專利名稱：Lcms技術(shù)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的LCMS技術(shù)及其在選擇性鑒別和鑒定免疫原性表位的方法中的應(yīng)用，以及其在疫苗開發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)T細(xì)胞對(duì)免疫原性病原體相關(guān)表位的特異性受體介導(dǎo)的識(shí)別是針對(duì)感染性疾病的保護(hù)性免疫性的基礎(chǔ)。在足夠刺激條件下的初始識(shí)別之后，這種表位驅(qū)動(dòng)特異性T細(xì)胞的克隆群的擴(kuò)增、分化和維持。在感染期間，這些T細(xì)胞群解除(disarm)及消除病原體。之后，所述T細(xì)胞群經(jīng)歷強(qiáng)力收縮，但是一小部分得以維持以在再次遭遇特定抗原時(shí)發(fā)起快速記憶應(yīng)答。這個(gè)觀點(diǎn)在疫苗開發(fā)中采用。針對(duì)感染性疾病的疫苗應(yīng)使免疫系統(tǒng)暴露于源于相關(guān)病原體的表位以誘導(dǎo)保護(hù)水平的特異性記憶T細(xì)胞產(chǎn)生。病原體相關(guān)T細(xì)胞表位是來自病原體編碼的蛋白質(zhì)的小蛋白質(zhì)片段，在細(xì)胞內(nèi)加工為抗原呈遞細(xì)胞(后文稱作APC)細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(后文稱作MHC)分子的配體之后暴露。對(duì)于與MHC分子對(duì)肽表位的切除、存活、競(jìng)爭和最終呈遞相關(guān)的過程和酶的了解還非常少。兩種類型的MHC分子參與使表位呈遞至兩種功能性類型的T細(xì)胞。MHC I型分子使表位呈遞至⑶8+T細(xì)胞，而MHC II型分子使表位呈遞至⑶4+T細(xì)胞。為了設(shè)計(jì)未來的疫苗，我們需要關(guān)于T細(xì)胞表位的新的想法。尤其對(duì)于顯示出高可變表面抗原的病原體或者對(duì)于(重新)出現(xiàn)的病原體，保護(hù)性T表位及其抗原仍然是難以分辨的。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)行疫苗學(xué)中的主要慣有觀念(major conventions) 造成了關(guān)于病原體相關(guān)表位的兩種可區(qū)別類型MHC I型Iigandome和MHC II型Iigandome 的知識(shí)缺口(knowledge gap)。首先，基于基因組的抗原揭示(反向疫苗學(xué))已經(jīng)使其進(jìn)入疫苗學(xué)且有希望向我們揭示全部病原體蛋白質(zhì)組。借助于免疫信息學(xué)，通過in silico預(yù)示了表面結(jié)構(gòu)如主要細(xì)菌毒力因子和病毒表面抗原，其可以是候選保護(hù)性抗原。反向疫苗學(xué)方法需要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的重組抗原表達(dá)技術(shù)和免疫原性研究。這種方法的確已經(jīng)成功選擇有希望的疫苗候選物，作為基于PorA的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B疫苗 (Masignani et al. 2002)的備選物。盡管利用反向疫苗學(xué)方法，但是對(duì)于表位的知識(shí)缺口仍存在(i)當(dāng)免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原是病原體的內(nèi)部蛋白質(zhì)時(shí)，反向疫苗學(xué)將不能揭示該免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原；以及(ii)動(dòng)物中的免疫原性也許不能預(yù)示人體中的免疫原性和免疫優(yōu)勢(shì)。其次，基于在高通量MHC結(jié)合和T細(xì)胞測(cè)定中使用來自候選蛋白質(zhì)的合成肽的集合、算法推測(cè)的表位或者甚至整個(gè)蛋白質(zhì)組作為重疊合成肽的傳統(tǒng)T細(xì)胞表位鑒別方法已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)于相當(dāng)大數(shù)目T細(xì)胞表位包括病原體相關(guān)表位的認(rèn)識(shí)。然而，本發(fā)明人認(rèn)為這種方法也受限制這些常規(guī)方法否認(rèn)細(xì)胞內(nèi)天然加工的作用、與存活相反的破壞、表位的選擇和競(jìng)爭以及表位特征(如T細(xì)胞表位在感染期間及對(duì)于不同細(xì)胞類型的初級(jí)序列、多樣性、準(zhǔn)確的分子長度和長度多態(tài)性、豐度、天然變異以及最后，動(dòng)力學(xué))對(duì)于免疫原性的重
4要性。T細(xì)胞表位也通常被認(rèn)為是初級(jí)基因序列的真實(shí)的in Silico可預(yù)測(cè)的翻譯。然而， 越來越多的跡象表明與僅是基于in silico蛋白質(zhì)組學(xué)的預(yù)期相比，初級(jí)蛋白質(zhì)序列的多種類型的翻譯后修飾(在后文稱作PTM)包括磷酸化、糖基化、脫酰胺化、甲基化和剪接以及基因組的異讀框翻譯可導(dǎo)致更多樣化的免疫學(xué)相關(guān)表位集合(Temmerman et al. 2004， Engelhard etal. 2006)。此外，本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到如上文“其次”段落中所述鑒別T細(xì)胞表位的技術(shù)依賴于分離自個(gè)體的周圍血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的體外應(yīng)答，所述個(gè)體對(duì)于感興趣的病原體已經(jīng)變得免疫，且通常在先前的感染中存活下來。典型地，當(dāng)病原體是罕見或者新出現(xiàn)的時(shí)，這些個(gè)體是非常缺乏的。