專利名稱：一種利用表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，簡稱SPR) 傳感器檢測睪酮的方法，屬于激素檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
睪酮是一種類固醇類激素，準確檢測其含量在環(huán)境監(jiān)測、食品安全等方面具有重 要的意義和作用。目前應(yīng)用于睪酮素檢測的方法主要有氣相色譜/質(zhì)譜、同位素稀釋質(zhì)譜法、薄層 色譜、化學(xué)發(fā)光、高效液相色譜、酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫分析法等。由于氣相、液相色譜 與質(zhì)譜儀器昂貴、操作麻煩，而薄層色譜的靈敏度較低，不適合定量分析。因此，對睪酮的檢 測多是采用自60年代發(fā)展起來的放射免疫分析方法和80年代興起的酶聯(lián)免疫分析法。放 射免疫分析法必須采用放射性標記物，檢測設(shè)備復(fù)雜，必需用專門的放射性探測器進行測 定，對操作人員也有放射性污染與傷害，需要特殊的防護和去污設(shè)備，此外，因所使用的放 射性標記物的放射性核素時刻都在發(fā)生衰變，特別是如常用的碘-125、碘-131和磷-32等 半衰期短的核素，其保存時期不長，也給測試帶來了不便。酶聯(lián)免疫分析法雖然避免了放射 免疫分析法的污染、繁瑣、保存期短等問題，但由于其檢測范圍窄、靈敏度低等缺點仍不能 滿足需求。在此背景下，國內(nèi)外學(xué)者積極開發(fā)新的檢測技術(shù)和樣品預(yù)處理方法，通過不同途 徑進行努力，以尋求建立靈敏、準確、經(jīng)濟、快速的檢測方法。在這方面，表面等離子體共振 傳感器顯示出很大的優(yōu)勢。表面等離子體共振是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，它通過測量金屬表面物質(zhì)折射率的變化 來研究物質(zhì)的化學(xué)和物理吸附性質(zhì)?；谠撔?yīng)的生物傳感技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、藥 物篩選等多個生化研究領(lǐng)域。與常規(guī)檢測技術(shù)相比，表面等離子體共振具有高靈敏度、響應(yīng) 快、檢測過程快捷、能夠獲得實時數(shù)據(jù)、操作方便、無需標記、可保持分子的生物活性等突出 優(yōu)點，因此受到人們的廣泛關(guān)注。免疫分析方面的研究是表面等離子體共振傳感技術(shù)應(yīng)用 時間最早、應(yīng)用范圍最廣并且發(fā)展最為完善的領(lǐng)域之一，然而由于該技術(shù)對檢測環(huán)境要求 苛刻、造價昂貴以及芯片重復(fù)使用性能較差等難以克服的缺點，限制了表面等離子體共振 技術(shù)在實際檢測中的應(yīng)用。為了進一步改善表面等離子體共振傳感器的性能和應(yīng)用范圍， 科研工作者們開始將分子印跡技術(shù)與表面等離子體共振技術(shù)相結(jié)合，制備出新型的表面等 離子體共振傳感器。這種新型的傳感器不僅僅局限于生物樣品分子，不再受到生物活性探 針分子的限制，而且還提高了傳感器芯片的重復(fù)使用率。本發(fā)明利用光接枝分子印跡聚合物膜的方法制備了表面等離子體共振傳感器芯 片，并利用該芯片對睪酮進行了檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的檢測睪酮含量的方法存在的不足，提供一種利用 表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法，可以應(yīng)用于睪酮超低含量的檢測。
本發(fā)明的原理是將一種睪酮分子印跡識別敏感芯片作為表面等離子體共振傳感 器的傳感芯片，當(dāng)待測樣品通過傳感芯片表面時，根據(jù)表面等離子體共振原理，芯片共振角 的變化值與待測樣品的濃度成正比，因此根據(jù)共振角變化值可以測出樣品中睪酮的含量。一種利用表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法，以睪酮分子印跡識別敏感芯 片作為表面等離子體共振傳感器的傳感芯片，睪酮分子印跡識別敏感芯片包括玻璃基片、 金膜層、單分子烷基鏈層和分子印跡聚合物膜；該芯片由下往上依次為玻璃基片、金膜層、 單分子烷基鏈層和分子印跡聚合物膜；所述的單分子烷基鏈層的結(jié)構(gòu)式為Au-(CH2)nCH3，其中η = 5-17 ；所述分子印跡聚合物膜由目標睪酮模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、制孔劑以及光引 發(fā)劑經(jīng)光照聚合反應(yīng)得到，所述功能單體為丙烯酸、甲基丙烯酸、亞甲基丁二酸、甲基丙烯 