專利名稱：嚴(yán)重膿毒病和敗血性休克期間用于快速確定死亡高風(fēng)險病人的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)綜合癥例如嚴(yán)重膿毒病或者敗血性休克治療領(lǐng)域。尤其是，本發(fā)明提供方法和試劑盒以便得到用于有兩個器官衰竭的嚴(yán)重膿毒病病人、比如用于敗血性休克病人的致死性風(fēng)險的早期評估和輔助性治療決定。
背景技術(shù)：
敗血性休克是膿毒病最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，盡管有強(qiáng)烈的治療支持和抗感染的策略來根除感染病灶，但敗血性休克還是具有較差的預(yù)后。膿毒病綜合癥被定義為與對微生物 (細(xì)菌、病毒或者寄生物)的異常存在或者它們的抗原組分的寄主反應(yīng)相關(guān)的癥狀。局部感染可能由于不同的原因擴(kuò)散至全身，伴隨有早期階段控制先天免疫性的血液免疫細(xì)胞的特定活化和第二時間的適應(yīng)性免疫的活化。血液中這樣一種強(qiáng)烈的免疫活化可能反過來靶向那些最初與初始感染無關(guān)的器官，導(dǎo)致免疫毒性和這些器官的功能障礙。敗血性休克的高死亡率(大約50% )來自于器官衰竭、并存疾病和微生物致病性的組合。死亡可能發(fā)生在發(fā)展的不同時期，最常發(fā)生在第一個星期內(nèi)，盡管有強(qiáng)烈的復(fù)蘇。許多檢定治療性干預(yù)的研究已經(jīng)產(chǎn)生重要的但是有爭議的結(jié)果，例如皮質(zhì)甾類 (Annane等人，2002 ；Sprung等人，2008)、被活化的蛋白質(zhì)C (Bernard等人，2001)的使用和嚴(yán)格的血糖控制(van den Berghe等人，2001)。由于缺少一種用于確定預(yù)后的早期的、特異性的和敏感的標(biāo)記物，因此不僅在昂貴的藥物處方和無用的維持生命支持方面給臨床醫(yī)生造成困難，而且在研究項(xiàng)目入選的病人選擇方面也給試驗(yàn)研究員造成困難。已經(jīng)試驗(yàn)了一些有希望的標(biāo)記物，例如降鈣素原(Clec' h等人，2004)、HLA-DR(Mormeret等人，2006)、 IL-6 (Abraham等人，2001)以及可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(sTREM) (Gibot等人，2005)；但是結(jié)果是相沖突的。最近，已近研究了一組新的不同的分子如“內(nèi)動素(endokines) ”、“警報素 (alarmins) ”或者“損傷相關(guān)分子模式蛋白質(zhì)(DAMPs) ”，即在細(xì)胞應(yīng)激條件下被活化或者損害的細(xì)胞所釋放的這些分子(Oppenheim等人，2007)。在這些分子之中，吞噬細(xì)胞SlOO蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)(Vogl等人，2007)和器官功能(Boyd等人，2008)的鈣粒蛋白家族成員在膿毒病中顯得很重要。模式識別的顯著概念包括在感覺中用于高糖化最終產(chǎn)品的多配體受體和Toll樣受體(TLRs)，它們不僅是與病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)而且是內(nèi)源的 DAMP，包括 SlOO 蛋白質(zhì)(Brunn and Piatt, 2006 ；Foell 等人，2007)。S100A8和S100A9基因的過表達(dá)已經(jīng)在接受脂多糖(LPQ或盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) (CLP)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的老鼠中(Vogl等人，2007年)、在與LPS —起溫育的心肌細(xì)胞中(Boyd等人，2008年)、在局部缺血/再灌注之后的腎組織中(Grigoryev等人，2008年)、在LPS注射后的健康志愿者的白細(xì)胞中(Talwar等人，2006年)、以及在一些敗血性休克的病人中顯現(xiàn)出來。自從S100A8和S100A9蛋白在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外空間都被發(fā)現(xiàn)后，它們很可能既在細(xì)胞內(nèi)起作用，也以自分泌或旁分泌的方式起作用。在患敗血性休克的老鼠中，基因表達(dá)和蛋白的水平都很高(Vogl等人，2007年)。很少有研究已經(jīng)檢查過人類敗血性休克中這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水平。

發(fā)明內(nèi)容
最近，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在人類敗血性休克的恢復(fù)期，S100A8與S100A9基因表達(dá)的發(fā)展過程與S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平之間有一個緊密相關(guān)性(Payen等人，2008年)，故將其并入此文以供參考。以下的實(shí)驗(yàn)部分報道了在敗血性休克病人中進(jìn)一步的研究結(jié)果，在發(fā)生第二器官衰竭后的第0天，檢測S100A8與S100A9的基因表達(dá)和S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平。在這個多中心的研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在那些最終存活者與未存活者之間，S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平存在巨大差異，特異性和靈敏度達(dá)100%。這個死亡風(fēng)險的閾值被確定為8. 1 μ g/ ml ο


