專利名稱：抗原多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定由病原微生物所表達的抗原多肽的方法；包含所述多肽的 疫苗；制備所述多肽的重組方法；和針對所述多肽的治療用抗體。
背景技術(shù)：
微生物引起的大量致死或致弱的疾病，影響著全世界數(shù)百萬人。控制微生物的 現(xiàn)有方法包括應(yīng)用抗微生物制劑(抗生素)和消毒劑。它們被證明是有問題的，由于暴 露在這些制劑的環(huán)境中所形成的顯著的選擇性壓力導(dǎo)致了耐藥性微生物的產(chǎn)生，這些微 生物能夠躲避抗微生物制劑的作用。例如，近來已發(fā)現(xiàn)微生物對三氯生產(chǎn)生了耐藥性， 而在家庭及工業(yè)環(huán)境中使用的許多消毒劑中都添加有三氯生。
一個越來越引起爭議的問題是許多重要的病原微生物進化出了對抗生素的耐藥 株。
例如，但并不限于所舉的例子，估計全世界超過5千萬人感染了耐藥的結(jié)核病 (TB)(數(shù)字來自世界衛(wèi)生組織，1998)。過去使用抗生素治療結(jié)核病依賴于單一藥物(如 乙硫異煙胺)，因此產(chǎn)生了較高頻率的耐藥性。由于這個原因，現(xiàn)在治療結(jié)核病采用聯(lián) 合用藥。但即使聯(lián)合用藥進行治療，由至少對一種用于治療結(jié)核病的藥物產(chǎn)生耐藥性的 菌株所引起的治療失敗的比率仍然接近50%。導(dǎo)致TB的分枝桿菌是一種慢性生長的細 菌，需要花費很長時間消滅它。所以，聯(lián)合用藥若要產(chǎn)生療效，TB患者必須每天服用組 合藥物至少6個月。病人通常必須每天服用兩種或更多種藥物，并需要相當長的治療期 限。許多病人僅是斷續(xù)服藥而沒有完成徹底根除分枝桿菌感染的全部療程。再者，TB 與艾滋病感染有密切聯(lián)系，因而TB的產(chǎn)生是與免疫抑制緊密相關(guān)的。
抗TB的疫苗已經(jīng)應(yīng)用了許多年。作為一種對潛在的可能感染TB的大量人群的 安全和廉價的預(yù)防手段，卡介苗(BCG)已在長時間內(nèi)廣泛應(yīng)用于全世界。BCG是從牛 分枝桿菌獲得的減毒活疫苗。但是預(yù)防接種對TB感染的效果不大，所以BCG對全面控 制這一疾病的作用是有限的。
金黃色葡萄球菌是病原微生物對抗生素產(chǎn)生耐藥性的另一個例子。金黃色葡萄 球菌是一種通常寄居在約20-40%普通健康人鼻腔上皮內(nèi)表面的細菌，也常在人皮膚上發(fā) 現(xiàn)，通常不會引起疾病。但在某些場合，特別是當皮膚受損時，這種細菌能引起感染。 在醫(yī)院里這是一個特殊的問題，因為在那里病人會進行外科手術(shù)和/或服用免疫抑制藥 物。這些病人由于他們所接受的治療更易受金黃色葡萄球菌的感染。近年來已產(chǎn)出現(xiàn)了 金黃色葡萄球菌的耐藥株。對甲氧苯青霉素的耐藥株已很普遍，這些耐藥株也對另外幾 種抗生素有耐藥性。目前對金黃色葡萄球菌還沒有有效的預(yù)防接種措施。在美國，每年 兩百萬住院感染中的13%是由金黃色葡萄球菌感染引起的。這表示沈0,000人感染金黃色葡萄球菌，其中60-80,000人死亡。
因此，金黃色葡萄球菌是一種重要的人類病原菌，能引起許多威脅生命的疾 病，包括敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和中毒性休克。其致病力是由其微生物的多樣性 及其致病成分的毒力決定的。致病原因是多因素的，任何單一致病成分均不能解釋一 個特定的感染，見Projan，S.J.& Novick，R.P.(1997)著《人類疾病中的葡萄球菌》 (Crossley, K.B.& Archer, G丄.，eds.) pp.55-81。
在感染初期，及發(fā)展階段，微生物的需要及其環(huán)境發(fā)生改變，相應(yīng)地，金黃色 葡萄球菌所產(chǎn)生的致病毒素隨之發(fā)生改變。在感染開始時，病原體粘附于宿主組織是關(guān) 鍵性的，于是便產(chǎn)生了大量與在細胞表面粘附相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括膠原結(jié)合蛋白、血纖 蛋白原結(jié)合蛋白和纖粘連蛋白結(jié)合蛋白。病原體還具有產(chǎn)生能減少吞噬作用或是干擾細 胞被循環(huán)抗體識別的因子的能力，從而逃避宿主的防御系統(tǒng)。