因此，關(guān)于出現(xiàn)的感染性疾病的表位鑒別應(yīng)基于不依賴于使用來自先前感染的個(gè)體的PBMC的新技術(shù)。進(jìn)一步地，本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到病原體相關(guān)MHC I型和MHC II型表位配體(所謂的 ligandome)的鑒別存在技術(shù)難題，需要最大限度的定量和定性靈敏性。一些實(shí)驗(yàn)室的開拓性工作已經(jīng)示出質(zhì)譜分析組合液相層析(LCMQ是目前最有效的分析工具，提供對(duì)于這些類型ligandome的公正認(rèn)識(shí)(Hunt et al. 1992)。然而，目前的方法不能達(dá)到足夠的免疫學(xué)和技術(shù)靈敏性和選擇性以獲得對(duì)于表位特征的公正認(rèn)識(shí)，如源自病原體衍生蛋白質(zhì)的免疫原性表位的準(zhǔn)確序列、多樣性、豐度、PTM和動(dòng)力學(xué)。在疫苗學(xué)中仍需要“免疫蛋白質(zhì)組學(xué)” 以橋連對(duì)于病原體相關(guān)表位的知識(shí)缺口。只有在那時(shí)我們才能識(shí)別真正的免疫原性和保護(hù)性表位以及了解病原體可能逃避其特異性識(shí)別的策略。然而，不顯著改良方法學(xué)則不能認(rèn)識(shí)到迄今為止已知的表位冰山表面下隱藏著什么。MHC表位分析是非常有挑戰(zhàn)性的。APC上的MHC分子呈遞大濃度范圍的大量不同的肽表位。所述系統(tǒng)的靈敏性應(yīng)足以檢測(cè)病原體相關(guān)表位，甚至當(dāng)在含有IO7-IO8個(gè)細(xì)胞的APC細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物中以一個(gè)拷貝/細(xì)胞表達(dá)時(shí)，等于在全部回收時(shí)在柱上 IO-IOOattomole的肽量。所述系統(tǒng)的選擇性應(yīng)足以在幾十萬其它不相關(guān)MHC表位中鑒別這種個(gè)體表位。本申請(qǐng)揭示了在柱技術(shù)學(xué)中關(guān)于綜合表位挖掘(comprehensive epitope mining)的靈敏性、覆蓋范圍和動(dòng)力學(xué)范圍的改良。因此，本發(fā)明的目的是提供新平臺(tái)技術(shù)， 其以靈敏性、選擇性和簡便方式可在單一分析表位樣品中鑒別由保護(hù)性T細(xì)胞識(shí)別為MHC I型和II型配體的免疫原性病原體相關(guān)表位。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到這個(gè)目的通過組合三個(gè)發(fā)現(xiàn)結(jié)果得以解決(i)改良的高靈敏性和有力平臺(tái)LCMS技術(shù)，以檢測(cè)和鑒別高度復(fù)雜的肽混合物中微量的未知肽，組合(ii)特制的體外免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以相關(guān)方式從其來源蛋白質(zhì)中釋放每種類型的免疫原性病原體相關(guān)表位及釋入單一溶液中，以及(iii)(任選存在的)應(yīng)用抗原的選擇性化學(xué)或者物理修飾，以便于樣品中相關(guān)病原體相關(guān)表位的快速和明確識(shí)別和鑒別。液相層析-質(zhì)譜分析(LCMQ裝置從US 2002/146349中獲知，所述文獻(xiàn)以其全部內(nèi)容援引加入本文，特別是關(guān)于所述裝置方面的內(nèi)容。LCMS裝置的目的樣品中待分析物(在本文是指肽)的層析分離通過使用液相層析(LC)柱實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，該柱的內(nèi)徑和長度如下所述(i)獲得最高的可能靈敏性，組合
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(ii)最大的分離效率。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改良的裝備了納級(jí)柱(nanoscale column)的LCMS裝置。在本申請(qǐng)中，改良了 LCMS裝置的不同方面。提供了改良的LCMS平臺(tái)。所述改良的LCMS 平臺(tái)經(jīng)證實(shí)與現(xiàn)有LCMS平臺(tái)相比能進(jìn)行更詳細(xì)的分析。本發(fā)明的另一目的是使得可以明顯延長總分析時(shí)間。發(fā)明描述本發(fā)明的一方面涉及液相層析質(zhì)譜分析(LCMQ裝置。本發(fā)明提供了使用LCMS裝置的改良的分析方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)其部件的改良的方法。本發(fā)明另一方面涉及層析方法，特別是二維液相層析法。本發(fā)明再一方面涉及無鹽二維高效納級(jí)液相層析分離技術(shù)。本發(fā)明再一方面涉及納級(jí)液相層析柱以及用于液相層析應(yīng)用、特別是液相層析質(zhì)譜分析中的這種層析柱的制備。本發(fā)明另一方面涉及電噴射離子化(ESI)發(fā)射器(emitter)，及生產(chǎn)與液相層析柱聯(lián)合使用的發(fā)射器的方法，所述發(fā)射器優(yōu)選與電噴射離子化質(zhì)譜分析(LC-ESI/MS)偶聯(lián)。本發(fā)明另一方面涉及連接納級(jí)LC柱的連接和方法。本發(fā)明再一方面涉及納級(jí)液相層析柱中進(jìn)行(零死體積(zero-dead volume))連接的連接和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了窄徑(narrow bore)(毛細(xì)管)納級(jí)液相層析柱。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明LCMS裝置在鑒別表位的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面涉及鑒別表位的方法，其中所述方法包括如下步驟a)制備包含 MHC I型和MHC II型表位(Iigandome)至少之一的樣品，其中所述表位已經(jīng)被加工并被抗原呈遞細(xì)胞呈遞；b)在本發(fā)明的LCMS裝置中分析在步驟a)中獲得的樣品。