專利名稱：一種聯合檢測相思子毒素和蓖麻毒素的膠體金試紙及專用單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聯合檢測相思子毒素和蓖麻毒素的膠體金試紙及專用單克隆抗 體。
背景技術：
相思子毒素(Abrin)和蓖麻毒素(Ricin)是從植物種子中分離的毒性很強的植物 毒素，其中相思子毒素分子量約為62KD，pI6.9 ；蓖麻毒素分子量約為65KD，pI7.3。這 兩種毒素具有相同的AB鏈結構和相同的致病機制，而且分子量大小也相似，具有較高的 同源性。自美國遭受9.11恐怖襲擊和炭疽芽孢事件發(fā)生后，世界各國開始高度關注生物 恐怖襲擊。由于這兩種毒素天然資源比較豐富，制備比較容易，并且借助當今高度發(fā)達 的生物工程技術手段，還能夠實現大批量生產。毒素中毒后無特異癥狀，出現癥狀時已 經造成機體嚴重的器質損害，給中毒的治療及預防帶來極大的難度，具備生物毒素武器 典型特征，因此歷來為外軍所高度重視，相思子和蓖麻毒素均被美國疾病預防控制中心 (Centers for Disease Control, CDC)列為最有可能作為生物恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑。這兩種 毒素具有極強的細胞毒性作用，相思子毒素為IC5(l4.8X10-llmol/L(兔網織紅細胞)，小 鼠腹腔LD50達0.04 μ g/kg ；而蓖麻毒素IC50為1.8 X 10-10mol/L (Hela細胞)；小鼠腹腔 注射 LD5Q3 μ g/kg。因此，在當前國內外嚴峻的反恐形勢下，尋求新的對相思子毒素和蓖麻毒素快 速、有效的鑒定方法，具有十分現實的軍事和民防價值。而對于相思子和蓖麻毒素的 檢測和鑒定，傳統(tǒng)的方法已不能滿足當前反恐形勢的要求。因此，發(fā)展和建立多重、特 異、靈敏的相思子和蓖麻毒素檢測方法是十分急需、重要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種抗相思子毒素的單克隆抗體。本發(fā)明所提供的抗相思子毒素的單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC Νο.4062 的Abrin-a A鏈單克隆抗體細胞株分泌的。保藏編號為CGMCC Νο.4062的Abrin_a A鏈單克隆抗體細胞株也屬于本發(fā)明的
保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測相思子毒素和/或蓖麻毒素的膠體金 試紙。本發(fā)明所提供的用于檢測相思子毒素和/或蓖麻毒素的膠體金試紙，包括樣品 墊、膠金墊、反應墊和吸收墊，其依次連接；所述膠金墊包被有膠體金探針；所述反應 墊上設有檢測位置1、檢測位置2和質控位置，檢測位置1包被有抗相思子毒素的抗體， 檢測位置2包被有抗蓖麻毒素的抗體，質控位置包被有抗抗體；所述膠體金探針為如下1)和2)的混合物1)膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物；2)膠體金與抗蓖麻毒素 的抗體的偶聯物。上述膠體金試紙中，檢測位置1包被的抗相思子毒素的抗體和膠體金與抗相思 子毒素的抗體的偶聯物中，抗相思子毒素的抗體可為單抗也可為多抗。上述膠體金試紙中，檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體和膠體金與抗蓖麻毒 素的抗體的偶聯物中，抗蓖麻毒素的抗體可為單抗也可為多抗。上述膠體金試紙中，所述檢測位置1包被的抗相思子毒素的抗體中，所述抗相 思子毒素的抗體是由保藏編號為CGMCC No.4062的Abrin-a A鏈單克隆抗體細胞株分泌 的。上述膠體金試紙中，所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體中，所述抗蓖麻 毒素的抗體為抗蓖麻毒素的多克隆抗體；所述膠體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物中， 所述抗蓖麻毒素的抗體為抗蓖麻毒素的多克隆抗體。該多克隆抗體具體可以是以脫毒的 蓖麻毒素為免疫原免疫兔得到的。其中蓖麻毒素的氨基酸序列具體可如SEQ ID NO 2 所示。上述膠體金試紙中，所述膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物中，所述抗相 思子毒素的抗體為抗相思子毒素的多克隆抗體。該多克隆抗體具體可以是以脫毒的相思 子毒素為免疫原免疫兔得到的。其中相思子毒素的氨基酸序列具體可如SEQID NO: 1所