酸羥乙酯中的一種或兩種；所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、N, N-二甲基丙烯酰胺、 Ν，Ν-亞甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基 丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一種；所述制孔劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲 酰胺、二甲基亞砜中的一種；光引發(fā)劑為二苯甲酮、安息香雙甲醚、安息香叔丁醚中的一種 或幾種。一種表面等離子體共振傳感器芯片的制備方法，其具體步驟為1)采用真空蒸鍍或濺射的方法在玻璃基片上鍍金膜層；2)將步驟1)中得到的玻璃基片浸入烷基硫醇溶液中，室溫放置5 24h，浸泡完 成后在金膜層2上自組裝一層單分子烷基鏈層；3)將步驟2)中得到的玻璃基片裝入表面等離子體共振傳感器中，表面等離子體 共振傳感器中的流通池用透紫外光玻璃片蓋住，在透紫外光玻璃片背后安裝紫外燈；向表 面等離子體共振傳感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用紫外燈照射聚合溶液，光照時 間根據(jù)所需分子印跡聚合物膜的厚度決定；4)在步驟3)得到的玻璃基片用制孔劑與乙酸配制的高極性洗脫劑洗脫睪酮模板 分子，在分子印跡聚合物膜上留下具有選擇性的空穴和結(jié)合位點，得到基于光接枝分子印 跡聚合物膜的表面等離子體共振傳感器芯片；步驟2)中所述烷基硫醇溶液的溶劑為乙醇、甲醇或三氯甲烷中的一種，所述烷基 硫醇溶液濃度為1 lOOmmol/L，所述烷基硫醇的化學(xué)式為HS (CH2)nCH3，其中η = 5-17 ；步驟3)中所述聚合溶液由濃度為0. 01-0. 05mol/L的睪酮模板分子、功能單體、交 聯(lián)劑、制孔劑、光引發(fā)劑及溶劑組成，其中睪酮模板分子與功能單體的濃度比為1 2 4， 睪酮模板分子與交聯(lián)劑的濃度比為1 4 10，所述光引發(fā)劑的濃度為0.1% l%g/ml;所述功能單體為丙烯酸、甲基丙烯酸、亞甲基丁二酸、甲基丙烯酸羥乙酯中的一種 或兩種，所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亞甲基二丙烯 酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯 基苯中的一種，所述制孔劑為二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基 亞砜中的一種，所述光引發(fā)劑為二苯甲酮、安息香雙甲醚、安息香叔丁醚中的一種或幾種。本發(fā)明的一種利用表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法，其具體步驟為1)將睪酮分子印跡識別敏感芯片固定在表面等離子體共振傳感器中，將有機溶劑 注入表面等離子體共振傳感器中的流通池，使有機溶劑在流通池和表面等離子體共振傳感器中的溶劑瓶中循環(huán)，當(dāng)表面等離子體共振傳感器的反射光強穩(wěn)定不變時，對芯片進行角 度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到芯片在有機溶劑中的共振角度θ 1 ；2)利用有機溶劑分別配制不同濃度的睪酮標準溶液，然后按照由低到高的濃度順 序，分別單獨注入表面等離子體共振傳感器中的流通池，使睪酮標準溶液在流通池和試劑 瓶中循環(huán)；每注入一種標準溶液后，監(jiān)測動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定不變時，再次注 入有機溶劑直至反射光強再次穩(wěn)定不變時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振 光譜圖，得到每種標準溶液對應(yīng)的共振角度θη;3)利用表面等離子體共振光譜圖計算每種標準溶液相對于有機溶劑的共振角度 θ 1的角度位移值Δ θ，Δ θ = θ η- θ \然后以Δ θ為縱坐標，以睪酮標準溶液的濃度為 橫坐標繪制標準曲線；4)將待測樣品溶液注入流通池，使待測樣品溶液在流通池和樣品瓶中循環(huán)，監(jiān)測 動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定時，再次注入有機溶劑直至反射光強再次穩(wěn)定不變時，對 芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到待測樣品的共振角度θχ，計算待 測樣品相對于有機溶劑的共振角度θ 1的角度位移值Δ θ % Δ θ χ = θ ι θ S根據(jù)Δ θ χ在 標準曲線上得到睪酮的含量；上述步驟1)、步驟2)及步驟4)中的有機溶劑均相同，為二氯甲烷、正己烷、三氯甲 烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜類化合物或雜環(huán)類化合物中的一種或兩種。