本發(fā)明一方面涉及產(chǎn)生包含根據(jù)本發(fā)明方法鑒別的表位的組合物的方法，其中所述方法包括包含所述表位的分子的化學(xué)合成與重組表達(dá)至少之一。在一個(gè)其它方面中，本發(fā)明涉及通過使用本發(fā)明的LCMS裝置和/或本發(fā)明的表位鑒別方法可獲得的表位。本發(fā)明另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明鑒別的表位的應(yīng)用或者包含所述表位的組合物的應(yīng)用。所述表位或者包含所述表位的組合物用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療由攜帶這種表位的病原體所致疾病的疫苗，或者用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的免疫狀況。本發(fā)明的所有這些方面均在下文論述。LCMS 裝置在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LCMS裝置包含柱，優(yōu)選納級(jí)柱以進(jìn)行層析。LCMS裝置包含液相層析(LC)柱，所述LC柱被排列并構(gòu)造成以納升/分鐘(nl/min)范圍的流速運(yùn)行。 這種納級(jí)柱使得層柱有高分離效率，可以改良在質(zhì)譜分析儀(MQ的分析。由于質(zhì)譜分析是作為鑒別肽的強(qiáng)有力的技術(shù)出現(xiàn)的，納級(jí)液相層析結(jié)合質(zhì)譜分析是目前鑒別MHC-呈遞肽的首要可選擇方法，因?yàn)檫@是能提供在低attomole量的各個(gè)肽的序列信息的一種技術(shù)。然而，本發(fā)明實(shí)施方案的應(yīng)用非僅限于LCMS應(yīng)用。通常，LCMS裝置的實(shí)施方案包含混合泵裝置，其具有泵，優(yōu)選高壓液相層析(HPLC)泵，在一個(gè)實(shí)施方案中以便利方式組合分流裝置以非常精確的方式產(chǎn)生混合溶劑系統(tǒng)、分析柱及質(zhì)譜分析儀所需的低流速。所述LCMS裝置進(jìn)一步具有電噴射離子化(ESI)單元，其包含發(fā)射器、涂層及專用電噴射離子化源。所述LCMS裝置包含連接元件以連接各個(gè)毛細(xì)管管材(tubing)。優(yōu)選的實(shí)施方案在下文詳細(xì)論述。液相層析物理地，液相層析(LC)在柱中進(jìn)行，例如圓柱樣結(jié)構(gòu)的柱，在其內(nèi)部具有含有材料的空間(腔)。使用的柱材料和洗脫液通常決定層析的類型。在腔中保持的材料被稱作為靜止相。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將樣品溶解于流動(dòng)相中。樣品和流動(dòng)相流經(jīng)靜止相，在此分離待分析物，然后進(jìn)行測(cè)量或者分析。在隨后的步驟中可以進(jìn)行進(jìn)一步分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中及在LCMS裝置設(shè)置的優(yōu)選實(shí)施方案中，在對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)分離之后，通過質(zhì)譜分析鑒別各個(gè)肽。基于質(zhì)譜分析產(chǎn)生的質(zhì)量(Mw)和結(jié)構(gòu)信息(氨基酸序列)可以鑒別所述肽。LCMS 分析本發(fā)明的目的可以通過對(duì)蛋白酶解消化的蛋白質(zhì)進(jìn)行多維LCMS/MS分析而實(shí)現(xiàn)， 其中強(qiáng)陽離子交換(Strong Cation eXchange，SCX)分級(jí)分離與反相(Reversed Phase,RP) 分離聯(lián)合使用。組合這些分析技術(shù)以提高分離效率和分析的動(dòng)力學(xué)范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在線多維LC方法，其使用陰離子-和陽離子交換顆粒的混合床進(jìn)行第一分離維。捕獲柱在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LCMS裝置包含固相提取(SPE)捕獲柱或者位于分析或分離柱上游的捕獲柱。在捕獲柱中，可以使用強(qiáng)陽離子交換(SCX)或者弱陰離子交換(WAX)樹脂或者SCX與WAX樹脂的混合床。這組成了 LCMS/MS分析的一維。第二維可以在下游分析柱中通過C18反相(RP)層析加入。此外，捕獲柱可以相對(duì)快速將相對(duì)大體積樣品上樣(轉(zhuǎn)移)進(jìn)納級(jí)LC柱中。因此，捕獲柱的內(nèi)徑應(yīng)與分析柱的內(nèi)徑相稱。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含肽(平均至少一種肽)的樣品導(dǎo)入捕獲柱中。優(yōu)選地， 如隨后在本文鑒別，包含表位的肽被鑒別。在一個(gè)實(shí)施方案中隨后將溶劑注入捕獲柱中，這將結(jié)合的肽從捕獲柱中轉(zhuǎn)移進(jìn)反相C18分析柱。在一個(gè)實(shí)施方案中，陰離子-陽離子交換(ACE)固相捕獲柱包含強(qiáng)陽離子與弱陰離子樹脂的混合物。這種混合床從Motoyama(Motoyama et al. 2007)獲知，其中乙酸銨用于回收結(jié)合的肽?，F(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)問題是用于回收結(jié)合的分析物的陽離子鹽包括乙酸銨的應(yīng)用不利地影響第二維中在線反相納級(jí)LC系統(tǒng)的性能。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在第一維中結(jié)合的分析物的回收可以通過無鹽方式實(shí)現(xiàn)。無鹽溶液的應(yīng)用防止了下游反相樹脂惡化。