7J\ ο上述膠體金試紙中，所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體中，所述抗蓖麻 毒素的抗體為兔來源的抗蓖麻毒素的多克隆抗體；所述膠體金與抗相思子毒素的抗體的 偶聯物中，所述抗相思子毒素的抗體為兔來源的抗相思子毒素的多克隆抗體；所述膠體 金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物中，所述抗蓖麻毒素的抗體為兔來源的抗蓖麻毒素的多 克隆抗體。上述膠體金試紙中，所述檢測位置1包被的抗相思子毒素的抗體的濃度為2mg/ mL，所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體的濃度為1.5mg/mL。上述膠體金試紙中，所述膠體金探針是按照包括如下步驟的方法制備得到的 用HAuCl4水溶液和檸檬酸三鈉水溶液制備得到膠體金溶液；將所述膠體金溶液的pH值調至8.0，再向膠體金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗 體，混勻并放置30min，再加入抗相思子毒素的抗體，混勻并放置30min，再用牛血清白 蛋白進行封閉，離心，收集沉淀；重懸沉淀，得到膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯 物與膠體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物的混合物，即得到所述膠體金探針；所述抗蓖 麻毒素的抗體與所述膠體金溶液的配比為3mg 100ml,所述抗相思子毒素的抗體與所述 膠體金溶液的配比為3mg IOOml ；上述膠體金試紙中，所述樣品墊的材質是玻璃纖維素膜，所述膠金墊的材質是 玻璃纖維素膜，所述反應墊的材質是硝酸纖維素膜，所述吸收墊的材質是吸水濾紙；所述抗抗體為羊抗鼠抗體。上述任一所述的單抗可以用細胞體外培養(yǎng)的方法制備得到。膠體金試紙條中膠體金與抗體通過靜電引力和疏水作用結合，因而不會影響抗 體活性。膠體金本身具有肉眼可見的顏色，無需儀器即可判讀結果，無需洗滌，不形成免疫復合物的標記抗體通過層析作用自動分離，既簡化了操作步驟，又減少了影響實驗 結果的干擾因素。該法通常能在15min內完成檢測，樣品處理方法簡便、操作靈活、運 輸方便、不需要其他輔助儀器，結果可直觀判斷，而且試紙條自帶質量控制線，實驗結 果一目了然。本發(fā)明的膠體金試紙具有敏感度高、特異性高、精密度高、準確度高、成 本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優(yōu)點。用本 發(fā)明試紙檢測相思子毒素的方法，簡便、快速、直觀、準確，適用范圍廣，成本低，易 推廣應用。


圖1為試紙條靈敏度檢測結果。圖2為試紙條特異性檢測結果。圖3為試紙條穩(wěn)定檢測結果。圖4為試紙條對模擬樣品的檢測結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。硝酸纖維膜(NC膜)，購于美國Millip0re公司，產品目錄號為HFB 504 ；玻璃 纖維膜，購于美國Millipore公司；吸水濾紙購自Minipore公司。實施例1、相思子毒素單克隆抗體和多克隆抗體的制備一、雜交瘤細胞的制備(一 )抗原制備重組質粒 pET-HisA 在文獻(Abrin—aA chain expressed as soluble form in Escherichiacoli from a PCR-synthesized gene is catalytically and functionally active Li-Chun Wang a，b，Lin Kang a，Ting-Mao Hu b，Jing-LinWang a， * Biochimie
86(2004)327-333)中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研 究所得到。質粒pET-HisA中含有相思子毒素A鏈的編碼基因。1、相思子毒素A鏈重組基因工程菌表達抗原蛋白將重組質粒pET-HisA轉入E.coliBL21中，Amp抗性篩選，測序鑒定，得到陽 性重組菌，記作BL21-pET-HisA。將重組工程菌BL21-pET_HisA按1 100接入Amp 抗性LB培養(yǎng)基中，130rpm，37°C過夜培養(yǎng)。次日將過夜培養(yǎng)的菌體按1 100接入Amp 抗性LB培養(yǎng)基中，200rpm，37°C, 5h待OD6tltl約0.6時分別保菌，并加入IPTG lmmol/ L，200rpm> 37°C, 4h誘導表達。將誘導表達后的菌體6000rpm，4°C,離心IOmin后 棄上清，將菌體加入PBS重懸，6000rpm、4°C、離心IOmin棄上清。將收集的菌體加 入無咪唑Buffer混勻，冰浴超聲破碎，至液體清亮后離心分別收集上清和沉淀，收集的 上清即為可溶性目的蛋白溶液。2XSDS，12%變性蛋白電泳分析。結果蛋白分子量為 31.0kDa。2、相思子毒素A鏈重組基因工程菌表達抗原蛋白純化親和純化標簽是6X組氨酸標簽，組氨酸的咪唑側鏈可親和結合鎳金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合，在低pH下用咪唑競爭洗 脫。將5mL次氨基三乙酸(NTA，Amersham公司)層析介質裝入2cmX IOcm玻璃