圖1 敗血性休克存活者(白方框)和未存活者(黑方框)在發(fā)生第二器官衰竭后的第O天和第1天S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平的箱形圖。采用曼惠特尼非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。圖2 在存活者(白方框)和未存活者(黑方框)的循環(huán)白細(xì)胞中用RT-PCR檢測的S100A8(左)和S100A9(右)基因表達(dá)的箱形圖。采用曼惠特尼非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。圖3 用RT-PCR檢測的S100A8和S100A9基因表達(dá)之間的相關(guān)性。采用斯皮爾曼檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。圖4 總?cè)藬?shù)(n = 111)中的28天死亡率預(yù)測的受試者工作特征曲線(ROC)。曲線下面積0. 99。圖5 血漿中根據(jù)結(jié)局的S100A8/A9復(fù)合物的時間趨勢圖。結(jié)果表示為μ g/ml。 括號中是有效人數(shù)。* :"p ^ 0.0001”，用曼惠特尼檢驗(yàn)。圖6 循環(huán)單核細(xì)胞中根據(jù)結(jié)局的S100A8基因表達(dá)的時間趨勢圖。結(jié)果表示為熒光單位。Affymetrix HG-U133 Plus 2. Oarray :2(^917_s_at 上的探針組 ID。括號中是有效人數(shù)。圖7 根據(jù)結(jié)局循環(huán)單核細(xì)胞的S100A9基因表達(dá)的時間趨勢圖。結(jié)果表示為熒光單位。Affymetrix HG-U133 Plus 2. Oarray :20;35;35_at 上的探針組 ID。括號中是有效人數(shù)。圖8 第0天沒有休克的病人的S100A8/A9N = 8存活者N = 8未存活者
具體實(shí)施例方式本文中，術(shù)語“膿毒病”、“嚴(yán)重膿毒病”和“敗血性休克”應(yīng)根據(jù)1991年被美國胸科醫(yī)師協(xié)會(ACCP)和危重病醫(yī)學(xué)學(xué)會(SCCM)建立的以及2001年被確定的定義來理解(levy 等人于2003年)。以下概括了本文的這些和其它的定義
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-“膿毒病”是對感染作出反應(yīng)的系統(tǒng)性炎癥。-“嚴(yán)重膿毒病”被定義為至少有一種器官功能障礙的膿毒病。-在嚴(yán)重膿毒病綜合癥中，最嚴(yán)重的情況會出項(xiàng)兩個器官衰竭，甚至更多。雖然并不是很普遍，一些不同于急性循環(huán)衰竭的且有兩個器官功能障礙的嚴(yán)重膿毒病病例也被觀察到這類病例就是被定義為“至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重膿毒病”，同時也區(qū)別于敗血性休克。-“敗血性休克”被定義為伴有急性循環(huán)衰竭的膿毒病。-“急性循環(huán)衰竭”是持久性的低動脈壓(動脈收縮壓<90mm Hg, MAP小< 60mmHg 或收縮壓從基線下降>40毫米汞柱)，盡管有足夠的容量復(fù)蘇，排除了引起低血壓的其它因素。-“至少有兩個器官衰竭的敗血性休克”是除了急性循環(huán)衰竭之外還至少有一個器官(如腎、肝等)衰竭的敗血性休克。-本文中，被考慮的病人或者患有嚴(yán)重膿毒病，或者患有敗血性休克，但這兩種情況都至少有兩個器官衰竭。對這些病人來說，“第0天”是指第二器官衰竭開始后M小時的這段時間。如上所述，膿毒病是微生物異常存在的后果。能引起膿毒病的非限制性的微生物的例子有1-細(xì)菌革蘭氏陽性桿菌棒狀桿菌梭狀芽胞桿菌李斯特菌芽孢桿菌革蘭氏陰性球菌奈瑟菌革蘭氏陰性桿菌腸桿菌大腸桿菌、志賀桿菌、克雷伯桿菌、沙門菌、沙雷菌、變形桿菌、假單孢菌、耶爾森菌立克次體嗜血桿菌軍團(tuán)桿菌普羅維登斯菌類桿菌革蘭氏陽性球菌鏈球菌葡萄球菌2-病毒皰疹病毒(皰疹病毒科)單純皰疹、巨細(xì)胞病毒、水痘、帶狀皰疹……流感病毒副粘病毒冠狀病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒蟲媒病毒
3-寄生蟲瘧原蟲弓形蟲當(dāng)必要時，其他的定義列于下文中。本發(fā)明的第一個方面是一種用于為患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭的個體、或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的個體體外建立預(yù)后的方法，包含下述步驟⑴從來自于所述個體的生物樣品中，測定S100A8和/或S100A9和/或S100A8/ A9復(fù)合物的水平，(ii)將所述水平和預(yù)定閾值進(jìn)行比較，其中S100A8和/或S100A9和/或S100A8/A9復(fù)合物的水平超過所述預(yù)定閾值表明預(yù)后不良，而S100A8和/或S100A9和/或S100A8/A9復(fù)合物水平低于所述預(yù)定閾值則
