專利名稱：一種孕婦早產(chǎn)檢測的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種上轉(zhuǎn)發(fā)光法的免疫層析檢測試劑盒的制備方法，涉及了應(yīng)用此 方法進行測試的胎兒纖維連接蛋白fFN免疫層析定量檢測試劑盒的制備，屬醫(yī)療產(chǎn)品技術(shù) 領(lǐng)域，用于對孕婦早產(chǎn)的發(fā)生進行免疫診斷。
背景技術(shù)：
自然界中存在著一些有機或無機物質(zhì)，它們可以受電磁輻射激發(fā)，發(fā)射熒光或磷 光。在其發(fā)光的過程中都遵守Stokes規(guī)則，即發(fā)射光的波長長于激發(fā)光的波長。而在20 世紀70年代，有些科學(xué)家卻發(fā)現(xiàn)了一類可以反Stokes規(guī)則產(chǎn)生磷光的特殊材料，這種材 料在紅外光區(qū)(波長> 780nm)被激發(fā)，卻可以發(fā)射波長遠短于激發(fā)光的可見光(波長 475nm-670nm)，即能量上轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象被稱為上轉(zhuǎn)發(fā)光。由某些稀土金屬元素摻雜于晶體的晶格中構(gòu)成的材料具有上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象，在 這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)(host matrix)、吸收子(absorber)和發(fā)射子 (emitter)。作為主基質(zhì)的晶體材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La202S等)、氟化物 (如 YF3、GdF3、LaF3 等)、鎵酸鹽(如 YGa03、Y3Ga5012 等)以及硅酸鹽(如 YSi205、YSi307 等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+) 等；常用作發(fā)射子的稀土金屬離子有鉺離子(Er3+)、鈥離子(Ho3+)、銩離子(Tm3+)、鋱離 子(Tb3+)等。吸收子和發(fā)射子這一離子對在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生 上轉(zhuǎn)發(fā)光的基礎(chǔ)。上轉(zhuǎn)發(fā)光的產(chǎn)生是一個涉及多個光子(至少兩個)的光學(xué)過程。在這個 過程中，上轉(zhuǎn)發(fā)光材料內(nèi)的吸收子(如Yb3+)至少要吸收兩個低能量光子(紅外光區(qū)，如 970nm)，而后經(jīng)過一系列內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換，以非輻射的形式(Al — A2，A2 — A3)將這兩個光子 的能量連續(xù)傳遞給發(fā)射子(如Er3+)，以使其處于激發(fā)態(tài)(A3)。后者接著發(fā)生一個返回基 態(tài)能級的躍遷，釋放一個高能光子(可見光區(qū)，如525nm或540nm)完成能量上轉(zhuǎn)。兩個光子激發(fā)UCP產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的過程(見圖)不同的吸收子、發(fā)射子、主基質(zhì)結(jié)合可使上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(up-converting particle UCP)具有不同的光學(xué)性質(zhì)。如(1)主基質(zhì)相同的情況下，一系列UCP采用相同的吸收子， 不同的發(fā)射子，則它可由相同波長的紅外光激發(fā)，產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光(如980nm紅外 光激發(fā)吸收子_Yb3+_發(fā)射子-Er3+、吸收子_Yb3+_發(fā)射子_Tm3+，分別發(fā)射550nm綠色 可見光、475nm藍色可見光)；采用不同的吸收子，相同的發(fā)射子，則雖經(jīng)由不同的激發(fā)光， 但卻可產(chǎn)生相同的發(fā)射光。(2)主基質(zhì)不同的情況下，UCP光譜特征也將改變(如吸收 子-Yb3+_發(fā)射子-Er3+，在主基質(zhì)YF3、GdF3中，分別發(fā)射紅色和綠色的可見光)。