解至IOOmL濃硫酸中得到的)噴板顯色；三、與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的微生物進(jìn)行確認(rèn)鑒定a、樣品檢測(cè)液的制備取該微生物步驟一中制備得到的供鑒定溶液，首先讓供鑒定溶液流過裝有吸附劑的帶有篩板的柱子，然后用乙酸乙酯洗滌吸附劑后，負(fù)壓抽干，再用洗脫液對(duì)吸附劑進(jìn)行洗脫處理得洗脫液，然后將洗脫液在低于50°C條件下蒸干得固形物， 再將固形物用2mL乙腈溶液溶解得到樣品檢測(cè)液，其中，吸附劑為氨基鍵合硅膠，洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比5 9 1的比例混合的混合溶液，吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯溶液體積的比例為Ig 200 IOOOmL,吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 1 20mL ；b、確認(rèn)鑒定采用高效液相色譜法進(jìn)行，以苯基柱為高效液相柱，以乙腈和雙蒸水按體積比4 6的比例混合的混合溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為lmL/min，量取 a步驟中制備得到的樣品檢測(cè)液，上樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品出現(xiàn)與紫杉醇對(duì)照品高效液相色譜譜圖上一致的物質(zhì)峰，即可確認(rèn)此微生物為產(chǎn)紫杉醇微生物。本實(shí)施方式步驟二中所述硅膠G薄層板為市售產(chǎn)品。本實(shí)施方式步驟二中取步驟一制備得到的供鑒定溶液，按體積比為500 1的比例將供鑒定溶液濃縮，其中所述濃縮的方法如下在低于50°C條件下負(fù)壓濃縮。本實(shí)施方式是一種簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)較少的產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。 本實(shí)施方式在初步鑒定中采用體積比為30 1 1的環(huán)己烷、異丙醇和甲醇混合的混合溶液作為展開劑，使得顯色后紫杉醇藍(lán)色斑點(diǎn)不易擴(kuò)散，藍(lán)色更易觀察，與雜質(zhì)分離得更好。本實(shí)施方式在確認(rèn)鑒定中，采用將供鑒定溶液進(jìn)行先吸附再洗脫的方法制備樣品檢測(cè)液，制備速度快，紫杉醇的制取簡(jiǎn)便快捷，回收率高。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中紫杉醇溶液 (對(duì)照品溶液)的濃度為lmg/mL。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟二中將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積一致，為20 μ L。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。本實(shí)施方式步驟二中所述硅膠G薄層板為市售產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三不同的是步驟三的a步驟中吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯體積的比例為Ig 300 800mL。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三不同的是步驟三的a步驟中吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯體積的比例為Ig 500mL。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟三的a步驟中吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 3 10mL。其它步驟及參數(shù)與
具體實(shí)施例方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟三的a步驟中吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 5mL。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟三的a步驟中洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比5. 7 1(即85 1 的比例混合的混合溶液。 其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟三的b步驟中所述苯基柱的規(guī)格為長(zhǎng)250mm，直徑4. 6mm，粒徑5 μ m。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至九之一不同的是步驟三中還可以繪制對(duì)照品溶液(紫杉醇溶液)的以紫杉醇濃度為橫坐標(biāo)，紫杉醇出峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算出樣品檢測(cè)液中紫杉醇的含量，進(jìn)而推算出紫杉醇產(chǎn)量。其它步驟及參數(shù)具體實(shí)施方式