表明預(yù)后良好。當(dāng)然，取決于被測定對象的種類(S100A8和/或S100A9和/或S100A8/A9復(fù)合物)，閾值將被預(yù)定為相同。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，S100A8/A9復(fù)合物的水平被單獨(dú)地測定、或者和游離的S100A8 —起測定。可供選擇地，測定總的S100A9(游離的S100A9和在S100A8/A9復(fù)合物中的S100A9)水平。在下文中，“S100A8/A9”將被用于代表S100A8、 S100A9、S100A8/A9復(fù)合物或者它們的組合中的一個種類。根據(jù)這個方法中一個特定的實(shí)施方式，在第二器官衰竭開始后的第0天、第1天或者第2天收集在步驟(i)中使用的生物樣品，以便建立一種早期預(yù)后。在建立早期預(yù)后的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，在第0天收集所述生物樣品。然而，本發(fā)明人證明，在第二器官衰竭開始后的四個星期期間的任何日子，S100A8/A9保持可靠的預(yù)后癥狀(實(shí)施例2)。因此，本發(fā)明的方法也可以用在第二器官衰竭開始后第2天和第觀天之間的任何日期收集的樣品進(jìn)行試驗(yàn)。所述生物樣品可以是比如選自血漿、唾液、尿液、腦脊液、胸膜液和腹膜液。當(dāng)進(jìn)行上述方法時，通過測定患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的個體代表組中的S100A8/A9水平，預(yù)先確定所認(rèn)為的閾值，并且對于這些個體結(jié)局是已知的。計算閾值以便獲得死亡風(fēng)險的最佳預(yù)見性(靈敏性和特異性)。比如，當(dāng)使用與試驗(yàn)部分所描述的技術(shù)相似的技術(shù)來測定血漿中的S100A8/A9 水平時，可以認(rèn)為預(yù)定閾值是7-9 μ g/ml，優(yōu)選7. 8-8. 3 μ g/ml和例如8. 1 μ g/ml。在用于本研究的第一組中，導(dǎo)致第0天和第1天預(yù)后(死亡風(fēng)險)靈敏性和特異性的S100A8/A9 復(fù)合物水平是100%，被認(rèn)為是閾值(實(shí)施例1)。然后確定閾值的相關(guān)性，用于建立在第二器官衰竭開始后的預(yù)后后期(實(shí)施例幻。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠自由地在較大群的病人上重新評估這個閾值，并且通過使用任何種類的技術(shù)來測定S100A8/A9水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以細(xì)化閾值用于特定的亞群，這取決于膿毒病的類型(器官衰竭的數(shù)目和類型、膿毒病的來源(肺、腹部等)、病因(病原體等)、或者任何其它關(guān)于病人或者他們病理的參數(shù)(病人的年齡、相關(guān)的治療、具體的免疫抑制藥物、并發(fā)癥類型等)。實(shí)際上，在沒有休克的嚴(yán)重膿毒病病人的小組中得到的數(shù)據(jù)(參見下面實(shí)施例4)建議，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施該方法用于這類病人的合適閾值可以稍微超過8. 1 μ g/Ι，比如8. 4和9、9. 5或者10 μ g/1 之間。
在一個特定的實(shí)施方式中，通過免疫測定，比如通過使用可特異性地結(jié)合S100A8/ A9復(fù)合物的抗體，完成了步驟⑴中進(jìn)行的測定。特異性地結(jié)合S100A8/A9復(fù)合物(也稱為MRP8/14復(fù)合物)的抗體的一些例子已經(jīng)在文獻(xiàn)比如Uemoto等人(Ikemoto等人，2003) 中有描述。當(dāng)然，可供選擇的技術(shù)可以被用于定量所述生物樣品中的S100A8/A9復(fù)合物， 比如通過Roth等人所描述的技術(shù)(Roth等人，199 。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以使用任何可與S100A8/A9復(fù)合物特異性結(jié)合的分子代替與S100A8/A9復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體，比如抗體片段或者特定設(shè)計的適配體。適配體是單鏈核酸分子(DNA或者RNA)，由于它們與靶分子結(jié)合的能力而被體外選擇；這種選擇可以通過如US 5270163所描述的SELEX方法 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)進(jìn)行。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用人的S100A8/A9復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來得到可與所述復(fù)合物特異性結(jié)合的分子(Korndorfer等人，2007)。在本發(fā)明的上下文中，可以使用可識別除S100A8/A9復(fù)合物之外的游離S100A8或者游離S100A9的抗體或者其他結(jié)合分子、或者可特異性地識別S100A8或者S100A9的游離形式的抗體或者其他結(jié)合分子，如果這些分子使得根據(jù)它們的結(jié)果能夠確定區(qū)分病人的閾值的話。