專利名稱：轉(zhuǎn)基因水稻或其制品檢測(cè)用引物和探針、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn) 基因水稻或其制品檢測(cè)的寡核苷酸引物及探針、試劑盒，用于測(cè)定含有玉米泛素啟動(dòng)子的 轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以及本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針 或試劑盒在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物是指利用生物技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)移到他物種中以改造其遺傳特性， 從而獲得人類所需的性狀、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)而產(chǎn)生的生物新品種。以轉(zhuǎn)基因生物或以其為原料加 工而來(lái)的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。從1994年第一例轉(zhuǎn)基因食品(轉(zhuǎn)基因番茄)在美國(guó)誕生 至今，轉(zhuǎn)基因生物已廣泛用于食品領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因生物的發(fā)展?fàn)顩r國(guó)際國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)、生產(chǎn)蓬勃發(fā)展，通過(guò)基因工程方式培育農(nóng)作物新品 種是目前作物育種的發(fā)展方向，在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高抗性等方面具有巨大潛 力。水稻(Oryza sativa L.)是我國(guó)最大的糧食作物，常年播種面積約為3100萬(wàn)公頃，總 收獲量在2億噸左右，約占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的40%。水稻生產(chǎn)在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉 足輕重的地位。1991年，Christou等用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株，隨后幾年，基因 槍技術(shù)日臻成熟，將各類目的基因?qū)胨精@得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道大量出現(xiàn)。1994年，Hiei 等建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，爪哇稻和秈稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系也 先后建立，逐步達(dá)到實(shí)用的階段，成為水稻轉(zhuǎn)化的主流技術(shù)，先后將水稻基因庫(kù)中不具有的 抗除草劑、抗蟲、抗病、抗病毒、耐鹽、改善稻米品質(zhì)等基因引入商業(yè)水稻品種中。我國(guó)轉(zhuǎn)基 因水稻培育方面也取得了重要成果，已將修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、Bt毒蛋白基因、 雪花蓮?fù)庠茨鼗?、抗菌肽基因和?lái)自野生稻的Xa21基因等抗蟲基因?qū)攵喾N雜交 水稻恢復(fù)系、保持系中，經(jīng)國(guó)家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，十多種轉(zhuǎn)基因水稻品系正在進(jìn)行環(huán)境釋放、中 間試驗(yàn)，其中有2個(gè)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻已獲轉(zhuǎn)基因生物安全證書。目前我國(guó)正在進(jìn)行環(huán)境釋 放、中間試驗(yàn)的多個(gè)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建中含有玉米泛素啟動(dòng)子，故采用泛素啟 動(dòng)子構(gòu)建特異性方法可特異靈敏地檢測(cè)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻。轉(zhuǎn)基因食品的管理要求轉(zhuǎn)基因食品得到廣泛使用，但是轉(zhuǎn)基因作為一種新的生物技術(shù)，其對(duì)人類健康、生 態(tài)平衡的影響，潛在的安全性轉(zhuǎn)基因食品潛在的安全性越來(lái)越成為消費(fèi)者的關(guān)注焦點(diǎn)。2000年聯(lián)合國(guó)通過(guò)了“生物安全議定書”，該議定書對(duì)除了藥物以外的所有進(jìn)出境 活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過(guò)境、審批、檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細(xì)的規(guī)定。世 界上主要國(guó)家立法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理，美國(guó)、加拿大、歐盟、日本、韓國(guó)、澳大利亞、新西 蘭的法律明確規(guī)定，轉(zhuǎn)基因生物需經(jīng)政府批準(zhǔn)，并經(jīng)嚴(yán)格的生物安全、環(huán)境安全測(cè)試才可以 田間種植、環(huán)境釋放及作為食品、飼料，歐盟、日本、韓國(guó)、澳大利亞、新西蘭等要求轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并規(guī)定了相應(yīng)閾值水平。我國(guó)于2001年5月23日頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安 全管理?xiàng)l例》，規(guī)定對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行檢驗(yàn)檢疫。2002年3月20日開始實(shí)行的《農(nóng)業(yè) 轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》也規(guī)定了轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識(shí)制度。對(duì)于執(zhí)行上述聯(lián)合國(guó)及各國(guó) 的法規(guī)措施，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)是關(guān)鍵措施之一，需要通過(guò)定性檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因的種類，鑒 別其是否為已批準(zhǔn)的或已獲準(zhǔn)用于食品飼料，以防止具有風(fēng)險(xiǎn)的未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的任意擴(kuò) 散，對(duì)社會(huì)產(chǎn)生危害；還需要通過(guò)定量檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量，明確是否已達(dá)到所在國(guó) 家規(guī)定的閾值水平，因?yàn)槊總€(gè)國(guó)家轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的閾值水平都不相同。轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)大致可分為兩類，一類是核酸檢測(cè)，當(dāng)外源基因插入到受體細(xì) 胞染色體時(shí)，一般要構(gòu)建啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因，如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35s啟動(dòng)子，胭脂堿合酶NOS終止子等，轉(zhuǎn)基因食品核酸檢測(cè)的靶標(biāo)是插入的外源基 因，包括外源基因的整合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的核酸序列，目前 的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有超過(guò)400對(duì)PCR檢測(cè)引物和以及40多種內(nèi)源參照基因。另 一類是蛋白檢測(cè)，即通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，已有大約20 種轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域中投入了使用。核酸檢測(cè)主要應(yīng)用PCR方法和基因芯片技術(shù)。