一至九之一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式為產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的一、供鑒定溶液的制備將IL榛屬植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物過濾得20g 菌體和IL過濾液，然后將菌體粉碎，得到能經(jīng)過20目標(biāo)準(zhǔn)篩的破碎菌體，然后用200mL乙酸乙酯提取，再經(jīng)過濾得到菌體乙酸乙酯提取液；將IL過濾液用乙酸乙酯萃取3次，再將萃取液合并得過濾液乙酸乙酯萃取液，然后將菌體乙酸乙酯提取液和過濾液乙酸乙酯萃取液合并得3. 2L總乙酸乙酯提取液，然后向總乙酸乙酯提取液中加入無水硫酸鈉脫水，得到 3. IL榛屬植株分離純化的純菌株培養(yǎng)物無水乙酸乙酯提取液，即為供鑒定溶液，其中過濾液與萃取劑乙酸乙酯的體積比為1:1;二、初步鑒定取500mL步驟一制備得到的供鑒定溶液，然后將供鑒定溶液濃縮， 得到ImL濃縮的供鑒定溶液(即為樣品液)，然后取紫杉醇溶液作為對(duì)照品溶液，然后將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積為20yL，以環(huán)己烷、異丙醇和甲醇按體積比為30 1 1的比例混合的混合溶液作為展開劑，展層至薄層板上端1厘米處，然后取出晾干，然后再用濃度為的香草醛濃硫酸溶液(Ig香草醛溶解至IOOmL濃硫酸中得到的)噴板顯色；三、與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的微生物進(jìn)行確認(rèn)鑒定a、樣品檢測(cè)液的制備取200mL該微生物步驟一中制備得到的供鑒定溶液，首先讓供鑒定溶液流過裝有Ig吸附劑的帶有篩板的柱子，然后用乙酸乙酯洗滌吸附劑后，負(fù)壓抽干，再用5mL洗脫液對(duì)吸附劑進(jìn)行洗脫處理得洗脫液，然后將洗脫液在50°C條件下蒸干得固形物，然后將固形物用2mL乙腈溶液溶解得到2mL樣品檢測(cè)液，其中，吸附劑為氨基鍵合硅膠，洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比85 15混合的混合溶液；b、確認(rèn)鑒定采用高效液相色譜法進(jìn)行，以苯基柱為高效液相柱，以乙腈和雙蒸水按體積比4 6的比例混合的混合溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為lmL/min，量取 20μ L a步驟中制備得到的樣品檢測(cè)液，上樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品出現(xiàn)與紫杉醇對(duì)照品高效液相色譜譜圖上一致的物質(zhì)峰，即可確認(rèn)此微生物為產(chǎn)紫杉醇微生物。本實(shí)施方式步驟二初步鑒定結(jié)果為與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)了藍(lán)色斑點(diǎn)，進(jìn)行了步驟三的操作。本實(shí)施方式中步驟三中的紫杉醇對(duì)照品(lmg/mL)的高效液相色譜譜圖如圖1所示，在25. 342min處出現(xiàn)紫杉醇物質(zhì)峰。步驟三中樣品檢測(cè)液的高效液相色譜譜圖如圖2 所示，在25.367min處出現(xiàn)物質(zhì)峰。分析圖1和圖2可知，本實(shí)施方式中樣品檢測(cè)液在和紫杉醇對(duì)照品出峰時(shí)間一致的時(shí)間有明顯的物質(zhì)峰出現(xiàn)，說明樣品檢測(cè)液中含有紫杉醇，即確認(rèn)鑒定該榛屬植株分離純化的純菌株為產(chǎn)紫杉醇微生物。本實(shí)施方式同時(shí)繪制出紫杉醇對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算出紫杉醇的產(chǎn)量，為每升發(fā)酵液中含20. 5 μ g紫杉醇。本實(shí)施方式步驟一中榛屬植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物是通過以下操作得到的從榛屬植株分離純化的純菌株接于種子培養(yǎng)基(20%馬鈴薯水煮液汁IOOmL,蔗糖 2g，pH 6.5，28瓊脂)，觀1培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)接于裝有2001^發(fā)酵培養(yǎng)基(20%馬鈴薯水煮液汁100ml，蔗糖2g，pH 6. 5)的500ml三角瓶中，28°C，180r/min，搖瓶培養(yǎng)7天，得到榛屬植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物。