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移或者洗脫溶劑是無鹽溶劑。優(yōu)選地，蟻酸(甲酸)用作轉(zhuǎn)移溶劑。換句話說，甲酸用于洗脫結(jié)合的肽。盡管在文獻(xiàn)中已知甲酸的洗脫強(qiáng)度對(duì)于從離子交換樹脂中回收肽而言太低，但是在實(shí)驗(yàn)中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)甲酸可以用作轉(zhuǎn)移溶劑。對(duì)于這個(gè)令人驚奇的作用的解釋可在包含具有晶體結(jié)構(gòu)的交聯(lián)分子的較多或者較少開放結(jié)構(gòu)的硅石顆粒上WAX樹脂的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，其中甲酸的COO—基團(tuán)可以滲入并置換結(jié)合的分析物(肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鹽酸(HCl)用于這個(gè)目的，但這是次優(yōu)選的。在LCMS裝置或者運(yùn)行這種裝置的方法的實(shí)施方案中，通過捕獲柱加入一定量(例如10μ1)的甲酸和與二甲亞砜的增加強(qiáng)度(濃度)的等摩爾混合物。離開ACE捕獲柱的肽被重新捕獲在反相柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的C18反相捕獲柱上。LC分析柱樣品中待分析物(在本文是指肽)的層析分離通過使用LC分析柱實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述柱的長度為至少50cm，優(yōu)選至少75cm，更優(yōu)選至少85cm，甚至更優(yōu)選至少 90cm。柱的長度對(duì)于LC柱的性能是一個(gè)重要參數(shù)，特別是對(duì)于柱的分離效率而言。在一個(gè)實(shí)施方案中，安裝內(nèi)徑低于70 μ m、優(yōu)選低于55 μ m及在一個(gè)實(shí)施方案中低于50 μ m的用5 μ m C18顆粒填充的至少75cm、例如90cm分析柱對(duì)HLA-A2洗脫樣品進(jìn)行深度分析。樣品以4-h梯度運(yùn)行。質(zhì)譜分析儀被程序化為每個(gè)循環(huán)進(jìn)行1次MS和3次連續(xù) CAD MS/MS 掃描。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用熔融二氧化硅柱。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用熔融二氧化硅毛細(xì)管柱。所述柱包含進(jìn)行液相層析的填料。本發(fā)明提供了填充柱的合適方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LCMS裝置包含納級(jí)柱。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種柱可包含熔融二氧化硅(毛細(xì)管)管材，其具有外半徑和內(nèi)半徑，內(nèi)半徑相應(yīng)于延伸經(jīng)過熔融二氧化硅的腔。優(yōu)選所述納級(jí)管材的外徑在150-1400 μ m范圍內(nèi)。所述管材的外徑優(yōu)選在 200-800 μ m 范圍內(nèi)。所述柱的內(nèi)徑低于75 μ m,優(yōu)選低于55 μ m,更優(yōu)選低于50 μ m,甚至更優(yōu)選低于 30 μ m，更優(yōu)選低于沈μ m。較小的內(nèi)徑將改良LCMS裝置的靈敏性和分離效率。所述內(nèi)腔優(yōu)選直徑在5-100 μ m范圍內(nèi)，更優(yōu)選在16-70 μ m內(nèi)，甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中在18-50 μ m 內(nèi)。這種毛細(xì)管管材可用于5-50nl/分鐘、更優(yōu)選10-30nl/分鐘范圍內(nèi)的流速。LC分析柱的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)LC柱的方法，所述柱包含具有內(nèi)徑為至多 55 μ m的內(nèi)腔的長度為至少45cm、優(yōu)選至少75cm的柱，在所述柱的一端使其熔為玻璃料 (preparing a frit)并將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中液相層析固相材料以在低粘度溶劑中的漿液形式提供。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，低粘度溶劑是在20°C粘度為 0. 32cP的丙酮。LC分析柱的填充根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)LC分析柱的方法，所述分析柱包含長度為至少45cm、優(yōu)選至少75cm的具有內(nèi)徑至多為55 μ m的內(nèi)腔的柱，在柱的一端熔成玻璃料并將合適的液相層析固相材料填充在所述柱中，其中在填充期間對(duì)所述柱進(jìn)行振動(dòng)或者超聲處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)所述柱進(jìn)行超聲處理?，F(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)已知問題是“長” LC分析柱的填充速度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改良的填充方法包括在填充期間振動(dòng)所述柱，優(yōu)選使用超聲振動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在填充期間進(jìn)行超聲振動(dòng)。優(yōu)選地，進(jìn)入所述柱的漿液被振動(dòng)。這改良了填充效率并防止填充床中空隙/孔洞的形成。