PCR方法具有很高的靈敏度，在轉(zhuǎn)基 因領(lǐng)域使用最為廣泛。與蛋白質(zhì)具有組織特異性相比，PCR技術(shù)不受到材料的限制。另外， 核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，變性之后容易復(fù)性，在加工食品中仍可檢出。PCR方法的關(guān)鍵是引物設(shè) 計(jì)，引物一般長(zhǎng)為17_30nt，嚴(yán)格限制上下游引物的配對(duì)和引物自身配對(duì)。轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫層析(試紙條法)和Western印跡法 等。盡管使用轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)方法有一些優(yōu)點(diǎn)，但是許多存在于食品基質(zhì)中的物質(zhì)，如表面 活性劑(皂角苷)、酚類化合物、脂肪酸、內(nèi)源磷酸(酯)酶，均可以抑制抗原一抗體的特異 相互作用，此外，免疫檢測(cè)需要轉(zhuǎn)基因蛋白保持完整的3級(jí)或4級(jí)結(jié)構(gòu)，但外源基因表達(dá)的 蛋白在加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生降解，免疫方法的檢測(cè)能力下降，因而只適合未加工的原材料的 檢測(cè)。另外，某些外源蛋白表達(dá)有組織特異性，例如在轉(zhuǎn)基因玉米中一些BT蛋白大部分表 達(dá)在葉子中，而不在谷粒中。這些缺點(diǎn)限制了轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)方法的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因的標(biāo)識(shí)需求和一些法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分含量的限制，要求對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因成 分進(jìn)行定量檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道能快速、簡(jiǎn)單、特異且靈敏地檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn) 基因水稻及其制品的方法。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因 水稻或其制品檢測(cè)方法，進(jìn)行含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供用于快速檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或 其制品的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供快速測(cè)定含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其 制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供用于快速檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的試劑盒。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在 檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)含有玉米 泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明的寡核苷酸引 物對(duì)和探針是根據(jù)玉米泛素啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物對(duì)由上 游引物和下游引物組成，所述上游引物為Ubiquitin-F2 :TAGCCCTGCCTTCATACGCTA(SEQ ID No. 1)，所述下游引物為Ubiquitin-R2 :TGATCCTCTAGAGTCGACCTGC(SEQ ID No. 2)；所述探針 為 Ubiquitin-P2 TGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGT(SEQ IDNo. 3)在探針的 3，端連接有一 個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或 其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)玉米泛素啟動(dòng)子基因序列的特異 性寡核苷酸引物對(duì)和探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因 水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，所使用的特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和 下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2 ；所使用的探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基 團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的實(shí)時(shí) 熒光PCR檢測(cè)方法包括如下步驟(a)從待測(cè)產(chǎn)品中提取DNA樣品；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件；(c)使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)及探針通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行核酸 擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基 因水稻或其制品的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)以及探針。在 本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒中包含的特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引 物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為 SEQ ID No. 2 ；所述試劑盒中包含的探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有 一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試 劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應(yīng)的試劑以及使用說(shuō)明書。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述試劑盒中的使用說(shuō)明書包括對(duì)用于快速檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn) 基因水稻或其制品的PCR擴(kuò)增條件的描述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的說(shuō)明 書中給出的PCR擴(kuò)增條件是:95°C, IOmin ；95°C 15s ；60°C, lmin,45個(gè)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探 針在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的優(yōu) 選實(shí)施方案中，所述特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的 堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQID No. 2 ；所述探針的堿基序列為 SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的試劑盒在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的 轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上述應(yīng)用中，所述試劑盒包括本發(fā)明的 特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針。本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的DNA為檢測(cè)基礎(chǔ)，根據(jù)玉米泛素啟動(dòng)子基因序列 設(shè)計(jì)引物及探針，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品。 