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方法的特定的免疫測定是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定，例如下面實(shí)驗(yàn)部分所描述的測定法?？晒┻x擇地，可以使用熒光標(biāo)記抗體，比如用于進(jìn)行流量血細(xì)胞計數(shù)。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明選擇任何其它免疫測定用于實(shí)施該方法?？晒┻x擇地，可使用不同于免疫測定法的技術(shù)來實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。尤其是， 優(yōu)選地可以使用質(zhì)譜分析來達(dá)到該目的。如果必要，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以結(jié)合一些標(biāo)記物用于建立至少有兩個器官衰竭的膿毒病或者敗血性休克情況下的預(yù)后。在可以與S100A8/A9富集物組合使用的標(biāo)記物當(dāng)中，可以引用降鈣素原(PCT)、N末端腦鈉肽前體(BNP)、可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-l(sTREM)、IL-6和sRAGE，并且可以引用與膿毒病相關(guān)的器官衰竭(SOFA)分?jǐn)?shù)、循環(huán)單核細(xì)胞上的HLA-DR水平、SAPS II分?jǐn)?shù)等等。因此，本發(fā)明也涉及如上所述的方法，其進(jìn)一步包含測定來自于所述病人的生物樣品(該生物樣品與其中測定S100A8/A9濃度的生物樣品相同，或者另一個適當(dāng)?shù)纳飿悠?中至少一個其它種類水平的步驟，和比較所述水平和預(yù)定閾值的步驟。此處，應(yīng)理解術(shù)語“種類”是指任何可以被作為標(biāo)記物使用的成分、分子或者復(fù)合物。在一個特定的實(shí)施方式中，在相同生物樣品中如同測定S100A8/A9那樣來測定所述其它種類，并且所述其它種類從降鈣素原(PCT)、N末端腦鈉肽前體(BNP)、可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-I (sTREM)、IL-6和sRAGE中選擇。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種用于對患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人進(jìn)行跟蹤的方法，其通過測定所述病人的S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平的發(fā)展而進(jìn)行，其中所述水平減少表明所述病人正在恢復(fù)。根據(jù)這個方法，如果病人在第O天的S100A8/A9水平超出上述的預(yù)定閾值，并且如果所述水平仍然超出閾值，則表明該病人有很大的死亡可能性。根據(jù)本發(fā)明的另一個方法的目的在于對患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人進(jìn)行跟蹤，其通過測定所述病人的 S100A8和/或S100A9的表達(dá)水平的發(fā)展而進(jìn)行，其中所述水平減少表明所述病人正在恢復(fù)。這個方法已經(jīng)被D. Payen等人的出版物說明，該出版物并入此文以供參考(Payen等人，2008)。當(dāng)實(shí)施這個方法時，S100A8和/或S100A9的表達(dá)水平優(yōu)選用定量擴(kuò)增法進(jìn)行測定， 比如上述Payen等人所描述的定量RT-PCR。在上述跟蹤方法中，(S100A8/A9復(fù)合物的或者S100A8或S100A9表達(dá)的)測定是在收納病人后的幾個時間點(diǎn)比如第一個星期期間的每一天，然后在來自所述病人的生物樣品上以相同的頻率或者較低的頻率進(jìn)行的，這取決于臨床背景。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于幫助決定病人退出治療的方法，所述病人患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭、或者患有敗血性休克并至少兩個器官衰竭，所述方法包括下述步驟(i)通過如權(quán)利要求1所述的方法，建立所述病人的預(yù)后(在第二器官衰竭開始之后盡可能快)；(ii)在數(shù)天(比如2周)治療后測定來自于所述病人的生物樣品中的S100A8/A9 水平；其中如果觀察到S100A8/A9的水平?jīng)]有減少，以及如果所述臨床狀況仍然嚴(yán)重， 則可決定停止治療。當(dāng)實(shí)施這個方法時，如果病人仍然有兩個以上的器官衰竭，醫(yī)生將會認(rèn)為臨床狀況仍然嚴(yán)重。如果步驟(i)中測定的S100A8/A9水平超出上述閾值、并且在數(shù)天治療之后仍然超出這個閾值，尤其可決定停止治療。因?yàn)楸景l(fā)明提供可靠的預(yù)后標(biāo)記物用于非常嚴(yán)重的情況(即至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重膿毒病或者至少有兩個器官衰竭的敗血性休克)的病人，這個預(yù)后標(biāo)記物可用于更好地選擇被招募進(jìn)入臨床試驗(yàn)的個體，用于試驗(yàn)新的治療方法，目的在于或者提高在病人離開重病監(jiān)護(hù)室前加強(qiáng)支持的持續(xù)時間、或者改進(jìn)這些病理學(xué)結(jié)果。