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根據(jù)本發(fā)明另一方面，非粘性溶劑如丙酮與填充柱的方法組合使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非粘性溶劑與漿液組合使用。優(yōu)選地使用粘性至少比異丙醇小2倍的溶劑。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，熔融二氧化硅柱的熔為玻璃料的末端(fritted end) 被置于超聲浴中(例如Branson 200)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述超聲處理僅在固相顆粒沖入熔融二氧化硅柱中之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，漿液含有至少150mg懸浮在Iml丙酮中的反相顆粒。在填充期間丙酮相對(duì)于異丙醇通過柱的線速度等于令人驚訝的7士 1倍。電噴射離子化(ESI)和發(fā)射器制造在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LCMS裝置包含用于液相層析的發(fā)射器，偶聯(lián)至具有用于電噴射端頭(tip)的電噴射離子化質(zhì)譜分析(LC-ESI/MQ。所述端頭是還包含涂層及電噴射離子化源的電噴射離子化單元的一部分，優(yōu)選被構(gòu)造并設(shè)置為電噴射從分析柱接受的納升流速(nanolitre flow rate)。已知發(fā)射器的問題是金層特別是靠近端頭末端的金層的破壞，其可導(dǎo)致脈動(dòng)噴射 (pulsating spray)。本發(fā)明的目的是改善發(fā)射器，特別是允許更長的LCMS-ESI運(yùn)行。優(yōu)選地，端頭/發(fā)射器包括一次涂層(primary coating)，優(yōu)選是導(dǎo)電涂層，優(yōu)選是貴金屬如金涂層。二次涂層被用作保護(hù)層。在一個(gè)實(shí)施方案中，二次涂層是導(dǎo)電碳基涂層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，硅基涂層用作二次涂層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用導(dǎo)電聚合物涂層。優(yōu)選地，發(fā)射器由管材形成，優(yōu)選熔融二氧化硅毛細(xì)管管材。在一個(gè)實(shí)施方案中， 發(fā)射器內(nèi)徑至多55 μ m，優(yōu)選至多30 μ m。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種形成發(fā)射器的方法。所述方法包括加熱管材并拉伸以形成具有減小的內(nèi)半徑的端頭。這種減小的內(nèi)半徑進(jìn)一步增強(qiáng)LCMS分析的性能。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制造這種改良的發(fā)射器的方法。制造用于LCMS裝備中的改良的端頭的方法包括用導(dǎo)電碳基涂料涂覆端頭特別是端頭末端的步驟?？拷溴F形末端的端頭內(nèi)徑優(yōu)選在大約2-30 μ m范圍，更優(yōu)選3-10 μ m。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成的發(fā)射器/端頭在錐形末端的發(fā)射器內(nèi)徑為至多10 μ m。在一個(gè)實(shí)施方案中，在兩端拉伸管材并在中間部分加熱。在加熱期間，在中間部分的玻璃變軟，變得拉長，最終折斷。在這個(gè)實(shí)施方案中形成兩個(gè)錐形發(fā)射器。在一個(gè)實(shí)施方案中，拉長的端頭用貴金屬如金涂覆。之后，切割端頭，優(yōu)選靠近錐形(拉長/拉伸的)末端切割以形成減小的內(nèi)直徑的出口。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)射器整體形成在分析柱末端。這防止了分析柱末端與發(fā)射器上游末端之間的連接。根據(jù)一個(gè)方面，提供了用于納級(jí)流(nanoscale flow)的發(fā)射器，其包含用于接受樣品例如來自液相層析柱的樣品的上游末端及用于電噴射所述樣品的錐形末端，所述發(fā)射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發(fā)射器從熔融二氧化硅形成并且具有小于陽μ m的內(nèi)徑，其中所述發(fā)射器的錐形末端具有金的導(dǎo)電一次涂層及二次導(dǎo)電碳基涂層。另外，本發(fā)明提供了用于納級(jí)流的發(fā)射器，其包含用于接受樣品例如來自液相層析柱的樣品的上游末端及用于電噴射所述樣品的錐形末端，所述發(fā)射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發(fā)射器從熔融二氧化硅形成并且具有至多55 μ m的內(nèi)徑，其中所述發(fā)射器的錐形末端具有包含硅合金或?qū)щ娋酆衔锏耐繉印-連接器在納級(jí)LCMS裝置中，關(guān)鍵的是避免流路中的死體積，即空隙(void)，因?yàn)榫哂信c流路的內(nèi)徑相當(dāng)大小的死體積對(duì)帶(峰)寬有很大影響。由于分散所致峰加寬對(duì)于系統(tǒng)的靈敏性和動(dòng)力學(xué)范圍均有有害作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種改良的連接元件，其至少顯著降低LCMS裝置的流路中死體積的存在。因此，本發(fā)明提供了連接元件，其包含內(nèi)體積，所述內(nèi)體積橫截面直徑通常等于待安裝管材的外徑。管材的對(duì)接(butt connection)本發(fā)明的一個(gè)方面涉及提供能經(jīng)受高壓(> 4xl04kPa)的納級(jí)柱的對(duì)接方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用金剛石切割器切割待連接管材的末端，獲得垂直于管材長度方向的“直切口(straight cut)”。這種直切口使得管材末端在連接元件內(nèi)接合(abutment)并且至少降低當(dāng)流動(dòng)相從上游柱沖到下游柱入口時(shí)死體積的存在。