專利名稱：一種經(jīng)濟(jì)的快速篩選水稻高蛋白品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及利用比較1粒水稻種子的橫斷面篩選高蛋白品種進(jìn)行水稻遺傳育種的領(lǐng)域，是一種快速經(jīng)濟(jì)的篩選水稻高蛋白品種的方法。
背景技術(shù)：
目前，分析種子蛋白質(zhì)含量的方法，第一步是提取種子中的蛋白質(zhì)，然后檢測蛋白質(zhì)含量，常用的有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法。實(shí)驗(yàn)過程需要的種子樣品多、配制的試劑多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近紅外光譜測定蛋白質(zhì)含量操作也相對(duì)簡單，但需要的 5g(約250粒)的樣品才能得到較好的結(jié)果。染料吖啶橙的活性基團(tuán)與淀粉的羥基通過靜電作用穩(wěn)定的結(jié)合在一起，在488nm 的激發(fā)光下使細(xì)胞呈綠色熒光。二硫鍵的交聯(lián)作用使蛋白質(zhì)在淀粉的周圍形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 降低了水分向籽粒內(nèi)部滲入的速度，所以在浸泡過程中，高蛋白品種吸收的水分少，細(xì)胞間得不到潤滑，從而在掰斷的過程中，細(xì)胞破裂，形成粗糙的橫斷面，而蛋白含量低的品種，吸收大量水分，細(xì)胞間有水分的潤滑，容易分離，掰斷后形成平滑的橫斷面。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高稻米的營養(yǎng)品質(zhì)，篩選高蛋白品種進(jìn)行遺傳育種是一項(xiàng)重要措施。本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)的快速篩選高蛋白水稻品種的方法，僅需1粒精米，將其掰開染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察其橫斷面結(jié)構(gòu)，根據(jù)其光滑、粗糙程度篩選出高蛋白品種，用于以后的遺傳育種。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是(1)將要檢測的稻米用小型精米機(jī)磨成精米；(2)將利用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量(8-9%左右)的精米作為對(duì)照；(3)從待檢樣品中各隨機(jī)挑選1粒精米作為材料，分別浸泡在裝有蒸餾水的1. 5毫升離心管中3小時(shí)；(4)用鑷子將1粒精米取出，徒手掰至自然斷裂；(5)將斷裂的精米用吖啶橙(0. 02%, ν/ν)染色10分鐘，需避光進(jìn)行，可在錫箔紙包裹的1. 5毫升小離心管中進(jìn)行；(6)用滴管吸取蒸餾水洗1分鐘，也需避光進(jìn)行；(7)將米的切面用雙面膠固定在載玻片上用激光共聚焦顯微鏡觀察其橫斷面，橫斷面粗糙的材料代表蛋白質(zhì)含量高的品種。本發(fā)明的有益效果是，一是不需種植太多的實(shí)驗(yàn)材料，不需配制大量試劑，成本低；二是方法簡單，技術(shù)難度小，容易掌握；三是適宜于篩選水稻高蛋白品種進(jìn)行雜交遺傳育種種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。只需要實(shí)驗(yàn)室有激光共聚焦顯微鏡儀器即可。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。高蛋白粳型恢復(fù)系的篩選。
具體實(shí)施例方式以經(jīng)過凱氏定氮法檢測蛋白質(zhì)含量的日本優(yōu)質(zhì)粳稻品種越光(蛋白質(zhì)含量 6. 48% )作為低蛋白對(duì)照，以蛋白質(zhì)含量為9. 45%的粳型恢復(fù)系m90作為中等蛋白含量的對(duì)照，待測的粳型恢復(fù)系品種暫命名為mll9。三個(gè)品種各隨機(jī)選取1粒精米，浸于1. 5毫升小離心管的蒸餾水中3小時(shí)，徒手將其掰至自然斷裂，避光條件下用吖啶橙(0. 02%, ν/ν) 染色10分鐘，蒸餾水沖洗1分鐘。用尼康ECLIPSE 90i激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，采用 Ar/Kr激光器，激發(fā)光488nm，發(fā)射光為575nm_605nm，NIH Image 1. 6. 2軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。我們注意到越光的橫斷面非常平滑，而mll9的橫斷面非常粗糙，m90的橫斷面粗糙平滑的面積比例相當(dāng)。因此mll9是蛋白質(zhì)含量最高的品種，隨后我們用凱氏定氮法進(jìn)一步驗(yàn)證ml 19蛋白質(zhì)含量高達(dá)13. 30%，證實(shí)此方法行之有效。
權(quán)利要求
1.一種通過觀察1粒水稻精米種子的橫斷面快速判斷其蛋白質(zhì)含量高低的方法，其主要特征是(1)樣品米的狀態(tài)及數(shù)量；(2)樣品的處理；(3)橫斷面的觀察；(4)觀察結(jié)果的分析。
2.根據(jù)權(quán)利1所要求的新方法，其特征是將要檢測的稻米用小型精米機(jī)磨成精米，分別挑選1粒完整的精米作為樣品，其中1份樣品是經(jīng)過凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量在8-9% 作為對(duì)照。
3.根據(jù)權(quán)利1所要求的新方法，其特征是將待測樣品1粒精米分別浸泡在裝有蒸餾水的1. 5毫升離心管中3小時(shí)；用鑷子將1粒精米取出，徒手掰至自然斷裂；將斷裂的精米用吖啶橙(0. 02%, ν/ν)染色10分鐘，需避光進(jìn)行，可在錫箔紙包裹的1.5毫升小離心管中進(jìn)行；用滴管吸取蒸餾水洗1分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利1所要求的新方法，其特征是將米的切面用雙面膠固定在載玻片上用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，采用Ar/Kr激光器，激發(fā)光488nm，發(fā)射光為575nm-605nm。
5.根據(jù)權(quán)利1所要求的新方法，其特征是可用激光共聚焦顯微鏡隨機(jī)帶的圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，對(duì)比觀察精米橫斷面的情況，比對(duì)照樣品的橫斷面粗糙則說明其蛋白含量高，粗糙程度越高蛋白含量越高，反之則蛋白含量低。
全文摘要
遺傳育種領(lǐng)域種質(zhì)資源創(chuàng)新領(lǐng)域一種經(jīng)濟(jì)的快速篩選水稻高蛋白品種的新方法。以經(jīng)過凱氏定氮法檢測蛋白質(zhì)含量在8-9％左右的水稻品種作為中等蛋白質(zhì)含量對(duì)照，從待測品種各隨機(jī)選取1粒精米，浸于1.5毫升小離心管的蒸餾水中3小時(shí)，徒手將其掰至自然斷裂，避光條件下用吖啶橙(0.02％，v/v)染色10分鐘，蒸餾水沖洗1分鐘。用尼康ECLIPSE 90i激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，采用Ar/Kr激光器，激發(fā)光488nm，發(fā)射光為575nm-605nm，NIH Image 1.6.2軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。精米的橫裂面比對(duì)照粗糙的表明蛋白含量比對(duì)照高，粗糙程度越高，蛋白含量越高，反之則蛋白含量低。此方法可用很少的樣品快速篩選水稻的高蛋白品種用于以后的遺傳育種進(jìn)行水稻品質(zhì)改良。
文檔編號(hào)G01N21/17GK102564958SQ20101062254
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者丁毅, 華澤田, 王芳 申請(qǐng)人:天津天隆農(nóng)業(yè)科技有限公司