有益效果本發(fā)明利用一種睪酮分子印跡識別敏感芯片作為表面等離子體共振傳感器的傳 感芯片，采用表面等離子體共振檢測法測定樣品中睪酮的含量；該測試方法具有響應(yīng)快速， 一般5-10分鐘內(nèi)即可出結(jié)果；選擇性高，能夠有效測定樣品中睪酮的超低含量；相對于免 疫學(xué)的方法而言，本方法對于檢測環(huán)境要求不是特別苛刻，擴大了應(yīng)用范圍，傳感器芯片可 以重復(fù)利用，降低了檢測成本。


圖1為表面等離子體共振儀芯片結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為實施例1中的標準曲線；1-玻璃片基片，2-金膜層，3-單分子烷基鏈層，4-分子印跡聚合物膜層。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1一種表面等離子體共振傳感器芯片，如圖1所示，包括玻璃基片1、金膜層2、單分 子烷基鏈層3和分子印跡聚合物膜4 ；該芯片由下往上依次為玻璃基片1、金膜層2、單分子 烷基鏈層3和分子印跡聚合物膜4 ；所述的單分子烷基鏈層3的結(jié)構(gòu)式為Au- (CH2) nCH3 ；所述分子印跡聚合物膜4由模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、制孔劑以及光引發(fā)劑經(jīng) 光照聚合反應(yīng)得到，模板分子為所要印跡的目標分子睪酮，功能單體為甲基丙烯酸；交聯(lián)劑 為乙二醇二甲基丙烯酸酯；制孔劑為乙腈；
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一種表面等離子體共振傳感器芯片的制備方法，其具體步驟為1)采用真空蒸鍍的方法在玻璃基片1上鍍金膜層2 ；具體蒸鍍的方法為將 2. 5X 30cm的LASFN9玻璃片放入立式染色缸里，采用2%的去污劑水超聲清洗15分鐘，然 后在二次蒸餾水中超聲浸泡15分鐘，最后用乙醇清洗2次，將載玻片用氮氣吹干；之后在新 制的Piranha溶液即H2SO4與30% H2O2的體積比為3 1的溶液中于60°C加熱一個小時； 再依次用蒸餾水、乙醇沖洗，用氮氣吹干；將清洗好的玻璃片進行真空蒸鍍99. 99%的金， 真空度為1 X ΙΟ"5以上，蒸鍍速率為1A/S，厚度為47nm ；2)將步驟1)中得到的玻璃基片1浸入十二烷基硫醇乙醇溶液中，室溫放置24h， 浸泡完成后在金膜層2上自組裝一層單分子烷基鏈層3 ；3)將步驟2)中得到的玻璃基片1裝入表面等離子體共振傳感器中，表面等離子 體共振傳感器中的流通池用透紫外光的BK7玻璃片蓋住，在BK7玻璃片背后安裝波長λ為 365nm的UV-LED點光源；向表面等離子體共振傳感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用 波長λ為365nm的UV-LED點光源照射聚合溶液，光照70分鐘后停止光照；溶液的組成為 25mM睪酮模板分子，IOOmM甲基丙烯酸，150mM 二甲基丙烯酸乙二醇酯交聯(lián)劑以及0. 5%克 /毫升二苯甲酮光引發(fā)劑的乙腈溶液；4)在步驟3)得到的玻璃基片1用體積比為7 3的乙腈與乙酸混合溶液洗脫模 板分子，得到睪酮分子印跡識別敏感芯片；5)將睪酮分子印跡識別敏感芯片固定在表面等離子體共振傳感器中，將有機溶劑 乙腈注入表面等離子體共振傳感器中的流通池，使乙腈在流通池和表面等離子體共振傳感 器中的溶劑瓶中循環(huán)，當(dāng)表面等離子體共振傳感器的反射光強穩(wěn)定不變時，對芯片進行角 度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到芯片在有機溶劑中的共振角度Q1 = Siocr ；6)利用有機溶劑乙腈分別配制不同濃度的睪酮標準溶液，濃度分別為10_2%01/ L、l(T18mol/L、l(T16mol/L、l(T14mol/L、l(T12mol/L、1 (T1V) 1/L、l(T8mol/L 和 l(T6mol/L，然后按 照由低到高的濃度順序，分別單獨注入流通池，使睪酮標準溶液在流通池和試劑瓶中循環(huán)； 每注入一種標準溶液后，監(jiān)測動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定不變時，再次注入有機溶劑 直至反射光強再次穩(wěn)定不變時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到 每種標準溶液對應(yīng)的共振角度θ η ；7)利用表面等離子體共振光譜圖計算每種標準溶液相對于有機溶劑的共振角度 θ 1的角度位移值Δ θ , Δ θ = θ η-θ S見表1，然后以Δ θ為縱坐標，以睪酮標準溶液的 濃度為橫坐標繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)為R2 = 98. 