層析柱中，用去離子水洗數遍，直至介質中的乙醇被洗盡，然后緩慢加入5體積0.1M的 NiSO4,使Ni2+與介質充分結合，以5體積去離子水洗柱，除去未與介質結合的NiSO4, 用5體積的平衡液平衡柱，將收集的蛋白經0.45μιη濾器過濾后裝人鎳柱，依次用含 30mM、40mM、50mM、80mM、lOOmM、150mM、200mM 咪唑的平衡液洗脫，每個咪 唑濃度5mLX5次洗脫(即5個柱體積)，分步收集。2XSDS，12%變性蛋白電泳分析。以Ni-NTA親和柱純化來自500mL表達工程菌中的相思子重組蛋白A，經咪唑 濃度梯度洗脫，結果目的蛋白均出現在IOOmM咪唑濃度第2柱體積開始洗脫下來的溶 液中，穿透液中無目的蛋白。分別收集100mM-2、3、4、5、6 (柱體積)，150mM_l、 2(柱體積)，經BandScan5.0圖像軟件分析，重組蛋白A的純度為96.2%。由于重組蛋 白液的體積稍變大，采用超濾法來濃縮蛋白，使蛋白濃度達到4mg/mL。( 二)動物免疫以實驗(一)中制得的蛋白作為免疫原，取50 μ g免疫原與等體積的福氏完全佐 劑充分混勻，首免BALB/c健康小鼠，鼠齡在6 8周，0.5ml/只，腹腔注射。兩周后 用IOOug蛋白和等體積福氏不完全佐劑加強免疫1次；隔三周后再用IOOug蛋白和等體積 福氏不完全佐劑加強免疫1次；二免后每周斷尾取血，間接ELISA測定效價。細胞融合 前3天加強免疫一次。(三)細胞融合和克隆化鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按7 1比例(數量配比)與SP2/0骨髓 瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽 性孔進行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌相思子毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將該細 胞株命名為2號(1F8C5C3H1)，該細胞株已于2010年8月17日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.4062，分類命名 為Abrin-a A鏈單克隆抗體細胞株。二、單克隆抗體的制備(一)由雜交瘤細胞制備單抗的方法將已經建立的雜交瘤細胞株CGMCC No.4062接種于細胞培養(yǎng)基中，置于37°C和5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔2d換一次細胞培 養(yǎng)基，待細胞濃度大于105/ml時停止換液，持續(xù)培養(yǎng)到細胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清， 1500rpm,離心10分鐘，取上清；上清含有高水平的單克隆抗體，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ?述細胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基(購于美國BioWhittaker公司，產品目錄號為12-727F)， 所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。( 二)單抗純化方法瓊脂糖親和層析柱購自Amersham公司，產品目錄號為17-5080-01。用瓊脂糖親和層析柱進行純化。具體步驟如下將親和柱以平衡緩沖液(1L 平衡緩沖液由IOOOml 20mM PB緩沖液和300mmol NaCl組成，pH7.8)平衡，待柱平衡 后，將步驟(一)得到的上清經0.45 μ m濾膜濾過后以lmL/min流速上柱，用平衡緩沖液以lmL/min流速洗脫雜蛋白，監(jiān)測，待雜蛋白洗脫徹底后換洗脫液(0.1M檸檬酸緩沖 液，pH4.0)將抗體洗下。收集洗下的抗體，收集試管事先已加適量的lmol/L，pH 9.0的 Tris-HCI,使pH恢復至7.4左右，以免失去活性。純化好的抗體以PB (5mM，pH7.4) X 作液4°C透析，24h，每8h換一次液，再10000r/min離心30min，收集上清，-70°C保存(三)單抗鑒定方法12% SDS變性電泳分析純度達95 %。三、單抗的性能驗證包被液按照如下方法配制Na2C031.59克，，NaHC032.93克，用NaOH調pH 至9.6，定容至IOOOml密封蓋好，4°C存放備用；封閉液按照如下方法配制稱取3g BSA溶于IOOmlPBST中備用；洗滌液(PBST)按照如下方法配制將999.5ml PBS (0.01M、pH7.2)緩沖液和 0.5mlTween-20混合，得到洗滌液。(一)相對親和力常數脫毒的天然相思子毒素按照實驗四中所述方法制備。間接ELISA測定單抗相對親和常數，將脫毒的天然相思子毒素用包被液稀釋至 8yg/ml,加入酶聯孔，ΙΟΟμΙ/孔，4°C過夜。次日，吸出孔內液體，用洗滌液洗板三 遍，在加入封閉液，150μ1/孔，37°C孵育Ih后棄孔內液體，重復洗板步驟。將純化 好的單克隆抗體梯度稀釋100yg/ml 0.0125 μ g/ml(具體為100yg/ml、50 μ g/mk 25μ g/ml> 12.5μ g/ml> 6.25μ g/ml> 3.125 μ g/ml、1.6yg/mK 0.8μ g/ml> 0.4 μ g/ ml、0.2 μ g/ml、0.1 μ g/ml、0.05 μ g/ml、0.025 μ g/ml、0.0125 μ g/ml)，100 μ 1/ 孔， 37°C孵育lh。洗板后加入稀釋好的酶標二抗(羊抗鼠IgG)，ΙΟΟμΙ/孔，37°C孵育Ih后 洗板顯色，于波長450nm測定A值。以McAb的不同濃度為橫坐標，以其相應的A值為 縱坐標，繪制McAb的測定曲線。以各曲線上部趨于平坦段的A值為100%，找出50% A值對應的McAb的濃度，其倒數即為本株McAb的相對親和力常數，為5.26 X 106。( 二 )效價與特異性應用間接ELISA法進行。