通常，感染病灶會發(fā)展為一個膿腫，其中細菌大量滋生。金黃色葡萄球菌通過 產(chǎn)生一定數(shù)量的感受肽能監(jiān)測其自身的細胞密度。肽的積累以及所伴隨的生理變化，引 起細胞的營養(yǎng)不足，從而使細胞所產(chǎn)生的致病毒素從粘附素轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸾櫤徒M織穿透 的組分。這包括多種溶血素、蛋白酶和其他降解酶等。
在任何感染過程中，金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的致病毒素是隨環(huán)境和生理刺激而 改變的。這些刺激取決于體內(nèi)局部的環(huán)境并隨著感染的進程而改變。由于對體內(nèi)的情況 所知甚少，并且某些毒素組分似乎僅能在體內(nèi)的環(huán)境下產(chǎn)生，所以一些可能成為疫苗的 組分不能為早期的技術(shù)所發(fā)現(xiàn)。
近代藥物歷史中最重要的發(fā)展之一是疫苗的發(fā)展，其對各種病原微生物的感染 提供了預(yù)防性保護。許多疫苗是由滅活的或減毒的病原制成的，然后注射給個體。經(jīng)免 疫的個體通過產(chǎn)生體液(抗體)和細胞(溶細胞的T細胞，CTL’ S)應(yīng)答而做出反應(yīng)。 例如，肝炎疫苗的制備是通過加熱滅活病毒和用像甲醛這樣的交聯(lián)劑處理。減毒病原的 一個代表例子是由活病原弱化產(chǎn)生的脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
但是對特定疾病應(yīng)用減毒疫苗是存在顧慮的，因為缺乏對于減毒過程的本質(zhì)和 條件的病理學(xué)知識的了解。這個問題對于特定病毒制劑而言尤其突出，這是因為病毒， 特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有錯誤傾向的復(fù)制周期，導(dǎo)致含有病毒的基因產(chǎn)生能夠傳代的突 變，其結(jié)果是被用做疫苗的抗原決定簇的發(fā)生改變。替代使用滅活的或減毒的病原的一 種方法是鑒別出免疫系統(tǒng)對其特別敏感的病原表位。由此，許多由病原微生物在感染過 程中產(chǎn)生的致病毒素，對于開發(fā)具有保護個體免于受到特定致病微生物感染作用的疫苗 是特別有用的。
發(fā)展亞單位疫苗(疫苗其免疫原是由特定的病原微生物表達的一個蛋白質(zhì)或復(fù) 合體的一個片段或亞基)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的焦點。對鑒別出用于發(fā)展亞單位疫苗的候 選分子的需求，顯然不僅僅是因為近來抗生素耐藥性的出現(xiàn)已經(jīng)成為用傳統(tǒng)化學(xué)療法控 制致病微生物的嚴重障礙。已經(jīng)發(fā)展了許多方法來確定有可能用作疫苗的抗原多肽。在 此舉一個方法以作說明。許多年來已知腫瘤細胞能產(chǎn)生一些腫瘤細胞特異性抗原，其中 一些出現(xiàn)在腫瘤細胞表面。免疫系統(tǒng)識別這些抗原并將其作為外來物，然后產(chǎn)生針對自 身抗原的抗體，這叫自身抗體或自身抗血清。
這種技術(shù)之一是重組表達克隆抗原的血清學(xué)識別，簡寫成SEREX。
典型地說，這一技術(shù)包括從腫瘤組織中提取RNA，然后從分離的總RNA中的選 擇性富集mRNA。mRNA用病毒逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。這樣合成的cDNA再被克隆 進入一個表達載體，并且轉(zhuǎn)化進入一個適當?shù)募毦?。轉(zhuǎn)化的細菌被接種到一個營養(yǎng)適 宜的瓊脂平板上，在適宜的生長條件下，亞克隆的cDNA在細菌細胞中由表達載體來表 達。應(yīng)用基于噬菌體的表達載體可導(dǎo)致細胞自然溶解，例如λ噬菌體或基于噬菌粒的載 體，通過它們的溶解循環(huán)引起細胞溶解。釋放的多肽被轉(zhuǎn)移至一種合適的膜支持物(如 硝酸纖維素，尼龍)，并暴露于從最初自其分離腫瘤組織的病人中獲得的自身抗血清。免 疫篩選法可以用于從病人腫瘤組織中鑒定出過量表達或不恰當表達的基因。
我們使用這種技術(shù)來鑒定感染過程中由病原微生物所表達的抗原多肽。感染中 產(chǎn)生的自身抗血清，被用于篩選一個由基因組DNA產(chǎn)生的表達文庫，以鑒定和克隆抗 原。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明最廣義的方面是涉及在感染中由病原微生物表達的抗原多肽的鑒定。