82% ；如圖2所示；8)將待測樣品溶液注入流通池，使待測樣品溶液在流通池和樣品瓶中循環(huán)，監(jiān) 測動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定時，再次注入有機溶劑直至反射光強再次穩(wěn)定不變 時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到待測樣品的共振角度θ χ = 69. 46，計算待測樣品相對于有機溶劑的共振角度θ 1的角度位移值Δ θ χ = 0. 46，Δ θ χ = θ ι θ\根據(jù)Δ θ χ在標準曲線上得到睪酮的含量為l(T13_7m0l/L，如圖2所示。表1不同濃度溶液的共振角變化值
權(quán)利要求
一種利用表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法，其特征在于具體步驟為1)將睪酮分子印跡識別敏感芯片固定在表面等離子體共振傳感器中，將有機溶劑注入表面等離子體共振傳感器中的流通池，使有機溶劑在流通池和表面等離子體共振傳感器中的溶劑瓶中循環(huán)，當(dāng)表面等離子體共振傳感器的反射光強穩(wěn)定不變時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到芯片在有機溶劑中的共振角度θ1；2)利用有機溶劑分別配制不同濃度的睪酮標準溶液，然后按照由低到高的濃度順序，分別單獨注入表面等離子體共振傳感器中的流通池，使睪酮標準溶液在流通池和試劑瓶中循環(huán)；每注入一種標準溶液后，監(jiān)測動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定不變時，再次注入有機溶劑直至反射光強再次穩(wěn)定不變時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到每種標準溶液對應(yīng)的共振角度θn；3)利用表面等離子體共振光譜圖計算每種標準溶液相對于有機溶劑的共振角度θ1的角度位移值Δθ，Δθ＝θn-θ1，然后以Δθ為縱坐標，以睪酮標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線；4)將待測樣品溶液注入流通池，使待測樣品溶液在流通池和樣品瓶中循環(huán)，監(jiān)測動力學(xué)吸附曲線，待反射光強穩(wěn)定時，再次注入有機溶劑直至反射光強再次穩(wěn)定不變時，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到待測樣品的共振角度θx，計算待測樣品相對于有機溶劑的共振角度θ1的角度位移值Δθx，Δθx＝θx-θ1，根據(jù)Δθx在標準曲線上得到睪酮的含量；上述步驟1)、步驟2)及步驟4)中的有機溶劑均相同，為二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜類化合物或雜環(huán)類化合物中的一種或兩種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用表面等離子體共振傳感器檢測睪酮的方法，屬于激素檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。將睪酮分子印跡識別敏感芯片固定在表面等離子體共振傳感器中，對芯片進行角度掃描，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到共振角度θ1；記錄表面等離子體共振光譜圖，得到每種標準溶液對應(yīng)的共振角度θn；以Δθ＝θn-θ1為縱坐標，以睪酮標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線；將待測樣品溶液注入流通池，記錄表面等離子體共振光譜圖，得到共振角度θx，計算Δθx＝θx-θ1，根據(jù)Δθx在標準曲線上得到睪酮的含量。本發(fā)明具有響應(yīng)快速，一般5-10分鐘內(nèi)即可出結(jié)果；選擇性高，能測定睪酮的超低含量；傳感器芯片可重復(fù)利用，降低了檢測成本。
文檔編號G01N21/41GK101887016SQ20101019304
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者王洋, 韋天新, 魏清泉 申請人:北京理工大學(xué)