在第一個情況中，被招募的病人是那些具有預(yù)后良好的病人，以便避免涉及“絕望”病人的噪音。因此，本發(fā)明也涉及用于確定是否將至少有兩個器官衰竭的非常嚴(yán)重狀況中的個體招募進(jìn)入臨床試驗(yàn)的方法，該臨床試驗(yàn)用于評估為這種病人縮減加強(qiáng)支持需要的藥物治療的有效性，其中所述方法包含通過上述方法建立所述個體預(yù)后的步驟，并且其中如果S100A8/A9的測定水平低于預(yù)定閾值，則招募所述病人。相反，具有不良預(yù)后的病人將被招募進(jìn)入試驗(yàn)中，該試驗(yàn)用于評估新的用于改善至少有兩個器官衰竭的非常嚴(yán)重狀況的結(jié)局的治療手段，以便使得可能具有嚴(yán)重副作用的藥物不會被給予假設(shè)通過“經(jīng)典的”復(fù)蘇方案就能恢復(fù)的病人，并且使得該結(jié)果不包含噪音，所述噪音與即使沒有這個新的藥物或者治療手段也能恢復(fù)的病人有關(guān)。因此，本發(fā)明也涉及一種用于確定是否將患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的個體招募進(jìn)入臨床試驗(yàn)的方法，該臨床試驗(yàn)用于評估用于改善這種病人結(jié)局的藥物治療的有效性，包含通過上述方法建立用于所述個體預(yù)后的步驟，其中如果測定的S100A8/A9水平超出預(yù)定閾值，則所述個體入選。作為上述方法的必然結(jié)果，本發(fā)明也涉及一種用于檢測用于改善至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重綜合癥結(jié)局的藥物治療有效性的方法，包括下述步驟(i)選擇患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人，并且在開始所述藥物治療之前，測定來自于所述病人的生物樣品中的 S100A8/A9 水平；(ii)從來自于開始所述藥物治療之后的所述病人的至少另一個樣品中，測定S100A8/A9 的水平；(iii)比較所述得到的數(shù)值其中藥物治療開始后S100A8/A9水平的減少表明所述治療對病人是有益的，并且有可能改善至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重綜合癥的結(jié)局。在上述方法的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，在第二器官衰竭開始后的第0天實(shí)施步驟 (i)，并且入選的病人具有的S100A8/A9水平優(yōu)選超出上述預(yù)定閾值。在后來的情況中，如果S100A8/A9復(fù)合物水平降低至低于所述閾值，則新的創(chuàng)新治療被認(rèn)為是有益于病人，并且很可能改善了至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重的綜合癥的結(jié)局。在測定S100A8和/或S100A9的表達(dá)水平、而不是測定S100A8/A9復(fù)合物水平(或者除S100A8/A9復(fù)合物水平之外還進(jìn)行前述測定)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以隨著對病人的跟蹤而改變這個方法用于實(shí)施。如同下面實(shí)施例3中所描述的那樣，S100A9表達(dá)水平比S100A8表達(dá)水平更適合實(shí)現(xiàn)這個目的。本發(fā)明的另一個方面是一種以S100A8/A9測定為基礎(chǔ)的用于實(shí)施上述任何方法的試劑盒，包含可與S100A8/A9特異性地結(jié)合的分子和/或可與S100A8或者S100A9(或者具體是它們的游離形式，或者它們兩者呈游離形式、以及呈S100A8/A9復(fù)合物形式)特異性地結(jié)合的分子，以及解釋關(guān)于嚴(yán)重膿毒病和敗血性休克(特別是具有兩個器官衰竭)結(jié)果的S100A8/A9血漿水平預(yù)測值的使用注意事項(xiàng)。在所述試劑盒的一個優(yōu)選實(shí)施方式中， 所述分子可與S100A8/A9復(fù)合物結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇任何種類的特異性結(jié)合物，例如抗體、抗體片段、適配體、糖類等等，如果這個結(jié)合物可用于測定來自病人的適當(dāng)生物樣品中的S100A8/A9水平，則可將其放入此試劑盒中。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，注意事項(xiàng)也提供用于測定生物樣品(比如血漿樣品)中S100A8/A9水平的方案說明書、以及水平超出可指示病人不良預(yù)后的閾值指征。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在注意事項(xiàng)中顯示與閾值有關(guān)的關(guān)于用試劑盒進(jìn)行的試驗(yàn)靈敏性和特異性的信息。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，試劑盒也可以包含在用于進(jìn)行免疫測定的試劑(緩沖劑、酶、 標(biāo)記分子等等)中選擇的其它成分、質(zhì)量對照、一種以上校準(zhǔn)品等等。