組成的 多樣性決定了 UCP光譜(激發(fā)光譜、發(fā)射光譜)的多樣性，這成為其使用中靈活性的基礎(chǔ)。上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP所具有的這種獨特光學(xué)特性，使其作為新型標記物在生物檢測 領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大的潛能(1)高度的靈敏性獨有的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象確保了 UCP在檢測的過程中絕不存在來 自于外界的背景干擾；
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(2)高度的穩(wěn)定性UCP的發(fā)光現(xiàn)象是產(chǎn)生于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的純粹物理過程，因而完全 避免了來自檢測樣品腐蝕以及自身衰變導(dǎo)致的發(fā)光淬滅；(3)高度的簡易性利用UCP可對全血、尿液、唾液、組織分泌物等進行直接檢測， 而無須樣品預(yù)處理；(4)高度的靈活性UCP具有的可自由組合的多樣化特征光譜(吸收光譜和發(fā)射光 譜)，使其適用于多重分析；(5)高度的安全性無機惰性、紅外光激發(fā)、可見光發(fā)射使得基于UCP的檢測對于 檢測者、被檢測品、環(huán)境均無任何危害。正是上述特點使得UCP作為生物標記物有著極為廣泛的應(yīng)用前景，在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng) 域特別是床旁快速檢測(Point Of Care Testing, P0CT)領(lǐng)域使用。因而在以抗原抗體為 代表的UCP標記技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫層析快速檢測技術(shù)，再利用微型化的光電子 材料可以開發(fā)一種靈敏、快速、定量準確、操控簡易的免疫診斷分析儀床旁快速檢測(Point Of Care Testing,P0CT)是檢測技術(shù)發(fā)展的大勢所趨。POCT 的顯著特點是快速(15分鐘內(nèi)要求獲得數(shù)據(jù))、便攜、操作簡易得到醫(yī)學(xué)診斷結(jié)果。在大型 醫(yī)療中心或?qū)嶒炇沂褂猛?，還能夠走出醫(yī)院，走進社區(qū)，面向基層。胎兒纖維連接蛋白(fetal Fibroneetin, fFN)是一種糖蛋白，分子量約500KD，有 20種不同的分子形式。fFN產(chǎn)生于絨毛膜滋養(yǎng)細胞，主要分布在羊水、胎盤組織及絨毛蛻膜 交界面，在胎盤與子宮蛻膜的相互粘附和保護方面起著重要作用。大量文獻報道，在孕早 期，隨著孕囊種植和附著于子宮內(nèi)膜，fFN可出現(xiàn)于宮頸分泌物中，但孕20周以后，絨毛膜 與蛻膜的融合阻止了 fFN的釋放，所以正常的孕婦在22-35孕周期間fFN的含量極低。只 有當絨毛膜與蛻膜分離、絨毛膜與蛻膜界面的細胞外基質(zhì)遭到機械損傷或蛋白水解酶的降 解時，fFN才可見于宮頸陰道分泌物中。因此，正常妊娠中、晚期羊水和宮頸陰道分泌物中 僅含少量的fFN ；當早產(chǎn)有宮縮時，絨毛膜_蛻膜界面斷裂，fFN滲入羊水和宮頸中，宮頸陰 道分泌物中會出現(xiàn)過量的fFN。宮頸、陰道內(nèi)分泌物fFN陽性提示胎盤與子宮蛻膜的黏附受 到破壞，預(yù)示子宮下段蛻膜與胎膜分離，fFN經(jīng)宮頸漏入陰道內(nèi)，并被認為是非足月妊娠臨 產(chǎn)發(fā)動的一項高危指標。因此，在孕22-35周之間，宮頸陰道分泌物中fFN的水平與是否發(fā) 生早產(chǎn)有很好的相關(guān)性，fFN檢測可作為預(yù)測早產(chǎn)的一個重要客觀指標。胎兒纖維連接蛋白(fFN)檢測是美國FDA批準，用于有早產(chǎn)癥狀的孕婦和有高危 因素孕婦的早產(chǎn)風(fēng)險性評估，用于22-30孕周無癥狀孕婦的常規(guī)篩查和24-35孕周有早產(chǎn) 癥狀孕婦檢查。fFN檢測是美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(ACOG)推薦的常規(guī)用于早產(chǎn)診斷的項目。與傳統(tǒng)方法相比，在孕32周以前，胎兒纖維連接蛋白(ffn)檢測是可靠的，能夠獨 立預(yù)測早產(chǎn)指標。