按照本發(fā)明的第一方面，提供一種用于鑒定抗原多肽的方法，包括
⑴提供一個編碼病原微生物的基因或部分基因序列的核酸文庫；
( )轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染所述核酸文庫至一種宿主細胞；
(iii)提供有助于表達所述的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的基因或部分基因序列的條件；
(iv)將所述基因/部分基因序列表達的多肽與從感染或曾經(jīng)感染過所述致病微生 物的動物獲得的自身抗血清相作用；以及
(ν)純化編碼與所述自身抗血清相結(jié)合的多肽或部分多肽的核酸。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述的文庫包含一個病原微生物的基因組DNA。
理想的所述病原微生物是細菌。
更優(yōu)選地，所述的細菌微生物是從以下選擇出來的
金黃色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；糞腸球菌；結(jié)核分枝桿菌；B族鏈球菌；肺 炎鏈球菌；幽門螺桿菌；淋病奈瑟氏球菌；A族鏈球菌；布氏疏螺旋體；粗球孢菌；莢 膜組織胞漿菌；B型腦膜炎奈瑟氏球菌；弗氏志賀氏菌；大腸桿菌；流感嗜血菌。
更優(yōu)選地，所述病原微生物是葡萄球菌屬細菌。理想的病原生物體是金黃色葡 萄球菌或表皮葡萄球菌。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述核酸文庫是一個λ文庫，理想地， 是一個λ表達文庫。
按照本發(fā)明的第二個方面，提供了含有一個DNA序列的核酸分子，所述DNA 序列選自
(i)如 SEQ ID NO 1-13 中代表的 DNA 序列；
(ii)與上述⑴中確定的SEQ ID NO 1-13所示序列雜交并編碼一種致病微生物 所表達的多肽的DNA序列，以及
(iii)由⑴和(ii)中所確定的DNA序列的遺傳密碼所產(chǎn)生的簡并DNA序列。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子是基因組DNA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO 1-13中所示序列退火。
嚴格的雜交/漂洗條件是本領(lǐng)域的公知常識。例如，核酸雜交體在0.1%xSSC， 0.1% SDS中60°C下漂洗后是穩(wěn)定的。本領(lǐng)域公知，如果已知核酸的序列，可以計算出最 佳的雜交條件。例如，根據(jù)要進行雜交的核酸的GC含量，能將雜交條件確定下來。請 閱Sambrook等(1989)著《分子克隆實驗手冊》。一個用于計算給定的同源核酸分子間 雜交所需嚴格條件的普遍公式為
Tm = 81.5°C +16.6Log[Na+]+0.41[% G+C]-0.63(% 甲酰胺)
按照本發(fā)明的第三個方面，提供至少一種依照本發(fā)明的方法所鑒定的多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明前面所述的任一方面或?qū)嵤┓?案，所述多肽與一種微生物的感染致病力相關(guān)。
更優(yōu)選地，所述多肽至少是SEQ IDNO 14_19之一或一部分。
按照本發(fā)明的第四個方面，提供了一種核酸分子，其特征在于所述的核酸分子 是一個載體的一部分，所述載體適于促進由所述核酸分子編碼的多肽的重組表達。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所說的載體是一種適應(yīng)于進行原核基因表 達的表達載體?；蛘撸霰磉_載體適應(yīng)于進行真核基因表達。
典型地，所述的適應(yīng)性包括，例如但不限于，提供介導(dǎo)細胞特異性表達的轉(zhuǎn)錄 控制序列(啟動子序列)。這些啟動子序列可以是細胞特異性的，可誘導(dǎo)的或組成性的。