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在說明書中和隨后已經(jīng)進(jìn)行的生物實(shí)驗(yàn)中，提供了所需的實(shí)驗(yàn)支持，本發(fā)明的其它特征將會很明顯，并且沒有限制其范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 血漿S100A8/A9復(fù)合物作為敗血性休克的早期預(yù)后標(biāo)志物的多中心評價材料和方法以下報道的所有實(shí)驗(yàn)都是使用下述材料和方法完成的。病人這項(xiàng)多中心研究經(jīng)過Cochin醫(yī)院倫理委員會(#CCPPRB 2061)的批準(zhǔn)，病人從4 個加護(hù)病房中招募(兩個內(nèi)科，兩個外科)。只有符合ACCP/SCCM共同會議(Bone等人，1992 年)所定義的敗血性休克標(biāo)準(zhǔn)的病人才會被選中。入選標(biāo)準(zhǔn)要求敗血性休克的病人至少有兩個SOFA所定義的器官衰竭(Vincent等人，1998年)。第一份血樣在第0天(DO)被采集， 第0天的定義就是發(fā)生第二器官衰竭后的M小時內(nèi)。
訓(xùn)練組招募的這些的病人滿足入選標(biāo)準(zhǔn)，從這些病人中取得血樣用于測定 S100A8/A9復(fù)合物的基因表達(dá)和血漿水平。人數(shù)由計算得到的統(tǒng)計功效而定。在第1天 (Dl)采集第二樣品以檢測標(biāo)記物的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)組的樣品是在倫理委員會批準(zhǔn)后從滿足相同入選標(biāo)準(zhǔn)的病人中獲得的，這些病人是在相同時期(2004年2月到2005年11月)被入選進(jìn)入嚴(yán)重膿毒病多中心研究中 (Programme Hospitalier de Recherche Clinique n° AOR 02006)。這個組是用來驗(yàn)證在第0天從訓(xùn)練組采集的S100A8/A9的血漿復(fù)合物的預(yù)測能力。流式細(xì)胞儀用于單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)測定全血與連接了熒光染料(異硫氰酸熒光素(FiTC)或藻紅蛋白(PE))的下述合適抗體一起溫育抗⑶14-FiTC(克隆RM052，貝克曼考爾特，馬賽，法國)并且連結(jié)了不相關(guān)的同型對照抗體的PE(Simultest對照，BD Biosciences，圣何塞，加州，美國)或抗 HLA-DR-PE (克隆L243，BD Biosciences)。通過使用QFCM(定量流式細(xì)胞術(shù))，將平均熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成每個細(xì)胞連接的抗體(AB/C)數(shù)。血漿細(xì)胞因子測定血漿IL-IO (optEIA set ；PharMingen,圣地亞哥，加州，美國)、IL_12p40 和MIF(R&D Systems，Abingdon，Oxon，英國)的濃度是根據(jù)廠商說明書通過免疫酶法(ELISA)測定的。標(biāo)準(zhǔn)樣品的范圍對于IL-10是7. 8-500pg/ml，對于IL_12p40和 MIF 是 31. 2-2000pg/ml。檢測閾值對于 IL-10 是 2. 7 士 3. lpg/ml,對于 IL_12p40 是 25. 8 士 33. 3pg/ml，對于 MIF 是 25. 7 士 34. 6pg/ml。血漿S100A8/A9復(fù)合物水平該技術(shù)是從以前的公布(Ikemoto等人，2003)中改編的使用從34名健康個體身上采集的血樣，個體以年齡和性別配對。平均0J6yg/ml的水平，其范圍在 0. 052-0. 468 μ g/ml。簡單地說，將100 μ 1的稀釋液加入到覆蓋有第一抗體的96孔聚碳酸酯板的每一個孔中(Μο2Β9 ；0. 166mg/L)。血漿樣品先用工作Block-AceTM(大日本醫(yī)藥有限公司)溶液或MRP8/14復(fù)合物校準(zhǔn)溶液稀釋，再被加入并混合15秒。然后板子溫育1小時使得免疫反應(yīng)進(jìn)行。經(jīng)過5次洗滌，加入100 μ 1的F(ab’ ) 2-生物素結(jié)合物(含0. 5g/ L硫柳汞的工作Block-Ace 溶液中的第二抗體Mo3D》，孔板再溫育1小時。經(jīng)過上述的重復(fù)洗滌，將100 μ 1用工作Block-Ace液稀釋了 1500倍的鏈親合素-HRP結(jié)合物加入其中， 孔板進(jìn)一步溫育30分鐘。通過比色法測定HRP活性。批內(nèi)變異系數(shù)(CVs)是3. 9-5.6%， 日間變異系數(shù)是5. 9-7.6%，平均恢復(fù)率為98% (范圍是85-103% )。試驗(yàn)是由不知情臨床結(jié)局的研究員進(jìn)行的。通過定量RT-PCR測定S100A8-A9的基因表達(dá)RNA樣品是在第0天(DO)和第1天(Dl)通過Ficoll梯度離心法將成熟的PMN 除去后得到的。為了評估未成熟細(xì)胞(粒細(xì)胞系)的比例，細(xì)胞分析包括了通過光散射和 ⑶66表達(dá)(流式細(xì)胞分析儀)得到的形態(tài)特征(Payen等人，2008)。在第0天和第1天，外周血單核細(xì)胞(PBMC)的比例大約是50%。用foieasy試劑盒^jiagen)提取總的RNA，樣品用無RNA酶的DNA酶I處理。在安捷倫的生物分析儀上估計質(zhì)量和數(shù)量，并且在Nanodrop 分光光度計上確認(rèn)總的RNA數(shù)量。根據(jù)廠商(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster City，加州，美國，表 1)說明書，對 S100A8 (Hs00374264_gl)和 S100A9 (Hs00610058_ml)進(jìn)行 qRT-PCR，并與內(nèi)部對照真核18S rRNA(Hs99999901_sl)進(jìn)行比較。結(jié)果用ACt (濃度閾值)表示 CtS100Ax-Ctl8S。表1 用于實(shí)時PCR的基因表達(dá)試驗(yàn)的特征。