在末端具有直刀口(straight edges)的管材連接通常稱為對(duì)接。直切口避免了形成毛邊(burr) 或鰭狀物(fin)。盡管管材的末端是接合的，但是這種對(duì)接不是完全或者緊密閉合的并且可發(fā)生泄露。在三向連接元件實(shí)施方案中，泄露體積可以到達(dá)連接元件的第三個(gè)連接組合裝置。盡管本發(fā)明將用特異實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是顯然本發(fā)明不限于所示實(shí)施方案。 更特別地，所示實(shí)施方案顯示了 LCMS技術(shù)的應(yīng)用。然而，本發(fā)明不限于在LCMS中應(yīng)用。盡管本發(fā)明將用特異實(shí)施方案進(jìn)行解釋，但是本發(fā)明不限于本文公開的明確特征，也包含任何暗示特征或等同特征。盡管特異權(quán)利要求附于本申請(qǐng)，本申請(qǐng)的公開不由權(quán)利要求限制， 而是包含所有暗示和明顯特征，并且隨后的分案申請(qǐng)可以涉及這些特征的任意組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明實(shí)施方案可以組合。除非明確說明，任何本文公開的實(shí)施方案均可以與另一個(gè)公開的實(shí)施方案的特征(的一部分)組合。本發(fā)明稍后參照附圖更詳細(xì)描述。在整個(gè)申請(qǐng)中，表述LCMS裝置可以與LCMS平臺(tái)技術(shù)或LCMS設(shè)備互換使用。LCMS裝置的應(yīng)用在另一方面，提供了本發(fā)明前述方面所述裝置在鑒別表位中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道什么是表位。簡而言之，表位是蛋白質(zhì)片段，優(yōu)選是肽。通常， 對(duì)于MHC I型配體，表位長度大約是8-10個(gè)氨基酸，對(duì)于MHC II型配體，表位長度大約是 11-34、優(yōu)選14-16個(gè)氨基酸，但是也可以預(yù)期其它長度的肽。這種肽可以進(jìn)一步通過PTM 改變(Engelhard et al. 2004)。任何表位均可以潛在地用本發(fā)明的LCMS裝置鑒別。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MHC I型T細(xì)胞表位被鑒別。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MHC II型 T細(xì)胞表位被鑒別。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解用單個(gè)樣品可以鑒別若干表位。還可以在單個(gè)樣品中鑒別多個(gè)MHC I型和II型T細(xì)胞表位。MHC I 型表位在第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，T細(xì)胞表位是MHC I型表位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知及在背景中解釋的，MHC I型表位是由APC呈遞在MHC I型分子上以激活⑶8+T細(xì)胞的表位。
10MHC I型表位優(yōu)選源自或者衍生自在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，優(yōu)選衍生自在胞內(nèi)感染期間的病毒。MHC I型表位也可以源自其它非自身蛋白質(zhì)，其可以是被加工并被APC呈遞在MHC I型分子中的細(xì)菌蛋白。優(yōu)選地，這些蛋白質(zhì)衍生自可適應(yīng)胞內(nèi)生活方式的細(xì)菌， 即它們可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物APC，優(yōu)選人類APC。MHC I型表位還可以源自非自身細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)，其可以由APC從細(xì)胞外環(huán)境攝取并且可以經(jīng)交叉呈遞到達(dá)MHC I型加工區(qū)室。另外，MHC I型表位也可以源自宿主蛋白質(zhì)，其表達(dá)是從頭誘導(dǎo)的或者由APC的細(xì)胞內(nèi)感染而上調(diào)，因此是感染或病原體相關(guān)的?？梢允褂靡恍┎呗杂帽景l(fā)明的LCMS裝置鑒別MHC I型表位。對(duì)于病毒病原體， 首先需要選擇需要對(duì)其鑒別MHC I型表位的病毒。優(yōu)選的病毒包括但非限于能在所述哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)病癥或疾病的任何病毒。優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人類?？设b別MHC I型表位的人類病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科，如人免疫缺陷病毒(HIV)；風(fēng)疹病毒；副粘病毒科，如副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞病毒，人間質(zhì)肺炎病毒；正粘病毒科，如流感病毒；黃病毒科，如黃熱病毒，登革熱病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，日本腦炎表達(dá)(JEV)，蜱傳腦炎病毒，St. Louis腦炎病毒或者西尼羅病毒；皰疹病毒科，如單純皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒， Epstein-Barr ^ ；(Bunyaviridae) ；^(Arenaviridae) : ^! 科(Hantaviridae)，如Hantaan ；冠狀病毒科；乳多空病毒科，如人乳頭瘤病毒；彈狀病毒科 (Rhabdoviridae)，如狂犬病病毒。