啟動子是本領(lǐng)域所知的術(shù)語，為了清楚的目的，僅舉一個例子，但不限于此 例，以說明其如下的特征。增強子元件是順式作用的核酸序列，通常位于一個基因的轉(zhuǎn) 錄起始位點的5’端(增強子也可出現(xiàn)在基因序列的3’端或者甚至位于內(nèi)含子序列內(nèi) 部，因此其不受位置的約束)。增強子的功能是增加與增強子連接的基因的轉(zhuǎn)錄頻率。 增強子的活性是響應(yīng)與增強子元件特異性結(jié)合的反式作用轉(zhuǎn)錄因子(多肽)。轉(zhuǎn)錄因子的 結(jié)合 / 活性(請看《真核轉(zhuǎn)錄因子》，David S Latchman，Academic Press Ltd, San Diego 著)依賴于多種環(huán)境因素包括，例如但不限于，中間代謝產(chǎn)物(如葡萄糖，脂質(zhì))，環(huán)境 作用因子(如光，熱)。
啟動子元件還包括TATA框和RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列，其功能是選擇 轉(zhuǎn)錄起始位點。這些序列也結(jié)合于多肽上，所述多肽，和其他事物一起，促進RNA聚合 酶對轉(zhuǎn)錄起始點的選擇。
適應(yīng)性也包括提供選擇標志和自動復(fù)制序列，兩者均有助于所述載體在真核細 胞或原核宿主中的維持。自動維持的載體稱為附加載體。
促進載體編碼基因表達的適應(yīng)性包括提供轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸序列。還包括 提供內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，其功能是最大表達排列在二順反子或多順反子表達盒 中的載體編碼基因。
這些適應(yīng)性在本領(lǐng)域是熟知的。這里有一系列關(guān)于表達載體的構(gòu)建和重組DNA 的通用技術(shù)的出版物。請看，Sambrook等(1989)著《分子克隆實驗手冊》，冷泉港實 驗室，冷泉港，NY和其中的參考文獻；Marston，F(xiàn) (1987)著《DNA克隆技術(shù)》；一本 IRL出版的實用手冊，Vol III IRL，英國牛津，《DNA克隆》F M Ausubel等著，《分 子生物學(xué)中的通用方案》，John Wiley & Sons，tnc.(1994)。
按照本發(fā)明的另外方面，提供了一種生產(chǎn)前述任一方面或?qū)嵤┓桨杆龆嚯牡姆椒ǎ?br> ⑴提供一種用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞；
( )在利于制備所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細胞；以及
(iii)從所述細胞或其生長環(huán)境中純化所述多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述載體編碼并因此為所述重組多肽提供一種促進所 述多肽純化的分泌信號。
按照本發(fā)明的第五個方面，本發(fā)明提供了一種用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞或細胞 系。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是原核細胞?；蛘?，所述細胞是 選自真菌、昆蟲、兩棲動物、哺乳動物、植物的真核細胞。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種疫苗，所述疫苗包含至少一種本發(fā)明的多 肽。
理想地，所述疫苗還包含載體和/或佐劑。
載體和佐劑是以下述方式表述。某些多肽或肽抗原含有B-細胞表位但沒有T細 胞表位。通過在多肽/肽中加入T細胞表位，或通過將多肽/肽結(jié)合到一種含有多個T 細胞表位的免疫原性載體蛋白上，如血蘭蛋白或破傷風毒素，能大大增強免疫應(yīng)答。結(jié) 合物由抗原呈遞細胞攝取，加工，并通過人白細胞抗原(HLA’ s)II類分子呈遞。這使 得在T細胞的幫助下將針對源自載體表位的T細胞的特異性傳遞給對原始的抗原多肽/肽 具有特異性的B細胞。這能增加抗體產(chǎn)生、分泌和同型轉(zhuǎn)化。
佐劑是能夠通過調(diào)節(jié)免疫細胞活性而增加對抗原的特異性免疫應(yīng)答的一種物質(zhì) 或程序。佐劑的例子包括，例如但不限于，共刺激分子的激動抗體、弗氏佐劑、胞壁酰 二肽、脂質(zhì)體。因此佐劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑。載體是一種免疫原性分子，當與第二個分 子結(jié)合后會增強針對后者的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明另一方面提供了一種方法，所述方法包括通過對一種動物施用至少一種 本發(fā)明的多肽或其一部分，或本發(fā)明的疫苗，使所述動物產(chǎn)生抵抗一種病原微生物的免 疫力。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，所述動物是人。