將BSA蛋白(陰性對照)、蓖麻毒素、相思子毒素分別 用包被液稀釋，包被酶聯板，每孔100yL(濃度為lOyg/mL)，4°C過夜后，以PBST洗 3次，用封閉液進行封閉，37°C放置lh，PBST洗3次，加入梯度稀釋的抗體(抗體的初 始濃度為 2mg/mL)l IO2, 1 IO3, 1 IO4, 1 IO5, 1 IO6, (100 μ L/孔)，設置 空白對照，37°C作用lh，用PBST洗3次，加入PBST稀釋羊抗鼠IgG(l 60000稀釋， 100 μ L/ L ), 37°C作用lh，用PBST洗3次，加顯色液OPD，顯色5min后，用2mol/L H2SO4終止反應，測A450值，陰性均值的2.1倍判定為陽性?？贵w在1 IO5時經肉眼 觀察和測A450值均為陽性，故判定其抗體效價達105?？贵w與蓖麻毒素包被的酶聯孔經 肉眼觀察和測A450值均為陰性，說明該抗體與蓖麻毒素無交叉反應，特異性良好。四、相思子毒素多克隆抗體的制備(一 )脫毒的相思子毒素制備相思豆在文獻(相思豆毒素研究及應用王利春，王景林生物技術通訊.V0115. No2, Mar, 2004)中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研 究所獲得。
氨苯基-β -D-半乳糖苷瓊脂糖親和介質(Sigma)、Sephacryl S-100G75凝膠預 裝柱(GE)、玻璃層析柱 5mL2cmX IOcm(AKTA)。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍R250、二硫蘇糖醇(DTT)等均為Sigma公 司產品；低分子量蛋白marker (Amersham Biosciences)、硫酸銨(Amresco0191)其余緩沖 液試劑磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等均為國產分析純；實驗用 水為亞沸蒸餾水、透析袋(DM-IOmm)。提取將相思豆去殼后稱取100g，浸泡于PBS(0.01M，pH7.2)中24h，至種子腫 脹；浸泡后的種子以ddH20反復沖洗去除種子上外膜及顏色，將洗凈的種子置于 500mLPBS(0.01M, pH7.2)緩沖液中，于勻漿機中勻漿，并于4°C條件下放置24h ；次 日，將浸提液用脫脂紗布濾去殘渣后，在4°C下以12000rpm離心20min，取上清液， 0.45 μ m濾膜過濾，上清液調pH7.2，為黃綠色液體；向上清液中緩慢加入飽和硫酸銨溶 液(pH7.4)至飽和度為30%，4°C磁力攪拌Ih后靜止1小時，12000rpm離心20min，棄沉 淀；將上清液繼續(xù)加飽和硫酸銨液體至90%飽和度，4°C磁力攪拌lh，靜止過夜24h;次 日混合液在4°C條件下以12000rpm離心20min，取沉淀為黃綠色；將沉淀用PBS緩沖液 (10mM，pH7.4)50mL溶解后，于4°C條件下對PBS緩沖液透析48h (每8h換一次液)，透 析后經1200g4°C離心20min，取上清，即為相思子毒素粗提液，蛋白定量，12%變性、 非變性SDS電泳分析；-20°C冰凍保存。親和層析純化親和層析介質為氨苯基_ β -D-半乳糖苷瓊脂糖親和介質(購自 sigma公司，產品目錄號為A-0414)。取5mL親和介質真空脫氣后，緩慢裝入層析柱，注 意避免產生氣泡和斷層，以至少10倍柱床體積的PBS進行清洗平衡。將相思子毒素粗提 液經0.45 μ m的濾膜過濾后，以平衡液10倍體積稀釋，以lmL/min流速加入層析柱內， 使相思子毒素和凝集素充分吸附在柱上。待相思子毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脫雜蛋白，流速控制在lmL/min左右，雜蛋白洗脫完全后，改用含有0 0.2M半乳糖 的PBS緩沖液進行步進式梯度洗脫，整個過程分部收集，紫外檢測其吸收值進行監(jiān)控。 收集各吸收峰處組分，真空干燥離心濃縮后對PBS透析除去半乳糖，冰凍備用。透析袋 應煮沸清洗后使用，透析時每隔2h更換一次透析液，隨著透析時間的延長，更換透析液 的時間也可適當延長，時間總計24h以上。平衡液為0.01M，pH7.2的PBS緩沖液。凝膠過濾層析凝膠過濾柱為SephaCrylTMS-100G75凝膠預裝柱，購自 Amersham公司。將親和層析濃縮后的樣品經0.22 μ m的濾膜過濾后上樣，上樣體積 為3mL，濃度10mg/mL左右；以PBS為洗脫液進行洗脫，流速0.5mL/min，分部收集 3mL/管，紫外測定后合并第二吸收峰各組分，12%變性、非變性SDS電泳分析為相思子 毒素蛋白；得到的相思子毒素透析、濃縮后-20°C保存。脫毒用PBS(0.1M，pH 7.4)稀釋凝膠過濾后的相思子毒素蛋白至0.2_0.3mg/ ml,放置PBS緩沖液(0.1M，pH 8.1)中，35°C透析7天，然后再放入PBS (0.01M，pH 7.4)中透析48h，12000rpm離心lOmin，取上清液分裝，_20°C保存。天然的相思子毒素蛋白和脫毒的相思子毒素蛋白的氨基酸序列均為SEQID NO l.o