本實(shí)施方式步驟二中所述硅膠G薄層板為市售產(chǎn)品。本實(shí)施方式步驟二中紫杉醇溶液(對(duì)照品溶液)的濃度為lmg/mL。本實(shí)施方式步驟三的b步驟中所述苯基柱的規(guī)格為長(zhǎng)250mm，直徑4. 6mm，粒徑 5 μ m0本實(shí)施方式中所用到的乙酸乙酯均為無水乙酸乙酯。本實(shí)施方式是一種簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)較少的產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。 本實(shí)施方式在初步鑒定中采用體積比為30 1 1的環(huán)己烷、異丙醇和甲醇混合的混合溶液作為展開劑，使得顯色后紫杉醇藍(lán)色斑點(diǎn)不易擴(kuò)散，藍(lán)色更易觀察，與雜質(zhì)分離得更好。本實(shí)施方式在確認(rèn)鑒定中，采用將供鑒定溶液進(jìn)行先吸附再洗脫的方法制備樣品檢測(cè)液， 制備速度快，紫杉醇的制取簡(jiǎn)便快捷，回收率高。本實(shí)施方式步驟三中b步驟的高效液相色譜法科學(xué)有效，以紫杉醇對(duì)照品計(jì)算理論塔板數(shù)為9500，紫杉醇峰對(duì)稱因子為1. 8，紫杉醇峰與最近峰的分離因子為1. 02。精密度高，穩(wěn)定性好，加樣回收率合格，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較好(R2 = 0. 9996)。采用步驟三中b步驟的高效液相色譜法對(duì)步驟三中a步驟得到同一樣品檢測(cè)液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定紫杉醇峰面積，計(jì)算RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)為1.5%，精度高。對(duì)步驟三中a步驟得到同一樣品檢測(cè)液在
之內(nèi)每隔Ih進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定紫杉醇峰面積，計(jì)算RSD為1.4%，表明方法穩(wěn)定性良好。本實(shí)施方式中按步驟三a的制備方法，得到4份2mL樣品檢測(cè)液(其濃度已經(jīng)過步驟三的b步驟準(zhǔn)確得到)，分別向4份2mL樣品檢測(cè)液中加入0. 05mg、0. lmg、0. 2mg和0. 3mg 的紫杉醇，并均定容得樣品液。其中紫杉醇以紫杉醇溶液(lmg/mL)的形式加入。將樣品液按步驟三的b步驟中的高效液相色譜法進(jìn)行上樣檢測(cè)，平行測(cè)定3次，由測(cè)定的峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算測(cè)定量，求出回收率。結(jié)果見表一。表一
紫杉醇加入量(mg)回收率(％)RSD (%)0.05100.10.260.1098.60.330.2097.90.290.3099.70.40由表一數(shù)據(jù)可知，加樣回收率合格。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式為產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的一、供鑒定溶液的制備將IL紅豆杉植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物過濾得 IOg菌體和IL過濾液，然后將菌體粉碎，得到能經(jīng)過20目標(biāo)準(zhǔn)篩的破碎菌體，然后用IOOmL 乙酸乙酯提取，再過濾得到菌體乙酸乙酯提取液；將IL過濾液用乙酸乙酯萃取3次，再將萃取液合并得過濾液乙酸乙酯萃取液，再將菌體乙酸乙酯提取液和過濾液乙酸乙酯萃取液合并得3. IL總乙酸乙酯提取液，然后向總乙酸乙酯提取液中加入無水硫酸鈉脫水，得到3L紅豆杉植株分離純化的純菌株培養(yǎng)物無水乙酸乙酯提取液，即為供鑒定溶液，其中用于提取的乙酸乙酯的體積與破碎微生物菌體重量的比例為IOmL lg，過濾液與萃取劑乙酸乙酯的體積比為1:1;二、初步鑒定取500mL步驟一制備得到的供鑒定溶液，然后將供鑒定溶液濃縮， 得到ImL濃縮的供鑒定溶液(即為樣品液)，然后取紫杉醇溶液作為對(duì)照品溶液，然后將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積為50yL，以環(huán)己烷、異丙醇和甲醇按體積比為30 1 1的比例混合的混合溶液作為展開劑，展層至薄層板上端1厘米處，然后取出晾干，然后再用濃度為的香草醛濃硫酸溶液(Ig香草醛溶解至IOOmL濃硫酸中得到的)噴板顯色；三、與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的微生物進(jìn)行確認(rèn)鑒定a、樣品檢測(cè)液的制備取500mL該微生物步驟一中制備得到的供鑒定溶液，首先讓供鑒定溶液流過裝有Ig吸附劑帶有篩板的的柱子，然后用乙酸乙酯溶液洗滌吸附劑后，