優(yōu)選地，疫苗或抗原多肽能通過靜脈內(nèi)注射，肌肉注射，或皮下注射等直接注 射接種。進一步地，疫苗或抗原多肽，或許還可以口服。
優(yōu)選地，疫苗能抵抗金黃色葡萄球菌。
疫苗也可能抵抗表皮葡萄球菌。
顯然，疫苗或抗原多肽對于控制或減輕除了人以外的其它動物的病情也是有效 的，例如，但不限于例子，家庭寵物，家畜，馬匹。
按照本發(fā)明的其它方面，還提供了一種抗體或至少其一個有效結(jié)合部分，所述 抗體結(jié)合至少一種本發(fā)明的多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體是一種多克隆或單克隆抗體，其中 所述抗體對所述多肽具有特異性。
或者，所述抗體是一種通過重組方法產(chǎn)生的嵌合抗體，其包含所述抗體的可變 區(qū)與人類抗體的不變或恒定區(qū)。
在本發(fā)明的另一個替代實施方案中，所述抗體是通過重組方法產(chǎn)生的人源化抗 體，是所述抗體的互補決定區(qū)域與一種人抗體的恒定區(qū)(C)和可變(V)區(qū)的讀框的結(jié)合。
優(yōu)選地，所述抗體被給予了一種標志，包括一種傳統(tǒng)的標記或標簽，例如放射 性和/或熒光和/或表位的標記或標簽。
優(yōu)選地，針對所述的多肽的所述人源化的單克隆抗體，是由一種適合于轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染原核細胞或真核細胞的表達載體所產(chǎn)生的融合多肽。
抗體，也叫做免疫球蛋白，是一種對外來分子(抗原)具有特異性的蛋白分子。 免疫球蛋白(Ig)是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)，包括兩對多肽鏈，一對是輕(L)(低分子量)鏈 (κ或λ )，一對是重(H)鏈(Y，α , μ，δ和ε )，所有四條鏈通過二硫鍵結(jié)合在一 起。重鏈和輕鏈都有結(jié)合抗原的區(qū)域，并且在Ig分子之間是高度可變的。另外，重鏈 和輕鏈包括非可變或恒定區(qū)域。
輕鏈包括兩個結(jié)構(gòu)域。羧基-末端結(jié)構(gòu)域在一種類型的輕鏈中是基本相同的， 因此被稱為“恒定”(C)區(qū)。氨基-末端結(jié)構(gòu)域在輕鏈和輕鏈間是變化的并構(gòu)成抗體的 結(jié)合位點。因為它的可變性，它被稱為“可變”(V)區(qū)。
壇分子的重鏈分幾個類型，α，μ , δ , ε，和Y (其中還分幾個亞型)。裝 配好的Ig分子包括一個或多個由相同的兩條重鏈和輕鏈組成的單位，并從它擁有的重鏈 獲得它的名稱。這樣，Ig便分成5個型IgA，IgM, IgD, IgE和IgG(并因重鏈的不 同而分成4個亞型，例如，IgGl，IgG2，IgG3和IgG4)。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)和它們的不同功 能的更詳細的解釋，可以參考《抗體的應(yīng)用一本實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版。
嵌合抗體是重組抗體，其中小鼠或大鼠抗體的所有可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)結(jié) 合。人源化的抗體是重組雜交抗體，它融合了來自于嚙齒類抗體的可變區(qū)的互補決定區(qū) 與人抗體可變區(qū)的框區(qū)。也用了人抗體的恒定區(qū)。互補決定區(qū)(CDRs)位于抗體的重鏈 和輕鏈的N-末端結(jié)構(gòu)域，可變區(qū)的主要變化多集中在CDRs。這些區(qū)域構(gòu)成位于抗體分 子表面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)在抗體和抗原之間提供結(jié)合表面。