2、相思子多克隆抗體制備多克隆抗體可委托生物公司制備，也可自己制備。自己制備的方法如下用脫毒的天然相思子毒素200 μ g與等體積的福氏完全佐劑充分混勻，免疫新西 蘭純種大耳白兔。兩周后用0.5mg脫毒的天然相思子毒素和等體積福氏不完全佐劑加強 免疫1次；隔三周后再用Img脫毒的天然相思子毒素和等體積福氏不完全佐劑加強免疫 1次；此后每周耳緣靜脈采血，間接ELISA測定效價。加強免疫后的第7天，血清的效 價最高，為106(多抗效價測定方法與單抗效價測定方法相同，包被抗原的濃度為IOyg/ ml)；取此血清進行多抗純化。用瓊脂糖親和層析柱進行純化。具體步驟如下將親和柱以平衡緩沖液(1L 平衡緩沖液由1000ml 20mM PB緩沖液和300mmol NaCl組成，pH7.8)平衡，待柱平衡 后，將兔血清經0.45μιη濾膜濾過后以平衡緩沖液10倍體積稀釋后，再以lmL/min流速 上柱，用平衡緩沖液以lmL/min流速洗脫雜蛋白，監(jiān)測，待雜蛋白洗脫徹底后換洗脫液 (0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.0)將抗體洗下。收集洗下的抗體，收集試管事先已加適量的 lmol/L, pH 9.0的Tris-HCI，使pH恢復至7.4左右，以免失去活性。純化好的抗體以 PB(5mM, pH7.4)工作液 4°C透析，24h,每 8h 換一次液，再 10000r/min 離心 30min，收 集上清，-70°C保存?zhèn)溆?。實施?、蓖麻毒素的多抗制備—、制備脫毒的蓖麻毒素蓖麻種子購自北京秀禾種子有限公司，產品目錄號為蓖麻1號。粗提將蓖麻種子去殼后稱取100g，浸泡于PBS(0.01M，pH7.2)中24h，至種 子腫脹；去殼洗凈，將洗凈的種子置于500mLPBS(0.01M，pH7.2)緩沖液中，于勻漿機 中勻漿，并于4°C條件下浸提過夜24h(放置24h)；次日，將浸提液用脫脂紗布濾去殘渣 后，在4°C下以12000rpm離心20min，取上清液，0.45 μ m濾膜過濾，上清液調pH7.2 ； 向上清液中緩慢加入飽和硫酸銨溶液(pH7.4)至飽和度為30%，4°C磁力攪拌Ih后靜止1 小時，12000rpm離心20min，棄沉淀；將上清液繼續(xù)加飽和硫酸銨液體至90 %飽和度， 4°C磁力攪拌lh，靜止過夜24h ；次日混合液在4°C條件下以12000rpm離心20min，取沉 淀為白色；將沉淀用PB(10mM，pH7.4)50mL溶解后，于4°C條件下對PBS緩沖液透析 48h(每8h換一次液)，透析后經1200g4°C離心20min，取上清，即為蓖麻毒素粗提液， 蛋白定量，12%變性、非變性SDS電泳分析；-20°C冰凍保存。親和層析純化親和層析介質為氨苯基_ β -D-半乳糖苷瓊脂糖親和介質(購自 sigma公司，產品目錄號為A-0414)。取5mL親和介質真空脫氣后，緩慢裝入層析柱， 注意避免產生氣泡和斷層，以至少10倍柱床體積的PBS進行清洗平衡。將蓖麻毒素粗 提液經0.45 μ m的濾膜過濾后，以平衡液10倍體積稀釋，以lmL/min流速加入層析柱 內，使蓖麻毒素和凝集素充分吸附在柱上。待蓖麻毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脫雜蛋白，流速控制在lmL/min左右，雜蛋白洗脫完全后，改用含有0.1M半乳糖的 PBS緩沖液一步洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，12%變性、非變性SDS電泳分析。平衡液 為0.01M，pH7.2的PBS緩沖液。凝膠過濾層析凝膠過濾柱為SephaCrylTMS-100G75凝膠預裝柱，購自
Amersham公司。將親和層析濃縮后的樣品經0.22 μ m的濾膜過濾后上樣，上樣體積為5mL,濃度2mg/mL;以PBS為洗脫液進行洗脫，流速0.5mL/min，紫外測定后合并第 二吸收峰各組分，12%變性、非變性SDS電泳分析為蓖麻毒素蛋白；得到的蓖麻毒素透 析、濃縮后-20°C保存。脫毒用PBS(0.1M，pH 7.4)稀釋凝膠過濾后的蓖麻毒素蛋白至0.2_0.3mg/ ml,放置PBS緩沖液(0.1M，pH 8.1)中，35°C透析7天，然后再放入PBS (0.01M，pH 7.4)中透析48h，12000rpm離心lOmin，取上清液分裝，_20°C保存。天然的蓖麻毒素蛋白的氨基酸序列均為SEQIDNO : 2。二、蓖麻毒素多克隆抗體制備多克隆抗體可委托生物公司制備，也可自己制備。自己制備的具體方法如下用脫毒的蓖麻毒素200 μ g與等體積的福氏完全佐劑充分混勻，免疫新西蘭純種 大耳白兔。兩周后用0.5mg脫毒的天然相思子毒素和等體積福氏不完全佐劑加強免疫1 次；隔三周后再用Img脫毒的天然相思子毒素和等體積福氏不完全佐劑加強免疫1次； 此后每周耳緣靜脈采血，間接ELISA測定效價。加強免疫后的第7天，血清的效價最 高，為106(多抗效價測定方法與相思子毒素單抗效價測定方法相同，不同的是包被原為 蓖麻毒素，包被原的濃度為lOyg/ml)；取此血清進行多抗純化。多抗純化與相思子毒素的多抗純化方法相同。實施例3、膠體金試紙的制備及性能檢測一、制備(一)樣品墊的制備樣品墊的材料為玻璃纖維膜；將玻璃纖維膜進行如下處理，以有效去除膠體金試紙的非特異現象及增加其靈 敏度將樣品墊置于含鼠血清蛋白、pH為9.9、O.lmol/L碳酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C 烘2h備用；鼠血清蛋白在緩沖液中的終濃度為0.4% (體積百分含量)。封閉劑可以封 閉過多的結合位點，提高PH值可以使樣品中蛋白更易結合。(二)膠金墊的制備1、確定最低偶聯抗體濃度的確定(1)取11只潔凈的試管，分別編號1、2、3、…7，在已編號的7個試管內，分 別加入pH值為8.0的膠體金溶液lmL。將抗相思子毒素兔多抗和抗蓖麻毒素兔多抗分別 稀釋至0.2mg/mL，并分別進行如下步驟(2)和(3)。