基因符號基因名稱NCBI基因號試驗(yàn)ID18S真核 18S rRNAX03205.1Hs99999901—slS100A8, MRP8SlOO鈣結(jié)合蛋白A8NM—002964.3Hs00374264_glS100A9, MRP14SlOO鈣結(jié)合蛋白A9NM—002965.3Hs00610058—ml試驗(yàn)由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司設(shè)計并分配。統(tǒng)計定量的結(jié)果表示為中值和第25-第75百分位數(shù)。用曼惠特尼檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)量變量的比較，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行定性變量。用斯皮爾曼相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性研究。P值<0.05 在統(tǒng)計學(xué)上被認(rèn)為是顯著的?；谝郧霸谌祟悢⊙孕菘松瞎嫉臄?shù)據(jù)(Payen等人， 2008年)，發(fā)明人假定敗血性休克病人的死亡率為40% (Annane等人，2007年；Sprung等人，2008年)，S100A8/A9復(fù)合物在存活者和未存活者之間的差異為2 μ g/ml，標(biāo)準(zhǔn)誤差為 2. 35 (payen等人，2008年)。因此，訓(xùn)練組需要招募47個病人的樣品規(guī)模，控制I型誤差概率為0. 05，把握度(power)為0. 80。S100A8/A9復(fù)合物血漿水平的預(yù)后性能是通過計算ROC曲線下的面積(AUC)確定的。因?yàn)橛?xùn)練組中觀察到的靈敏度和特異性數(shù)值，并且考慮到相對較小的樣本規(guī)模，發(fā)明人給出了基于拉普拉斯方法(Agresti and Coul 1,1998)的對靈敏性和特異性的評估。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，研究了使用同樣的入選標(biāo)準(zhǔn)的第二獨(dú)立組的病人(實(shí)驗(yàn)組)。對兩個組的主要特征進(jìn)行了比較，進(jìn)行了 S100A8/A9復(fù)合物的預(yù)后分析，包括對AUC的估計和基于訓(xùn)練組 S100A8/A9閾值的靈敏度和特異性。在SAS9. 1 (SAS Inc, Cary, NC)及 R2. 8. 0 (http //www. R-project. org)軟件包上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。MS訓(xùn)練組有49位病人入選，他們的臨床特征被總結(jié)在下面表2中，其下面是膿毒病救治指南(Dellinger等人，2004年)。9位病人(18% )接受了活化蛋白C治療，同時35位病人 (71% )用氫化可的松治療。31位病人在前兩天內(nèi)接受了手術(shù)。15位病人在觀天的研究期間內(nèi)死亡，有12位在第一個7天內(nèi)死亡。3位病人在7天后死亡(一個在第M天，兩個在第沈天)，這的確是由于不可治療的呼吸衰竭和嚴(yán)重血氧過少、延遲的多個器官衰竭以及垂死狀況的強(qiáng)制治療限制。在第0天，在存活者和未存活者之間，SAPSII的臨床嚴(yán)重度評分標(biāo)準(zhǔn)不同，而SOFA分?jǐn)?shù)則是相似的(表2)。表2 訓(xùn)練組第0天的臨床特征、膿毒病類型、心血管支持
1權(quán)利要求
1.一種用于為個體體外建立預(yù)后的方法，所述個體患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭，所述方法包括下述步驟(i)從來自于所述個體的生物樣品中，測定S100A8/A9復(fù)合物的水平，( )將所述水平與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，其中，所述S100A8/A9復(fù)合物的水平超過所述預(yù)定閾值的，則表明預(yù)后不良，而所述 S100A8/A9復(fù)合物的水平低于所述預(yù)定閾值的，則表明預(yù)后良好。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在第二個器官衰竭開始后的第0天、第1天或者第2天收集所述生物樣品。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定閾值的范圍是7-9μg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定閾值的范圍是7.8-8. 3 μ g/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定閾值的范圍是8.1 μ g/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自血漿、唾液、尿液、腦脊液、胸膜液和腹膜液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過免疫測定進(jìn)行步驟(i)中的所述測定。