非人類動物的抗體可引起對外來抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并由此被從血液循環(huán)中清 除。注射到人機體中的嵌合抗體和人源化抗體具有弱的抗原性，因為在重組雜交抗體中 嚙齒類(即異類)抗體的量減少，而人的抗體區(qū)域不會引起免疫應(yīng)答。它使得針對該抗 體的免疫應(yīng)答減弱，并減少了對抗體的清除。這顯然對于應(yīng)用治療性抗體治療人類疾病 來說是很需要的。人源化抗體被設(shè)計為具有更少“異類”抗體區(qū)域，因此與嵌合抗體相 比，人源化抗體是更弱的免疫原。
本發(fā)明的另一方面是提供一種載體，所述載體適用于按照本發(fā)明表達人源化的 或嵌合體的抗體。
本發(fā)明進一步提供了一種細胞或細胞系，所述細胞或細胞系用編碼本發(fā)明的人 源化的或嵌合體的抗體的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步提供了一種制備本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的方法，其包括
⑴提供用一個載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的一種細胞，所述載體包括一種編碼本發(fā)明的人 源化或嵌合體抗體的核酸分子；
( )在有利于制造所述抗體的條件下使所述細胞增殖；以及
(iii)從所述細胞中或它的生長環(huán)境中純化所述抗體。
本發(fā)明進一步提供了一種雜交瘤細胞系，其可產(chǎn)生如前所描述的單克隆抗體。
本發(fā)明進一步提供了一種用雜交瘤細胞系生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的方法。
本發(fā)明進一步提供了制備一種能產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的一 種方法，它包括以下步驟
i)用一種免疫原免疫一種具有免疫活性的哺乳動物，所述免疫原包含至少一種 具有如SEQ.ID No 14-19中所示的氨基酸序列的多肽或其片段；
)將接受免疫的免疫活性動物的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞；
iii)根據(jù)與步驟(i)中的氨基酸序列的結(jié)合活性篩選出由步驟(ii)中的雜交瘤細 胞產(chǎn)生的單克隆抗體；
iv)培養(yǎng)雜交瘤細胞以使其增殖和/或分泌所述單克隆抗體；以及
ν)從培養(yǎng)上清液中回收單克隆抗體。
優(yōu)選地，上述具免疫活性的哺乳動物是小鼠?；蛘?，上述具免疫活性的哺乳動 物是大鼠。
使用雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體是本領(lǐng)域所熟知的。用于產(chǎn)生單克隆抗體的方 法是由 Kohler 和 Milstein，(自然 256，495-497(1975))，和由 Donillard和 Hoffman(《免 疫學(xué)概要》V.II中的“關(guān)于雜交的基本原理”，Schwartz編輯1981，該文獻列入相關(guān)參 考)公布的。
本發(fā)明進一步提供了應(yīng)用抗體制造一種藥物，以治療金黃色葡萄球菌引起的敗 血癥、食物中毒或皮膚損壞。
本發(fā)明進一步提供了應(yīng)用本發(fā)明的抗體制造一種藥物，以治療表皮葡萄球菌引 起的敗血癥、腹膜炎或心內(nèi)膜炎。
顯然，按照本發(fā)明的方法鑒定的多肽將促進治療性抗體的生產(chǎn)，所述抗體能夠 用于一些由病原體感染引起的疾病，例如，敗血癥、結(jié)核病、細菌相關(guān)性食物中毒、血 液感染、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、膿毒癥、腦膜炎、肺炎、胃潰瘍、淋病、鏈球菌喉炎、鏈 球菌相關(guān)中毒性休克、壞死性筋膜炎、膿庖病，組織胞漿菌病、萊姆病、胃腸炎、痢 疾、志賀菌病。
如前所述，病原微生物引起廣泛的不同類型的疾病。例如但不限于下表所列的 一些病原微生物及其引起的疾病。
權(quán)利要求
1.包含一個DNA序列的分離的核酸分子，所述DNA序列選自由以下所構(gòu)成的組(i)SEQ ID NO 1-13 中所示的 DNA 序列；(ii)與上述G)中確定的SEQID NO 1_13所示序列雜交并編碼由一種病原微生物表 達的多肽的DNA序列；和(iii)由G)和(ii)中所限定的DNA序列的遺傳密碼所導(dǎo)致的簡并的DNA序列。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其是基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分離的核酸分子，所述核酸分子在嚴格的雜交條件下與 SEQ ID NO 1-13所示的序列退火。