(2)在2 6號管內分別加入0.2mg/mL單抗溶液250μ1、200 μ 1、150 μ 1、 100 μ 1、50 μ 1，第1、7管不加作對照，混勻，放置5min。(3)在2 6號管內分別加入10% (質量百分含量)NaCL水溶液100 μ L，1號 管不加作對照。混勻后室溫靜置20min，觀察顏色變化。未加抗體(7號對照管)及抗體 加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現由紅變藍的變化，而加入抗體量達到 或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(1號試管)相比，顏色最接近、 含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為ImL膠體金所必須的抗體穩(wěn)定劑量。實驗結果表明，ImL膠體金溶液的抗相思子毒素兔多抗的最低穩(wěn)定劑量為 30 μ g，ImL膠體金溶液的抗蓖麻毒素兔多抗的最低穩(wěn)定劑量為30 μ g。2、膠體金探針制備將0.01% (質量百分含量)HAuCl4水溶液煮沸，再加入(質量百分含量)檸檬酸三鈉水溶液，混勻并繼續(xù)加熱，直到液體顏色穩(wěn)定成 葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；其中HAuCl4水溶液與檸檬酸三鈉水溶液的體積比為 IOOml 1.5ml ；(混勻時持續(xù)加熱，一般約IOmin，但主要依據液體顏色而定。)調節(jié)膠體金溶液pH值至8.0，向膠體金溶液中先加入抗蓖麻毒素兔多克隆抗 體，混勻，室溫(25°C)放置30min，再加入抗相思子毒素兔多克隆抗體(抗蓖麻毒素兔 多克隆抗體與膠體金溶液的配比為3mg 100ml,抗相思子毒素兔多克隆抗體與膠體金 溶液的配比為3mg IOOml ；)，混勻并室溫(25°C )放置30min ；再加入牛血清白蛋白 (BSA) (BSA在混合溶液中的質量百分濃度為1%;目的是封閉)，混勻并室溫(25°C)靜 置lOmin，再4°C靜止15min，以12000rpm，4°C離心30min，棄上清，收集沉淀；將沉底 以重懸液(1L重懸液組成988ml 0.01M、pH 8.0的Tris-HCL緩沖液，50g BSA，IOg蔗 糖，12ml Tween-20)溶解，以12000rpm，4°C離心30min，棄上清，留下管底暗紅色疏松 狀沉淀；用重懸液重新懸浮沉淀，得到膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物與膠體金 與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物的混合物，即得到所述膠體金探針溶液，置4°C保存。膠體金顆粒與膠體金探針的電鏡觀察用透射電鏡分別對膠體金顆粒與膠體金 探針進行檢測。結果，透射電鏡下，可見膠體金顆粒呈圓形或橢圓形，大小均勻一致， 計數100個金顆粒，顆粒直徑約為25nm;膠體金偶聯抗體后，可見金顆粒外圍有明顯的 低電子密度暈圈，表面吸附有蛋白。結果表明，制備的膠體金顆粒和免疫金探針合格。3、膠金墊的制備用玻璃纖維膜作支撐物，在支撐物上加膠體金探針，37°c干 燥 2.5h。(三)反應墊的制備用硝酸纖維素膜(NC膜)作為支撐物，向膜上噴涂相思子毒素單抗條帶、抗蓖 麻毒素兔多抗條帶、羊抗鼠抗體條帶。檢測帶1 (Tl帶)噴涂相思子毒素單抗(以5mM PBS緩沖液稀釋成2.0、1.5、 l.Omg/mL的濃度)。檢測帶2(T2帶)噴涂蓖麻毒素的多抗(以5mM PBS緩沖液稀釋成 2.0、1.5、1.0mg/mL的濃度)。質控帶(C帶)噴涂羊抗鼠抗體lmg/mL。用CAMAG 公司的Camag Linomat 5TLC點樣儀將樣品噴到2.5mm寬的NC膜上(點樣速度為50mm/ S)。把劃完線的NC膜置于37°C干燥2h，得到反應墊。用相應天然毒素檢測以確定最佳的抗體噴膜濃度。分別將天然相思子毒素和蓖 麻毒素稀釋成50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、2yg/mL,以制備好的膠體金免疫層析 試紙條按照方法檢測，PBS溶液樣品作為陰性對照。當Tl帶噴膜濃度為1.5或l.Omg/ mL時，檢測相思子濃度僅達100ng/mL以上；T2帶噴膜濃度為2.0或1.5mg/mL時，檢 測靈敏度均可達50ng/mL，而噴膜濃度為1.0mg/mL時，靈敏度下降至lOOng/mL以上。 應選擇陽性帶顯色，無交叉反應且所需抗體量最低的噴膜濃度。實驗設3次重復，結果一致。結果表明，最佳噴膜濃度分別為Tl帶2mg/ mL, T2帶1.5mg/mL，無非特異反應。(四)試紙的制備免疫層析試紙由吸收墊、膠金墊、反應墊和樣品墊四部分依次連接而成。吸收墊的材質是吸水濾紙。將樣品墊、膠金墊、反應墊和吸收墊依次按順序疊加粘到PVC板上；樣品墊的末端與膠金墊的始端相連，膠金墊的末端與反應墊的始端相連，反應墊的末端與吸水墊 的始端相連，得到膠體金試紙。組裝成完整的試紙條，然后切割成4mm/條，干燥避光 保存。檢測帶和質控帶均為與試紙條的長相垂直的條帶狀。二、膠體金試紙的使用方法取稀釋好的待檢測樣品100 μ L加入到膠體金試紙的樣品墊始端(或向膠體金試 紙的樣品墊中滴加稀釋好的待檢測樣品80 μ L)，15min后，用肉眼觀察檢測帶和質控帶 的顯色情況，根據其顯色情況，判定樣品中是否含有相思子毒素和蓖麻毒素。