專利名稱：α1-抗胰蛋白酶多克隆抗體及其應(yīng)用和所用多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α 1-抗胰蛋白酶(α Ι-antitrypsin，α 1-ΑΤ)是由肝臟產(chǎn)生的一種糖蛋白，是人類血漿中最重要的蛋白酶抑制劑，能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽酶，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、 凝血酶、血漿素、胰蛋白酶等，它占血漿總蛋白酶抑制能力的90%以上。α 1-抗胰蛋白酶的主要作用是保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶的損傷并抑制感染和炎癥，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。而α 1-抗胰蛋白酶缺乏則會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如肝臟硬化。因為部分變異型α -抗胰蛋白酶在合成過程中分泌到血液中，而大部分則在其糖基化過程中停止下來并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上沉積，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，引發(fā)肝臟硬化。原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的惡性腫瘤，總體療效差、死亡率高。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年新發(fā)肝癌病例100萬至150萬例。因為我國是肝炎大國， 居民衛(wèi)生意識和健康意識薄弱，所以我國肝癌發(fā)病人數(shù)占全球的55%，死亡人數(shù)占全球的 45%。由于缺乏較好的早期診斷方法，臨床上發(fā)現(xiàn)多為晚期，因此新的肝癌早期診斷方法的開發(fā)成已成為我國迫切的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于人類的α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體及其制備方法中所用的多肽，以及該α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于制備α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體的多肽，其具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時提供了一種α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體，其利用上述多肽制備而得。作為本發(fā)明的α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體的改進(jìn)多克隆抗體為α 1_抗胰蛋白酶的多克隆抗體。本發(fā)明還同時提供了上述α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體在制備肝癌早期診斷劑中的應(yīng)用。本發(fā)明以SEQ ID NO :1所示的多肽為抗原免疫動物，獲得了多克隆抗體，該多克隆抗體為抗α 1-抗胰蛋白酶的抗體。本發(fā)明所述人α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗體為兔的血清免疫球蛋白IgG，該抗體能特異性識別并結(jié)合α 1-抗胰蛋白酶，可以有效應(yīng)用于檢測α 1-抗胰蛋白酶的多種方法， 如ELISAiesternblot、免疫組織化學(xué)等檢測，通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗證明，α 1_抗胰蛋白酶在肝癌中表達(dá)較癌旁組織中明顯減低。本發(fā)明為了解α -抗胰蛋白酶的功能和它對慢性乙型肝炎發(fā)病的影響提供了重要的研究工具和基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的人α 1-抗胰蛋白酶的親水性、抗原性和表面暴露性分析圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例3的α 1-抗胰蛋白酶的編碼序列電泳圖譜；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的α 1-抗胰蛋白酶-pcDNA 3. IA的酶切鑒定圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的western blot對純化的抗體進(jìn)行鑒定圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例4的肝癌和正常肝組織的免疫組化圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、利用DNA star分析軟件對α 1-抗胰蛋白酶蛋白進(jìn)行分析(圖1)并篩選α 1-抗胰蛋白酶蛋白中一段多肽來制備多克隆抗體，基本原則如下1)、具有較高的親水性，抗原性而且表面暴露性強(qiáng)；2)、避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列；3)、特異性較強(qiáng)的肽段；4)、不形成 α-helix ；5)、抗原多肽的序列長度在8-20個氨基酸殘基之間。篩選出用于制備α 1-抗胰蛋白酶蛋白多克隆抗體的多肽序列為 CENEDRRSASLHLPK(SEQ ID NO. 1)。多肽合成后，經(jīng)SDS-PAGE電泳純化，純度彡90%，并與 KLH(鑰孔嘁血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)。說明如下上述序列中的C是用來多肽交聯(lián)KLH和BSA的，其余序列同α 1-抗胰蛋白酶蛋白中的一段序列。實(shí)施例2、制備α 1-抗胰蛋白酶蛋白的多克隆抗體1)、免疫計劃與方案如下將實(shí)施例1所得的多肽抗原對2只2. 5kg左右的成年雄性新西蘭大白兔分別注射進(jìn)行免疫A.第 1 天，首免500ug 多肽-KLH(500ul)+CFA(弗氏完全佐劑)500ul ；B.第 21 天，二免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA(弗氏不完全佐劑)500ul ；C.第 35 天，三免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第45天，采血樣5ml;D.第 49 天，四免:250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第59天，采兔血25ml，用于多抗制備；E.第 63 天，五免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第73天，采兔血25ml， 用于多抗制備；第77天，處死兔子，放全血，用于多抗制備。2)、多肽特異性親和純化親和純化如常規(guī)操作，相關(guān)試劑和詳細(xì)參數(shù)如下多肽柱貯存4°C;
層析填料Sulfo-Linkcoupling Gel ；多肽交聯(lián)IOmg多肽交聯(lián)填料，L-Cysteine封閉；柱預(yù)處理20ml，50mMPBS PH7. 4，流速 60ml/h ；血清上樣10ml血清，50mM PBS PH7. 4 稀釋至 20ml，流速 30ml/h ；清洗20ml50mMPBS PH7. 4 ；抗體洗脫0.2M Glyciene-HCl，PH3. 0 ；洗滌50mMPBS PH7. 4+0. 02%硫柳汞鈉；最終獲得純化后的血清，用于ELISA檢測。3)、ELISA檢測法對抗體進(jìn)行鑒定A.抗原包被以BSA-多肽作為抗原，以lug/mL的濃度包被，4°C包被過夜。上述BSA-多肽是指將實(shí)施例1中合成的多肽和牛血清白蛋白(BSA)交聯(lián)，用于 ELISA檢測。B.純化的兔多抗以 1 200，1 1000，1 5000，1 10000，1 20000， 1 60000，1 240000的稀釋度稀釋，加樣量為50ul/孔。37°C溫育1小時。C.洗滌用 TBST (Tris-Buffered NaCl Solution with Tween 20)以 200ul/孔洗滌2次。D.加酶標(biāo)二抗羊抗兔HRP以1 5000稀釋使用，37°C溫育45分鐘。E.洗滌用TBST以200ul/孔洗滌2次。F.顯色以IOOul/孔加入TMB顯色液5分鐘。G.讀數(shù)(OD)酶標(biāo)儀測定0D450nm讀數(shù)。結(jié)果0D450值為1. 177(稀釋比例1 60000)，血清效價合格。(本抗體要求為 血清稀釋比例大于1 10000，OD值高于1.0則合格)表1、抗血清效價(0D值)檢測數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種用于制備α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體的多肽，其特征是具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一種α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗體，其特征是利用權(quán)利要求1所述的多肽制備而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗體，其特征是所述多克隆抗體為 α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求2或3所述的α -抗胰蛋白酶多克隆抗體在制備肝癌早期診斷劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于制備α1-抗胰蛋白酶多克隆抗體的多肽，其具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了利用上述多肽制備而得的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗體，該多克隆抗體為α1-抗胰蛋白酶的多克隆抗體。本發(fā)明還同時公開了上述α1-抗胰蛋白酶多克隆抗體在制備肝癌早期診斷劑中的應(yīng)用。α1-抗胰蛋白酶蛋白只有在癌旁組織和正常組織中才有表達(dá)，癌變區(qū)域不表達(dá)。
文檔編號G01N33/574GK102153628SQ20111000726
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者劉東成, 李淑萍, 鄭敏, 陳 峰, 陳智 申請人:浙江大學(xué)