冠狀病毒科如人冠狀病毒；甲病毒科(Alphaviridae)， 動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)，絲狀病毒科(filoviridae)如埃博拉病毒，沙粒病毒科， 痘病毒科如天花病毒及非洲豬瘟病毒。麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒在實(shí)驗(yàn)部分被作為例子。下一步是制備包含來自選擇的病毒的MHC I型表位的混合物，將這個(gè)混合物或者樣品提供給上述LCMS裝置以鑒別所述MHC I型表位?？梢允褂萌舾刹呗澡b別MHC I型表位。在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案(MHC I型表位)中，包含MHC I型表位的混合物優(yōu)選衍生自包含所述表位的細(xì)胞。因此，如果待鑒別的MHC I型表位源自或者衍生自病毒，本領(lǐng)域技術(shù)人員首先要用所述病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞以獲得所述混合物。這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)進(jìn)行并且已在作為例子的麻疹或者流感病毒的實(shí)驗(yàn)中充分描述。優(yōu)選地，使用APC待被感染。APC可以衍生自細(xì)胞系或者分離自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。專門APC的分離和鑒別方法。優(yōu)選使用的APC是人DC，更優(yōu)選是人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(MDDC)，如實(shí)驗(yàn)部分所述。APC 優(yōu)選在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)若干天(大約4-6天)，所述培養(yǎng)基任選補(bǔ)加給定營養(yǎng)素。APC隨后用選擇的病毒根據(jù)已知技術(shù)感染。根據(jù)病毒的性質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道采用哪種感染方案。在感染后，收獲APC，洗滌，計(jì)數(shù)并任選地沉淀和冷凍直至進(jìn)一步分析。作為對(duì)照，可以使用未感染的APC。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，人們可以在至少兩個(gè)平行培養(yǎng)物中培養(yǎng)APC，其一用選擇的病毒感染。所述平行培養(yǎng)物之間的唯一其它差異是感染的培養(yǎng)物在50%穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸如13C6-L-亮氨酸和/或13C5,15N1-L-甲硫氨酸和/或13C5,15N1-L-纈氨酸和 50%它們天然氨基酸對(duì)應(yīng)物L(fēng)-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸存在下實(shí)現(xiàn)?？梢赃x擇其它氨基酸用于標(biāo)記，優(yōu)選代表與實(shí)驗(yàn)的HLA背景相關(guān)的MHC錨殘基的氨基酸。在洗脫一種 MHC I型表位組合物之前使用感染的和對(duì)照APC的1 1混合物(細(xì)胞/細(xì)胞)會(huì)差異影響病毒感染相關(guān)的相對(duì)于正常未改變的自身表位的同位素離子簇。這會(huì)使得稍后更好鑒別病毒感染相關(guān)的MHC I型表位。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，人們可以選擇使用來自特異HLA背景的APC。例如，如果人們使用來自HLA-A*0201背景的APC，人們將鑒別特異存在于這個(gè)環(huán)境中的表位。我們還可以選擇平行使用來自不同HLA背景的APC以鑒別可能存在于若干背景環(huán)境中的表位。在1 1混合APC (細(xì)胞/細(xì)胞)之后，可以在進(jìn)行進(jìn)一步表位分析之前冷凍細(xì)胞混合物。當(dāng)進(jìn)行分析時(shí)，如果是冷凍的，融化APC。APC隨后裂解用于根據(jù)已知技術(shù)溶解MHC I型分子。優(yōu)選的方法類似于在MHC II型表位章節(jié)描述的方法。更優(yōu)選的方法也在實(shí)驗(yàn)部分描述。適于下載到用于鑒別洗脫的組合物中存在的每個(gè)表位的本發(fā)明裝置中的包含MHC I型表位的組合物或樣品的制備物類似于被下載到本發(fā)明裝置中的包含MHC II型表位的組合物的制備物。下載合適的組合物到本發(fā)明裝置中及分析獲得的結(jié)果導(dǎo)致MHC I型表位鑒別是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且在實(shí)施例中解釋的技術(shù)進(jìn)行的。這個(gè)方法允許鑒別已知感染哺乳動(dòng)物的給定病毒的潛在地任何MHC I型表位。其還洞察給定MHC I型表位的相對(duì)豐度。其還可以洞察表位的其它特征，包括表位的長度變化，由存在包含在洗脫的組合物中的多個(gè)長度變體所反映，以及表位的翻譯后修飾(PTM)， 或者在給定HLA環(huán)境中呈遞的蛋白質(zhì)或者表位多態(tài)性的作用。這個(gè)技術(shù)是強(qiáng)有力的并且對(duì)于開發(fā)功能疫苗是需要的。如果選擇的病毒是已知自身適應(yīng)現(xiàn)存治療相當(dāng)快的病毒，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是鑒別衍生自一種病毒的至少2個(gè)毒株的共享MHC I型表位，優(yōu)選地在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒是流感病毒。MHC II 型表位在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞表位是MHC II型表位。