9負(fù)壓抽干，然后再用5mL洗脫液對(duì)吸附劑進(jìn)行洗脫處理得洗脫液，然后將洗脫液在30°C條件下蒸干得固形物，然后將固形物用2mL乙腈溶液溶解得到2mL樣品檢測(cè)液，其中，吸附劑為氨基鍵合硅膠，洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比85 15混合的混合溶液；b、確認(rèn)鑒定采用高效液相色譜法進(jìn)行，以苯基柱為高效液相柱，以乙腈和雙蒸水按體積比4 6的比例混合的混合溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為lmL/min，量取 20μ L a步驟中制備得到的樣品檢測(cè)液，上樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品出現(xiàn)與紫杉醇對(duì)照品高效液相色譜譜圖上一致的物質(zhì)峰，即可確認(rèn)此微生物為產(chǎn)紫杉醇微生物。本實(shí)施方式步驟二初步鑒定結(jié)果為與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)了藍(lán)色斑點(diǎn)，進(jìn)行了步驟三的操作。本實(shí)施方式中步驟三中的紫杉醇對(duì)照品(lmg/mL)的高效液相色譜譜圖如圖3所示，在19. 892min處出現(xiàn)紫杉醇物質(zhì)峰。步驟三中樣品檢測(cè)液的高效液相色譜譜圖如圖4 所示，在19.942min處出現(xiàn)相應(yīng)的物質(zhì)峰。分析圖3和圖4可知，本實(shí)施方式中樣品在和紫杉醇對(duì)照品出峰時(shí)間一致的時(shí)間有明顯的物質(zhì)峰出現(xiàn)，說明樣品檢測(cè)液中含有紫杉醇，即確認(rèn)鑒定該紅豆杉植株分離純化的純菌株為產(chǎn)紫杉醇微生物株。本實(shí)施方式同時(shí)繪制出紫杉醇對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算出紫杉醇的產(chǎn)量，15. 7 μ g/mL0本實(shí)施方式步驟一中紅豆杉植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物是通過以下操作得到的將從紅豆杉植株分離純化的純菌株接于種子培養(yǎng)基(20%馬鈴薯水煮液汁100ml， 蔗糖2g，pH 6. 5，2g瓊脂)，培養(yǎng)3天，然后再轉(zhuǎn)接于裝有200ml發(fā)酵培養(yǎng)基(20%馬鈴薯水煮液汁100ml，蔗糖2g，pH 6. 5)的500ml三角瓶中，28°C，180r/min，搖瓶培養(yǎng)7天，得到紅豆杉植株分離純化的純菌株發(fā)酵培養(yǎng)物。本實(shí)施方式步驟二中所述硅膠G薄層板為市售產(chǎn)品。本實(shí)施方式步驟二中紫杉醇溶液(對(duì)照品溶液)的濃度為lmg/mL。本實(shí)施方式步驟三的b步驟中所述苯基柱的規(guī)格為長(zhǎng)250mm，直徑4. 6mm，粒徑 5 μ m0本實(shí)施方式中所用到的乙酸乙酯均為無水乙酸乙酯。本實(shí)施方式是一種簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)較少的產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法。 本實(shí)施方式在初步鑒定中采用體積比為30 1 1的環(huán)己烷、異丙醇和甲醇混合的混合溶液作為展開劑，使得顯色后紫杉醇藍(lán)色斑點(diǎn)不易擴(kuò)散，藍(lán)色更易觀察，與雜質(zhì)分離得更好。 本實(shí)施方式在確認(rèn)鑒定中，采用將供鑒定溶液進(jìn)行先吸附再洗脫的方法制備樣品檢測(cè)液， 制備速度快，紫杉醇的制取簡(jiǎn)便快捷，回收率高。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的一、供鑒定溶液的制備將微生物發(fā)酵培養(yǎng)物過濾得微生物菌體和過濾液，然后將微生物菌體粉碎，得到能經(jīng)過20目標(biāo)準(zhǔn)篩的破碎微生物菌體，然后用乙酸乙酯提取，再經(jīng)過濾得到微生物菌體乙酸乙酯提取液；將過濾液用乙酸乙酯萃取3次，再將萃取液合并得過濾液乙酸乙酯萃取液，然后再將微生物菌體乙酸乙酯提取液和過濾液乙酸乙酯萃取液合并得總乙酸乙酯提取液，然后向總乙酸乙酯提取液中加入無水硫酸鈉脫水，得到微生物培養(yǎng)物無水乙酸乙酯提取液，即為供鑒定溶液，其中用于提取的乙酸乙酯的體積與破碎微生物菌體重量的比例為IOmL lg，過濾液與萃取劑乙酸乙酯的體積比為1 1;二、初步鑒定取步驟一制備得到的供鑒定溶液，按體積比為500 1的比例將供鑒定溶液濃縮，得到樣品液，然后取紫杉醇溶液作為對(duì)照品溶液，然后將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積一致，以環(huán)己烷、 異丙醇和甲醇按體積比為30 1 