對于孕22-35周的孕婦，ffn檢測可以幫助決定孕婦是否需要進行藥物 治療、臥床休息，是否可以繼續(xù)工作。在一個對2929名無癥狀孕婦研究中，ffn檢測基本上 可以預(yù)測三分之二的、發(fā)生在孕28周前的自發(fā)性早產(chǎn)。對于存在早產(chǎn)癥狀且ffn檢測結(jié)果 是陰性的孕婦，在接下來的7天內(nèi)，99. 5%的孕婦不會發(fā)生早產(chǎn)。我國大約1秒鐘就會有一個早產(chǎn)兒出生；早產(chǎn)是新生兒死亡及致殘的首要原因， 早產(chǎn)兒會表現(xiàn)為聽力喪失、智力發(fā)育遲緩、腦癱、生長緩慢和其它一些健康問題。如何預(yù)測 和早期診斷早產(chǎn)，從而積極處理，減少早產(chǎn)及相應(yīng)并發(fā)癥的發(fā)生，是產(chǎn)前保健的重要任務(wù)之
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以臨界值50ng/ml為判斷標準，運用fFN管理存在早產(chǎn)分娩風(fēng)險的患者，減少的早 產(chǎn)住院的人數(shù)(50%以上)?，F(xiàn)有胎兒纖維連接蛋白fFN試劑為膠體金方法制備，膠體金形成紅色顆粒，靠肉 眼判斷臨界值而判定疾病情況，由于肉眼判斷帶來很大主觀性，導(dǎo)致臨床測試容易導(dǎo)致醫(yī) 患糾紛。因此，應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)開發(fā)胎兒纖維連接蛋白fFN快速檢測試劑應(yīng)用 于臨床POCT領(lǐng)域具有重要臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法的測定胎兒纖 維連接蛋白fFN的免疫層析定量試紙條，具有準確、快速的特點。本發(fā)明的試紙條是檢測原理是通過一系列表面修飾與活化，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 UCP (Up-Converting Phosphor, UCP)顆?？膳c生物活性分子相結(jié)合，利用UPT生物傳感器， 對在層析過程中通過特異免疫反應(yīng)結(jié)合于特定區(qū)域(檢測帶與質(zhì)控帶)的UCP顆粒進行掃 描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗系統(tǒng)實現(xiàn)精確定量或定性。具體地，本發(fā)明提供了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，其特征在于 含有結(jié)合了胎兒纖維連接蛋白fFN抗體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCP)顆粒。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述免疫層析試紙條的分析膜為硝酸纖維素膜。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔、結(jié) 果判讀窗口和終點指示窗口。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果 判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的終點指示
市ο本發(fā)明還提供了一種制備上述免疫層析試紙條的方法，其特征在上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒表 面結(jié)合了胎兒纖維連接蛋白fFN抗體。本發(fā)明還提供了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析快速試劑盒，包括本發(fā)明的 上述免疫層析試紙條。本發(fā)明克服了以往膠體金方法制備的胎兒纖維連接蛋白試紙條，依靠肉眼判斷而 導(dǎo)致主觀性強的缺地，可對樣本檢測進行準確定量。使得胎兒纖維連接蛋白fFN上轉(zhuǎn)發(fā)光 法免疫層析試紙條可以應(yīng)用于臨床。