4.一種載體，其包含如權(quán)利要求1-3任一項所述的核酸分子。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其適于重組表達由所述核酸編碼的多肽。
6.如權(quán)利要求4或5所述的載體，其是一種適合原核基因表達的表達載體。
7.如權(quán)利要求4或5所述的載體，其中所述載體是一種適合真核基因表達的表達載體。
8.如權(quán)利要求4至7任一項所述的載體，其中載體的適用性包括提供啟動子序列。
9.如權(quán)利要求8所述的載體，其中啟動子序列提供細胞特異性的，可誘導(dǎo)的或組成性 的表達。
10.一種鑒別抗原多肽的方法，包括ω提供一個核酸文庫，其編碼一種病原微生物的基因或部分基因序列； ( )轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染所述文庫到一種宿主細胞中；(m)將由所述基因/部分基因序列表達的多肽與從感染或曾經(jīng)感染所述病原微生物的 動物得到的自體抗血清接觸；和(iv)純化編碼與所述自身抗血清結(jié)合的多肽或部分多肽的核酸。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述文庫包含一種病原微生物的基因組DNA。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述病原微生物是細菌。
13.如權(quán)利要求10至12任何一項所述的方法，其中所述細菌微生物選自以下金 黃色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；糞腸球菌；結(jié)核分枝桿菌；B族鏈球菌；肺炎鏈球菌； 幽門螺桿菌；淋病奈瑟氏球菌；A族鏈球菌；布氏疏螺旋體；粗球孢菌；莢膜組織胞漿 菌；B型腦膜炎奈瑟氏球菌；弗氏志賀氏菌；大腸桿菌；流感嗜血菌。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述病原微生物是金黃色葡萄球菌。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述病原微生物是表皮葡萄球菌。
16.如權(quán)利要求10至15任何一項所述的方法，其中所述核酸文庫是λ文庫。
17.由如權(quán)利要求10至16任何一項所述的方法鑒定的多肽。
18.如權(quán)利要求17所述的多肽，其選自由SEQID NO 14-19組成的組中。
19.一種制備如權(quán)利要求17或18所述多肽的方法，包括ω提供一種細胞及細胞培養(yǎng)條件，所述細胞被權(quán)利要求4至9任何一項所述的載體 轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染；和(ii)從所述細胞中或其生長環(huán)境中純化所述多肽。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述載體編碼并因此為所述重組多肽提供一種促 進所述多肽純化的分泌信號。
21.由權(quán)利要求4至9任何一項所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。
22.如權(quán)利要求21所述的細胞，其是一種原核細胞。
23.如權(quán)利要求21所述的細胞，其是選自真菌細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、哺乳 動物細胞、植物細胞的一種真核細胞。
24.一種含有權(quán)利要求16或17所述的至少一種多肽的疫苗。
25.權(quán)利要求24所述的疫苗，其進一步包含一種載體和/或佐劑。
26.一種免疫動物抵抗一種病原微生物的方法，所述方法包含給該動物施用前述任一 權(quán)利要求所述的至少一種多肽或其一部分，或前述任一權(quán)利要求所述的疫苗。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述動物是人。