玉米泛素蛋白啟動(dòng)子全長(zhǎng)約2kb (含第一內(nèi)含子)，因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力強(qiáng)、表達(dá)穩(wěn)定，近年在水 稻、玉米、小麥等單子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究中獲得廣泛使用，在本發(fā)明中，針對(duì)玉米泛素蛋 白啟動(dòng)子的3’區(qū)域，設(shè)計(jì)了 16個(gè)引物/探針組合，經(jīng)過(guò)特異性試驗(yàn)、靈敏度試驗(yàn)的篩選，獲 得了特異性強(qiáng)、靈敏度達(dá)到相對(duì)含量十萬(wàn)分之一、可檢測(cè)所有含玉米泛素蛋白啟動(dòng)子的引 物/探針組合。在本發(fā)明方法中，所檢測(cè)的產(chǎn)品是含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻及其制品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。在該P(yáng)CR體系中，除 了兩條普通的引物外，還有一條在5'和3'端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光染料基團(tuán)(R)、猝滅熒 光染料基團(tuán)(Q)、并與PCR產(chǎn)物特異結(jié)合的寡核苷酸探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒 光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Tag酶的5'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光 基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有 一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物形成的完全同步。通過(guò)分析PCR模 板的起始拷貝數(shù)，并以標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定待檢產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因含量。本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法由于使用熒光染料實(shí)時(shí)顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積 累，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中閉管操作，沒有PCR后處理過(guò)程，有效地解決了 PCR后污染問(wèn)題。使 用本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地檢測(cè)出含有玉米泛素啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品。


圖1是顯示水稻轉(zhuǎn)化事件特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，其中使用特異性寡核苷 酸引物對(duì)SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2和探針SEQ ID No. 3進(jìn)行檢測(cè)，熒光曲線編號(hào)與樣品 對(duì)應(yīng)如下1 科豐6號(hào)；2 科豐8號(hào)；3 克螟稻(KMDl) ；4 轉(zhuǎn)Cry2A水稻；5 轉(zhuǎn)CrylC水稻； 6 轉(zhuǎn) CrylAh 水稻；7 抗優(yōu) 97 ；8 巴呑米；9 :K105 ；10 明恢 63 ；11 培雜 35 ；12 津稻 9618 ； 13 皖稻181 ；14 春優(yōu)59 ；15 空白對(duì)照，各樣品一式三份進(jìn)行重復(fù)?；€以上的熒光曲線 為科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻(KMDl)、轉(zhuǎn)Cry2A水稻、轉(zhuǎn)CrylC水稻、轉(zhuǎn)CrylAh水稻樣品， 基線位置為抗優(yōu)97、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59及空白對(duì) 照。這些水稻品種由國(guó)家農(nóng)業(yè)部門命名，為本領(lǐng)域所公知。圖2是針對(duì)事件特異性引物探針進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)。將IOOng的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5% (W/W)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)的基因組DNA 5個(gè)梯度4倍稀釋，結(jié)果表明，當(dāng)含有玉米泛 素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)在相對(duì)含量大于0. 001%時(shí)可以獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí) 施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例為通過(guò)使用本發(fā)明的引物對(duì)和探針測(cè)試轉(zhuǎn)化事件特異性。通過(guò)檢測(cè)玉米泛素啟動(dòng)子序列，測(cè)試轉(zhuǎn)化事件特異性。使用本發(fā)明的引物對(duì)和探針的組合，在樣品量極少的情況下，相對(duì)于其他引物對(duì) 仍能特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目的片段。本實(shí)施例中所使用的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化事件特異性的引物對(duì)及探針序列為Ubiquitin-F2 :TAGCCCTGCCTTCATACGCTA(SEQ ID No. 1)Ubiquitin-R2 TGATCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No. 2)Ubiquitin-P2 :TGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGT (SEQ ID No. 3)，在探針的 3，端連 接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。在本實(shí)施例中，檢測(cè)了 14份樣本科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻(KMD1)、轉(zhuǎn)Cry2A水 稻、轉(zhuǎn)CrylC水稻、轉(zhuǎn)CrylAh水稻、抗優(yōu)97、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻 181、春優(yōu) 59。所使用的檢測(cè)主要儀器微量移液器(10 μ L、100 μ L、1000y L Eppendorf)、熒光定量PCR儀、高速臺(tái)式離 心機(jī)(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(jī)(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京 六一儀器廠)等。檢測(cè)主要試劑Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探針(按序列制成試劑盒)，移液器Tips 務(wù)必使 用帶濾芯的型號(hào)，否則在混勻和分樣時(shí)非常容易污染；同時(shí)IOuL和2. 5uL的移液器務(wù)必使 用長(zhǎng)Tips，普通短Tips在工作時(shí)，移液器桿部可能會(huì)與離心管內(nèi)壁接觸，造成污染。檢測(cè)主要步驟1 DNA 提取 待測(cè)樣品為科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻(KMDl)、轉(zhuǎn)Cry2A水稻、轉(zhuǎn)CrylC水稻、 轉(zhuǎn)CrylAh水稻、抗優(yōu)97、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59。稱取50. Omg樣品粉末，加入1.0ml CTAB提取緩沖液及4. 