圖1為兩個光子激發(fā)UCP產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的過程。圖2為附圖為本發(fā)明胎兒纖維連接蛋白上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫定量檢測免疫層析試紙條 免疫層析試紙條的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。其中1為樣品墊、2為結(jié)合墊、3為分析膜、4為吸水墊、 5為粘性低襯、6為胎兒纖維連接蛋白抗體-UCP結(jié)合物、7為檢測帶T線、8為質(zhì)控帶C線。
具體實施例方式下面用實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的具體改進都屬于本發(fā)明要 求保護的范圍。實施例1 胎兒纖維連接蛋白fFN上轉(zhuǎn)發(fā)光試劑盒生產(chǎn)的工藝如下(1)包被將fFN單抗(購買自美國西格瑪公司，SIGMA)稀釋到2mg/ml，作為T線 包被液，將羊抗鼠IgG(購買自北京索萊寶生物科技有限公司)稀釋到2mg/ml，作為C線包 被液。通過噴膜機，將T線包被液和C線包被液包被到硝酸纖維素膜上。晾干，即獲得單克 隆抗體包被膜條。(2) UCP標記單抗本試劑盒中的UCP標記單克隆抗體是用以下步驟獲得，步驟如 下a)稱取IOmg UCP顆粒置于錐形瓶中；b)加入 IOml pH = 7. 2 0. 20M PB ；c)UCP顆粒懸濁液中加入0. 5mg胎兒纖維連接蛋白fFN抗體，再加入無水戊二醛至 終濃度0.1%，攪拌過夜；d) 12000rpm, 4°C，離心 15min，棄上清；e)UCP沉淀物中加入IOml pH = 7. 20. 20M PB,吹打混勻；f) 12000rpm，4°C，離心 15min，棄上清；；g) UCP沉淀物收集待用；(3)凍干結(jié)合墊的制備a)將50ml UCP標記物懸濁液，12000rpm, 4°C，離心30min，棄上清；b)加入 45ml 的凍干液(pH = 7. 20. 20M PB，含 2% BSA，3%蔗糖)；d)將UCP標記物懸濁液按5cm2/ml加于玻璃纖維上；e)真空凍干Ilh;(4)裁剪結(jié)合墊；將凍干的結(jié)合墊裁剪成Icm寬的長條。(5)組裝試紙條；依次將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上，切成 4. Omm寬的紙條。(6)裝塑料卡；將4. Omm寬的試紙條裝到塑料卡底殼中，蓋上塑料卡上殼，壓緊。(7)樣本稀釋液配制；樣本稀釋液成分為pH = 7. 2的0. 20M PB, 1% Tween20。實施例2.胎兒纖維連接蛋白fFN上轉(zhuǎn)發(fā)光定量試劑盒的組成成份1、Ffn-UPT快速檢測試紙條(40人份)2、樣本稀釋液(1瓶，45ml)3、樣品管(40個)4、使用說明書(1份)實施例3 胎兒纖維連接蛋白fFN-UPT免疫層析試紙條的原理該試紙條的原理fFN_UPT快速檢測試紙條采用雙抗體夾心免疫層析方法定量檢 測樣品中胎兒纖維連接蛋白fFN。分析膜上測試區(qū)⑴預(yù)包被抗fFN單抗，質(zhì)控區(qū)(C)預(yù)包 被羊抗鼠IgG，結(jié)合墊上有UCP顆粒標記的另一株抗fFN單抗。反應(yīng)時樣品中fFN蛋白與兩 株抗體反應(yīng)結(jié)合，在T區(qū)形成抗fFN蛋白抗體-fFN蛋白抗原-UCP標記的抗fFN蛋白抗體 復(fù)合物，UCP顆粒在紅外光激發(fā)下發(fā)射可見光，發(fā)射光的強度與樣品中fFN蛋白的濃度成正 比。無論樣品中是否存在fFN蛋白，在C區(qū)都會形成羊抗鼠-UCP標記的抗fFN蛋白抗體復(fù)
6合物。實施例4 本發(fā)明的fFN-UPT試劑盒的質(zhì)量檢測采用本發(fā)明提供的檢測fFN-UPT的上轉(zhuǎn)發(fā)光法檢測試劑盒進行胎兒纖維連接蛋 白fFN含量檢測的步驟為a.在測試前先完整閱讀使用說明書，b.將待測樣本從儲存環(huán)境中取出，編號并且平衡至室溫(20°C -30°C )。c.已經(jīng)擦拭了宮頸分泌物的擦拭子插入試管中，滴入稀釋液0. 5ml，混勻。d.將試紙條置于干凈平整的平面上，取40 μ 1樣本加至UPT免疫層析試紙的加樣 孔，再加入100 μ 1稀釋液，同時開始計時。d.放置15min后，利用UPT生物傳感器對試紙條進行掃描分析。e. UPT生物傳感器顯示測量結(jié)果，Y值為胎兒纖維連接蛋白fFN的濃度，系統(tǒng)默認 單位為ng/ml。檢測指標1)準確性采用試劑盒校準品與相應(yīng)濃度的校準品(來源于美國西格瑪公司) 同時進行分析測定，用雙對數(shù)(或其它適當?shù)?