1的比例混合的混合溶液作為展開劑，展層至薄層板上端1厘米處，然后取出晾干，然后再用濃度為的香草醛濃硫酸溶液噴板顯色；三、與紫杉醇對(duì)照品Rf值相同部位上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的微生物進(jìn)行確認(rèn)鑒定a、樣品檢測(cè)液的制備取該微生物步驟一中制備得到的供鑒定溶液，首先讓供鑒定溶液流過裝有吸附劑的帶有篩板的柱子，然后用乙酸乙酯洗滌吸附劑后，負(fù)壓抽干，再用洗脫液對(duì)吸附劑進(jìn)行洗脫處理得洗脫液，然后將洗脫液在低于50°C條件下蒸干得固形物，再將固形物用2mL乙腈溶液溶解得到樣品檢測(cè)液，其中，吸附劑為氨基鍵合硅膠，洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比5 9 1的比例混合的混合溶液，吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯溶液體積的比例為Ig 200 IOOOmL,吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 1 20mL ；b、確認(rèn)鑒定采用高效液相色譜法進(jìn)行，以苯基柱為高效液相柱，以乙腈和雙蒸水按體積比4 6的比例混合的混合溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為lmL/min，量取a步驟中制備得到的樣品檢測(cè)液，上樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品出現(xiàn)與紫杉醇對(duì)照品高效液相色譜譜圖上一致的物質(zhì)峰，即可確認(rèn)此微生物為產(chǎn)紫杉醇微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟二中紫杉醇溶液的濃度為lmg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟二中將樣品液和對(duì)照品溶液并列點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上進(jìn)行層析，控制樣品液與對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣體積一致，為20 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三的 a步驟中吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯體積的比例為Ig 300 800mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三的 a步驟中吸附劑質(zhì)量與乙酸乙酯體積的比例為Ig 500mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三的 a步驟中吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 3 10mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三的 a步驟中吸附劑質(zhì)量與洗脫液體積的比例為Ig 5mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三的a步驟中洗脫液為乙酸乙酯和無水乙醇按體積比5. 7 1的比例混合的混合溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，其特征在于步驟三中繪制對(duì)照品溶液的以紫杉醇濃度為橫坐標(biāo)，紫杉醇出峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算出樣品檢測(cè)液中紫杉醇的含量，進(jìn)而推算出紫杉醇產(chǎn)量。
全文摘要
一種產(chǎn)紫杉醇微生物的鑒定方法，涉及產(chǎn)紫杉醇微生物鑒定方法。解決現(xiàn)有產(chǎn)紫杉醇微生物鑒定方法中存在用于高效液相色譜檢測(cè)的紫杉醇制取困難，并且紫杉醇回收率低的問題。鑒定方法首先制備供鑒定溶液，然后將部分供鑒定溶液濃縮后進(jìn)行薄層色譜法初步鑒定，初步確定含有紫杉醇后，再進(jìn)行高效液相色譜法確認(rèn)鑒定，并最終確定是否為產(chǎn)紫杉醇微生物。本發(fā)明簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)少。本發(fā)明在初步鑒定中采用的展開劑，使得顯色后紫杉醇藍(lán)色斑點(diǎn)不易擴(kuò)散，藍(lán)色更易觀察，與雜質(zhì)分離得更好。在確認(rèn)鑒定中，采用將供鑒定溶液進(jìn)行先吸附再洗脫的方法制備樣品檢測(cè)液，制備速度快，紫杉醇的制取簡(jiǎn)便快捷，回收率高。
文檔編號(hào)G01N30/14GK102175801SQ20111004641
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者劉利群, 金濤 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)