28.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述疫苗或抗原多肽是通過直接靜脈注 射，肌肉內(nèi)注射或皮下注射給予的。
29.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述疫苗或抗原多肽是口服給予的。
30.如權(quán)利要求26至29任何一項所述的方法，其中所述疫苗是抵抗葡萄球菌屬細菌 的疫苗。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述疫苗是抵抗金黃色葡萄球菌的疫苗。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述疫苗是抵抗表皮葡萄球菌的疫苗。
33.一種抗體或至少是其一個有效部分，其至少結(jié)合權(quán)利要求16或17所述的多肽的 一個選擇部分。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體，其是一種單克隆抗體。
35.如權(quán)利要求33或34所述的抗體，其中所述的有效部分包括Fab片段。
36.如權(quán)利要求33至35任何一項所述的抗體，其是一種嵌合抗體。
37.如權(quán)利要求33至35任何一項所述的抗體，其是一種人源化抗體。
38.如權(quán)利要求33至37任何一項所述的抗體，其中所述抗體被提供一種標志，標記 或標簽。
39.如權(quán)利要求38所述的抗體，其中所述抗體被提供一種選自放射性標記，熒光標 記，附加表位的標志。
40.權(quán)利要求34至39任何一項所述的抗體，所述抗體以融合多肽的形式產(chǎn)生。
41.一種適合于表達權(quán)利要求34至40任何一項所述的抗體的載體。
42.一種用權(quán)利要求41所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。
43.一種生產(chǎn)權(quán)利要求34或40所述的抗體的方法，包括i)提供一種用權(quán)利要求41所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞及細胞培養(yǎng)條件；和ii)從所述細胞或其生長環(huán)境中純化所述抗體。
44.一種產(chǎn)生權(quán)利要求34所述的抗體的雜交瘤細胞系。
45.權(quán)利要求33至40任何一項所述的抗體在制備用于治療與金黃色葡萄球菌相關(guān)的 敗血癥、食物中毒或皮膚損害的藥物中的用途。
46.權(quán)利要求33至40任何一項所述的抗體在制備用于治療與表皮葡萄球菌相關(guān)的敗 血癥、腹膜炎或心內(nèi)膜炎的藥物中的用途。
47.制備一種產(chǎn)生權(quán)利要求34所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，其步驟包括i)用一種免疫原免疫一種有免疫活性的哺乳動物，所述免疫原包含至少一種具有 SEQ ID NO 14-19的氨基酸序列的多肽或其片段；ii)將被免疫的具有免疫活性的哺乳動物的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞；iii)篩選由步驟Gi)中的雜交瘤細胞產(chǎn)生的、具有結(jié)合ω中氨基酸序列的活性的單 克隆抗體；iv)培養(yǎng)雜交瘤細胞使其增殖和/或分泌所述單克隆抗體；和 V)從培養(yǎng)上清液中回收單克隆抗體。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述免疫活性哺乳動物是小鼠。
49.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述免疫活性哺乳動物是大鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定由病原微生物所表達的抗原多肽的方法；包含所述多肽的疫苗；制備所述多肽的重組方法；和針對所述多肽的治療用抗體。
文檔編號G01N33/15GK102021184SQ201010510019
公開日2011年4月20日 申請日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月20日
發(fā)明者基爾斯蒂·布魯梅爾, 菲利普·麥克道爾, 西蒙·克拉克, 西蒙·福斯特 申請人:比奧辛內(nèi)克斯公司, 謝菲爾德大學(xué)