數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線 不顯著偏離平行(t檢驗)，以進口標準品為對照，試劑盒校準品的測定濃度與理論濃度的 比值即為試劑盒校準品的效價。測定結(jié)果應(yīng)符合以下規(guī)定，即試劑盒校準品的效價應(yīng)在 0. 900 1. 100范圍內(nèi)。2)精密度隨機抽取20人份試紙條，用同一份fFN陽性標準品(80ng/ml)按說明 書操作步驟進行重復(fù)測定。計算每次測定結(jié)果，求出均值、標準偏差(SD)和變異系數(shù)CV。 批內(nèi)變異系數(shù)(CV)應(yīng)不高于15%。具體檢測方法如下a.將試紙條、稀釋液及待測樣本平衡至室溫(20 25°C )。b.拆開試紙條的鋁箔袋包裝，將試紙條放置在平整的表面上。c.在試紙條外殼上寫上待測樣本的編號。d.取40 μ 1樣本，加入加樣孔中。e.取100 μ 1稀釋液，加入加樣孔中。f.室溫放置15分鐘。g.在上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀中輸入該批試紙條的參數(shù)，進行測量。h.數(shù)據(jù)處理與fFN定量測定試劑盒配套的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀具有計算濃度功 能。測量完成后儀器自動將T/C值(TEST線/CONTROL線的濃度比值)經(jīng)過計算得到的濃 度值顯示在屏幕上。3)檢測靈敏度根據(jù)fFN標準品稀釋測定結(jié)果，本試劑盒的檢測靈敏度為 5-1000ng/mlo測定20個Ong/ml點，計算平均值和標準差，以(平均值+2倍標準差)在標準曲 線上對應(yīng)的濃度為靈敏度。表3靈敏度檢測數(shù)據(jù) 表4靈敏度檢測結(jié)果 實施例5 本發(fā)明fFN-UPT試劑盒和fFN膠體金試劑盒的性能對比取本發(fā)明fFN-UPT試劑盒和美國Hologic公司的fFN膠體金試劑盒進行了對比檢 測實驗。表5在不同標本中檢出率比較 結(jié)果表明，這2種方法靈敏度關(guān)系沒有差異，即本發(fā)明的fFN-UPT試劑盒與美國 Hologic公司的fFN膠體金試劑盒的性能一致，沒有差異。
權(quán)利要求
一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，其特征在于其上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標記了胎兒纖維連接蛋白fFN抗體。
2.權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于分析膜為硝酸纖維素膜，分析膜上 包被有胎兒纖維連接蛋白fFN抗體。
3.權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其中通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品 墊上；結(jié)果判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢3帶和質(zhì)控帶；終點指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的 終點指示帶。
4.如權(quán)利要求1所述檢測樣品為宮頸分泌物。
5.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)發(fā)光法免疫層析試紙條，其特征在其檢測胎兒纖維連接蛋 白fFN的臨界值為50ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種免疫層析試紙條的測試使用及應(yīng)用這種測試方法的胎兒纖維連接蛋白fFN快速定量試劑。該層析試劑采用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料即UCP作為生物標記物。本發(fā)明涉及了這種上轉(zhuǎn)發(fā)光法試劑的測試使用方法，應(yīng)用此測試方法可快速、簡便、定量的測定被檢測物的含量，為孕婦早產(chǎn)的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/532GK101930007SQ201010241049
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者李華柏, 林長青 申請人:北京熱景生物技術(shù)有限公司