判定方法如下陰性當質控帶顯示為紅色條帶，而檢測帶不顯色時，判為陰性。陽性當質控帶顯示為紅色條帶，檢測帶1同時也顯示為紅色條帶，判為相思 子毒素陽性；當質控帶顯示為紅色條帶，檢測帶2同時也顯示為紅色條帶，判為蓖麻毒 素陽性；當質控帶顯示為紅色條帶，檢測帶1、2同時也顯示為紅色條帶，判為相思子和 蓖麻毒素陽性；無效當質控帶不顯色時，則無論檢測帶顯示為紅色條帶與否，該膠體金試紙 均判為無效。該膠體金試紙的檢測原理當在試紙的樣品墊端滴加待測樣品溶液后，待檢溶 液流向膠金墊并與膠金墊中的膠體金探針(即金標抗體)通過抗原-抗體相互作用而結 合，并繼續(xù)向反應墊擴散，并最終滲入吸收墊中。若待檢測樣品溶液中含有相思子毒 素，相思子毒素與膠金墊中的抗相思子毒素的兔多克隆抗體結合，形成抗原-多抗復合 物，當其擴散至反應墊時，抗原-多抗復合物中的抗原會與檢測帶1上的抗相思子毒素單 抗結合，進而檢測帶1顯色。若待檢測樣品溶液中含有蓖麻毒素，蓖麻毒素與膠金墊中 的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗體結合，形成抗原-多抗復合物，當其擴散至反應墊時，抗 原-多抗復合物中的抗原會與檢測帶2上的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗體結合，進而檢測帶 2顯色。三、膠體金試紙的性能檢測下述實驗中，樣品處理液的組成PBS(0.01M，pH7.2)+0.5% Tween-20。相思子毒素為實施例1中制備，蓖麻毒素為實施例2中制備。(一)靈敏度檢測實驗組1:將相思子毒素用樣品處理液稀釋成如下不同濃度2yg/mL、 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL ；實驗組2:將蓖麻毒素用樣品處理液稀釋成如下不同濃度2yg/mL、200ng/ mL、100ng/mL、50ng/mL ；實驗組3:將兩種毒素以相同濃度等體積混合后，再梯度稀釋成400ng/mL、 200ng/mL、100ng/mL (即混合液中，兩種毒素的濃度分別依次為400ng/mL、200ng/ mL、100ng/mL)；分別用實驗一制備的膠體金試紙按照實驗二中所述方法檢測。同時以PBS緩沖 液為對照。實驗設3次重復，結果均一致。結果如圖1所示。圖中，A表示對相思子毒素的單獨檢測結果；B表示對蓖麻毒素的單獨檢測結果；C表示對兩種毒素的同時檢測結 果；結果顯示該試紙條單獨檢測蓖麻或相思子毒素時靈敏度達50ng/mL，同時檢 測兩種毒素時靈敏度達100ng/mL。(二)特異性評價葡萄球菌腸毒素B (SEB)購自SIGMA公司，產品目錄號為S0812。將相思子毒素、蓖麻毒素、葡萄球菌腸毒素B (SEB)、牛血清白蛋白均用PBS 分別配制成濃度為lOOng/mL的溶液；將相思子毒素和蓖麻毒素以相同濃度等體積混合 后，再梯度稀釋成lOOng/mL的溶液(即混合液中，兩種毒素的濃度分別為lOOng/mL)。 分別用實驗一制備的膠體金試紙按照實驗二中所述方法檢測。實驗設3次重復，結果一致。結果試紙條特異性良好，與葡萄球菌腸毒素B、 牛血清白蛋白均無交叉反應(圖2)。(三)穩(wěn)定性試驗將新制備的膠體金試紙條于37°C存放2天、3天、4天或5天；取存放5天的試 紙進行檢測，以檢測試紙條的敏感性。實驗組I(Abrin):將相思子毒素用樣品處理液稀釋成如下不同濃度IOOng/ mL、50ng/mL ；實驗組2 (Ricin)將蓖麻毒素用樣品處理液稀釋成如下不同濃度lOOng/mL、 50ng/mL ；實驗組3(Both)將兩種毒素以相同濃度等體積混合后，再梯度稀釋成200ng/ mL、100ng/mL ；(即混合液中，兩種毒素的濃度分別依次為200ng/mL、100ng/mL)PBS溶液樣品作為陰性對照。實驗設3次重復，結果一致。結果存放2天、3天、4天、5天的試紙條的靈 敏度無顯著差異(圖3)，和新制備的檢測試紙條相比(圖1)，靈敏度沒有明顯下降，且 特異性仍很好。說明該試紙條可在室溫存放6個月(根據生物制品規(guī)程中快速穩(wěn)定性試 驗規(guī)定37°C存放20天相當于室溫存放18個月，根據此推算5天相當于6個月)。(四)模擬環(huán)境檢測檢測樣品的制備Both將兩種毒素以相同濃度等體積混合后，分別用下述牛奶混合液、橙汁混 合液、土壤溶液或水進行梯度稀釋至如下濃度400ng/mL、200ng/mL、lOOng/mL(即 混合液中，兩種毒素的濃度分別依次為400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL),分別得到 的稀釋液分別用于檢測。Ricin 將蓖麻毒素分別用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水進行梯 度稀釋至如下濃度200ng/mL、lOOng/mL、50ng/mL,分別得到的稀釋液分別用于檢 測。Abrin 將相思子毒素分別用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水進行 梯度稀釋至如下濃度200ng/mL、lOOng/mL、50ng/mL,分別得到的稀釋液分別用于 檢測。1、牛奶將牛奶與PBS緩沖液以1 4的體積比混合，得到牛奶混合液；