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述免疫測定是通過使用與所述S100A8/A9 復(fù)合物特異性地結(jié)合的抗體而進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體被熒光標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述免疫測定是ELISA。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括測定所述生物樣品中至少一種其它種類的水平的步驟和將所述水平與預(yù)定閾值進(jìn)行比較的步驟，其中所述其它種類選自降鈣素原(PCT)、N末端腦鈉肽前體(BNP)、可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(sTREM)、IL-6和 sRAGEo
12.一種用于對患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人進(jìn)行跟蹤的方法，其通過測定所述病人的S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平的變化而進(jìn)行，其中所述水平減少表明所述病人正在恢復(fù)。
13.一種用于對患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人進(jìn)行跟蹤的方法，其通過測定所述病人的S100A8和/或S100A9的表達(dá)水平的變化而進(jìn)行，其中所述水平減少表明所述病人正在恢復(fù)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，通過定量擴(kuò)增法測定所述表達(dá)水平。
15.如權(quán)利要求12或者13所述的方法，其特征在于，所述測定是在收納病人后的幾個時間點(diǎn)上取自于所述病人的生物樣品上進(jìn)行的。
16.一種用于幫助決定病人退出治療的方法，所述病人患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭，所述方法包括下述步驟(i)通過如權(quán)利要求1所述的方法建立用于所述病人的預(yù)后；( )測定來自于治療數(shù)天后的所述病人的生物樣品中的S100A8/A9復(fù)合物的水平；其中，如果觀察到S100A8/A9復(fù)合物的水平?jīng)]有下降且臨床現(xiàn)狀仍然嚴(yán)重，則決定停止治療。
17.一種用于確定是否將患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的個體招入臨床試驗(yàn)的方法，用以評估用于縮減這種病人的加強(qiáng)支持需要的藥物治療的有效性，所述方法包括通過如權(quán)利要求1所述的方法為所述個體建立預(yù)后的步驟，其中，如果測定的S100A8/A9復(fù)合物水平低于所述預(yù)定閾值，則招募所述個體。
18.一種用于確定是否將患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的個體招入臨床試驗(yàn)的方法，用以評估用于改善這種病人的結(jié)局的藥物治療的有效性，所述方法包括通過如權(quán)利要求1所述的方法為所述個體建立預(yù)后的步驟，其中，如果測定的S100A8/A9復(fù)合物水平超過所述預(yù)定閾值，則招募所述個體。
19.一種用于檢測用于改善至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重綜合癥結(jié)局的藥物治療的有效性的方法，包括下述步驟(i)選擇患有嚴(yán)重膿毒病并至少有兩個器官衰竭或者患有敗血性休克并至少有兩個器官衰竭的病人，在所述藥物治療開始之前，確定來自于所述病人生物樣品中的S100A8/A9 復(fù)合物水平；( )從來自于所述藥物治療開始之后的所述病人的至少另一個樣品中，確定S100A8/ A9復(fù)合物的水平；(iii)比較所述得到的數(shù)值；其中，S100A8/A9復(fù)合物水平隨著藥物治療開始而減少，則表明所述治療對病人是有益的，并有可能改善伴有至少有兩個器官衰竭的嚴(yán)重綜合癥的結(jié)局。
20.一種用于進(jìn)行如權(quán)利要求1所述的方法的試劑盒，其包含對S100A8/A9復(fù)合物特異的抗體；和使用注意事項(xiàng)，其用來說明S100A8/A9復(fù)合物的血漿水平在敗血性休克結(jié)局上的預(yù)測值。
21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包含用于進(jìn)行免疫測定的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了方法和試劑盒，以便得到用于有兩個器官衰竭的嚴(yán)重膿毒病病人比如用于敗血性休克病人的致死性風(fēng)險的早期評估和輔助性治療決定。本發(fā)明是基于血漿中的S100A8/A9復(fù)合物水平的測定，因?yàn)镾100A8/A9水平超過預(yù)定閾值就表明預(yù)后不良，而S100A8/A9水平低于所述預(yù)定閾值則表明預(yù)后良好。
文檔編號G01N33/68GK102257387SQ200980151844
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日
發(fā)明者A·C·盧卡謝維奇, D·帕揚(yáng)·德拉加朗代里 申請人:巴黎公眾助理醫(yī)院