0 μ L蛋白酶K(lOmg/ ml)，65°C溫浴孵化Ih ； 12000rpm離心15min，取幾近清澈的上清700μ 1 ；加入500 μ L氯仿， 高速渦旋混合30秒；12000rpm離心lOmin，收集500 μ L上清，轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml反應(yīng)管中； 加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫，孵育Ih ； 12000rpm離心5min棄上清，將沉淀溶于 350 μ L的1. 2mol/L的氯化鈉溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲烷，小心高速渦旋混合 30秒；以12000rpm離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中；加入0. 8倍的異丙醇，室溫孵 育至少20min ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；在沉淀中加入500 μ L 70%乙醇，高速渦旋30 秒，以 12000rpm 離心 IOmin ；棄上清，60°C干燥 15_25min，并溶于 50 μ LTE (ρΗ 8. 0)，-20°C 保存?zhèn)溆?。每次提取均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(以雙蒸水代替樣品)。2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用轉(zhuǎn)化事件特異性引物和探針引物序列為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探針序列為SEQ ID No. 3,3'端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè) 熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。
3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μ Μ) 0. 5μ L上游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L下游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L模板 DNA5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模 板，檢測(cè)試劑是否受到污染)；4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin45個(gè)循環(huán)。注不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖1所示，使用引物擴(kuò)增待測(cè)樣品的DNA，測(cè)試轉(zhuǎn)化事件特異性，科豐6號(hào)、科豐 8號(hào)、克螟稻(KMDl)、轉(zhuǎn)Cry2A水稻、轉(zhuǎn)CrylC水稻、轉(zhuǎn)CrylAh水稻能在基線以上出現(xiàn)熒光 擴(kuò)增曲線，抗優(yōu)97、巴呑米、K105、明恢63、培雜35、津稻9618、皖稻181、春優(yōu)59及空白對(duì) 照的熒光曲線在基線位置。以上的結(jié)果表明，科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻(KMDl)、轉(zhuǎn)Cry2A水稻、轉(zhuǎn)CrylC水 稻、轉(zhuǎn)CrylAh水稻樣品為含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻。由此可見，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的 引物和探針能夠進(jìn)行特異性地檢測(cè)含有泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品。實(shí)施例2本實(shí)施例為通過(guò)如下試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的引物對(duì)和探針進(jìn)行靈敏度測(cè)試。本實(shí)施例中所使用的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化事件靈敏度的引物對(duì)及探針序列為引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探針為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有 一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。DNA提取步驟以及PCR反應(yīng)體系同實(shí)施例1所述。為確定特異性引物和探針組合的檢測(cè)限，以科豐6號(hào)為例，將IOOng的相對(duì)質(zhì)量分 數(shù)為5% (W/W)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)DNA 5個(gè)梯度4倍稀釋于無(wú)菌水中，分別按實(shí)施例1中 所述的條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因的科豐6號(hào)DNA含量大于0. 001 %時(shí)能 夠獲得可靠地檢測(cè)結(jié)果。使用本發(fā)明的引物對(duì)和探針的組合，相對(duì)于其他引物對(duì)和探針而言，能夠特異、靈 敏地?cái)U(kuò)增出目的片段，從而高特異、高靈敏地鑒別出含有玉米泛素啟動(dòng)子基因的轉(zhuǎn)基因水 稻或其制品。雖然已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到， 在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在權(quán)利要求書及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。
權(quán)利要求
1.用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的特異性 寡核苷酸引物對(duì)及探針，其中所述引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿 基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2，所述探針的堿基序列為 SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基 團(tuán) FAM。
2.用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的試劑盒， 其包括權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)和探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其還包括用于提取DNA的試劑、用于實(shí)時(shí)熒光PCR的 試劑、空白對(duì)照以及使用說(shuō)明書。
4.含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包 括使用權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)及探針或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟(a)從待測(cè)產(chǎn)品中提取DNA樣品；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件；(c)使用權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)及探針或權(quán)利要求2或3的試劑盒，通過(guò)實(shí) 時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)及探針在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水 稻或其制品中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于測(cè)定含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針或試劑盒在檢測(cè)含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引和探針、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地測(cè)定含有玉米泛素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102134603SQ20101061523
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者鄧婷婷, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院