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2、果汁將橙汁與PBS緩沖液以1 4的體積比混合，0.IM K2CO3水溶液調節(jié) PH7.4,得到橙汁混合液；3、自來水。4、土壤用PBS緩沖液溶解土壤(土壤與PBS緩沖液的配比為2g IOml)， 得到土壤溶液。實驗設3次重復，結果一致。結果如圖4所示，該試驗證明該試紙條在檢測模擬 樣本時，對相思子毒素的檢測靈敏度為50ng/ml，對蓖麻毒素的檢測靈敏度為50ng/ml， 對相思子毒素和的蓖麻毒素共同檢測時靈敏度為lOOng/ml;說明該試紙條可以檢測模擬 環(huán)境樣本。
權利要求
1.抗相思子毒素的單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo.4062的Abrin-a A鏈單 克隆抗體細胞株分泌的。
2.保藏編號為CGMCCNo.4062的Abrin_a A鏈單克隆抗體細胞株。
3.—種用于檢測相思子毒素和/或蓖麻毒素的膠體金試紙，包括樣品墊、膠金墊、 反應墊和吸收墊，其依次連接；所述膠金墊包被有膠體金探針；所述反應墊上設有檢測 位置1、檢測位置2和質控位置，檢測位置1包被有抗相思子毒素的抗體，檢測位置2包 被有抗蓖麻毒素的抗體，質控位置包被有抗抗體；所述膠體金探針為如下1)和2)的混 合物1)膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物；2)膠體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯 物。
4.根據權利要求3所述的膠體金試紙，其特征在于所述檢測位置1包被的抗相思子 毒素的抗體中，所述抗相思子毒素的抗體是由保藏編號為CGMCC No.4062的Abrin-a A 鏈單克隆抗體細胞株分泌的。
5.根據權利要求3或4所述的膠體金試紙，其特征在于所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體中，所述抗蓖麻毒素的抗體為抗蓖麻毒素 的多克隆抗體；所述膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物中，所述抗相思子毒素的抗體為抗相思 子毒素的多克隆抗體；所述膠體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物中，所述抗蓖麻毒素的抗體為抗蓖麻毒素 的多克隆抗體。
6.根據權利要求3-5中任一所述的膠體金試紙，其特征在于所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體中，所述抗蓖麻毒素的抗體為兔來源的抗 蓖麻毒素的多克隆抗體；所述膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物中，所述抗相思子毒素的抗體為兔來源 的抗相思子毒素的多克隆抗體；所述膠體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物中，所述抗蓖麻毒素的抗體為兔來源的抗 蓖麻毒素的多克隆抗體。
7.根據權利要求3-6中任一所述的膠體金試紙，其特征在于所述檢測位置1包被的 抗相思子毒素的抗體的濃度為2mg/mL，所述檢測位置2包被的抗蓖麻毒素的抗體的濃度 為 1.5mg/mL0
8.根據權利要求3-7中任一所述的膠體金試紙，其特征在于所述膠體金探針是按 照包括如下步驟的方法制備得到的用HAuCl4水溶液和檸檬酸三鈉水溶液制備得到膠體 金溶液；將所述膠體金溶液的pH值調至8.0，再向膠體金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗體，混 勻并放置30min，再加入抗相思子毒素的抗體，混勻并放置30min，再用牛血清白蛋白進 行封閉，離心，收集沉淀；重懸沉淀，得到膠體金與抗相思子毒素的抗體的偶聯物與膠 體金與抗蓖麻毒素的抗體的偶聯物的混合物，即得到所述膠體金探針；所述抗蓖麻毒素 的抗體與所述膠體金溶液的配比為3mg 100ml,所述抗相思子毒素的抗體與所述膠體金 溶液的配比為3mg IOOml ；
9.根據權利要求3-8中任一所述的膠體金試紙，其特征在于所述樣品墊的材質是玻璃纖維素膜，所述膠金墊的材質是玻璃纖維素膜，所述反應墊的材質是硝酸纖維素 膜，所述吸收墊的材質是吸水濾紙； 所述抗抗體為羊抗鼠抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聯合檢測相思子毒素和蓖麻毒素的膠體金試紙及專用單克隆抗體?？瓜嗨甲佣舅氐膯慰寺】贵w，是由保藏編號為CGMCC No.4062的Abrin-a A鏈單克隆抗體細胞株分泌的。本發(fā)明的膠體金試紙具有敏感度高、特異性高、精密度高、準確度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優(yōu)點。用本發(fā)明試紙檢測相思子毒素的方法，簡便、快速、直觀、準確，適用范圍廣，成本低，易推廣應用。
文檔編號G01N33/558GK102020714SQ20101029188
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權日2010年9月26日
發(fā)明者周陽, 康琳, 王俊虹, 王利春, 王景林, 聶聰, 高姍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所