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選應(yīng)用中，在抗原脈沖實(shí)驗(yàn)中保溫包含表位來源與APC的混合物及隨后將包含已經(jīng)加工及由 APC呈遞的表位的樣品輸送至本文所述裝置之后鑒別MHC II型表位。優(yōu)選表位來源是表位的來源蛋白質(zhì)。正如技術(shù)人員所已知且在背景中闡述，MHC II型表位是由APC呈遞在MHC II型分子上以激活CD4+T細(xì)胞的表位。本文所用的MHC II型表位優(yōu)選源自或者衍生自非自身蛋白質(zhì)。非自身蛋白質(zhì)優(yōu)選是來自如后文所述鑒別的病原體的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)對(duì)于可以由所述病原體感染的哺乳動(dòng)物是非自身蛋白質(zhì)?？梢允褂帽景l(fā)明的LCMS裝置使用一些策略鑒別病原體相關(guān)的MHC II型表位。首先，需要選擇針對(duì)其需要鑒別MHC II型表位的病原體。優(yōu)選的病原體包括但不限于能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)病癥或疾病的哺乳動(dòng)物的任何病原體。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物是人?？梢詫?duì)其鑒別MHC II型表位的人病原體包括原核生物或者真核生物細(xì)胞。優(yōu)選地，原核生物是細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌包括螺桿菌屬(Helicobacter)，如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori),奈瑟氏球菌屬(Neisseria), BfifilliiM (Haemophilus) 如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，博德特氏菌屬(Bordetella)，衣原體屬 (Chlamydia)，鏈球菌屬(Streptococcus)如月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae), 弧菌屬(Vibrio)如霍亂弧菌(Vibrio cholera)，以及革蘭氏陰性腸病原體包括如沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和埃希氏菌屬(Escherichia)，以及導(dǎo)致炭疽、麻風(fēng)、結(jié)核、白喉、Lyme病、梅毒、傷寒、淋病和Q熱的細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌屬于博德特氏菌屬或者奈瑟氏球菌屬種。更優(yōu)選的博德特氏菌屬菌種包括百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella
12parapertussis)或者支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchis印tica)。更優(yōu)選的奈瑟氏球菌屬菌種包括腦膜炎奈瑟氏球菌。病原體可以是寄生物，例如原生動(dòng)物，如牛巴貝蟲(Babesia bovis)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、利什曼原蟲屬(Leishmania spp)、鼠弓形蟲 (Toxoplasma gondii)，及維蟲屬(Trypanosoma)，如克魯斯維蟲(Trypanosoma cruzi)。優(yōu)選的真核生物包括真菌。更優(yōu)選的真菌是酵母或者絲狀真菌。舉例的優(yōu)選的酵母屬于假絲酵母屬(Candida)。優(yōu)選的真菌包括曲霉屬(Aspergillus sp.)、白色假絲酵母(Candida albicans)、隱球酵母屬(Cryptococcus)如新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)以及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。病原體也可以是如后文定義的病毒病原體。在這種情況中，當(dāng)是指病原體細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選是指病毒感染的細(xì)胞。下一步驟是制備包含來自選擇的病原體的一或多個(gè)的MHC II型表位的一種來源蛋白質(zhì)或者多種來源蛋白質(zhì)的混合物，在抗原脈沖實(shí)驗(yàn)中將這個(gè)混合物與APC保溫并將包含已經(jīng)加工及由APC呈遞的一或多個(gè)表位的樣品輸送至本文先前所述LCMS裝置以鑒別所述MHC II型表位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和/或技術(shù)人員所具有的選擇的病原體的知識(shí)和/或根據(jù)病原體的性質(zhì)可以使用一些類型的一或多種來源蛋白質(zhì)的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物衍生自細(xì)胞或者包含細(xì)胞。更優(yōu)選地，上下文中的細(xì)胞是病原體細(xì)胞。優(yōu)選的病原體已經(jīng)在本文鑒別。衍生自病原體細(xì)胞的混合物優(yōu)選是衍生自全細(xì)胞制備物的混合物。當(dāng)對(duì)所述病原體細(xì)胞未知或已知極少幾個(gè)表位或者針對(duì)所述病原體應(yīng)鑒別其他表位或者來自未知病原體蛋白質(zhì)的表位時(shí)，這個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案(使用衍生自全細(xì)胞制備物的混合物)通常更具吸引力。當(dāng)已知或未知病原體相關(guān)表位與來自病原體的其它已知或未知表位相比應(yīng)被鑒別為優(yōu)勢(shì)加工和呈遞的時(shí)，這個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案也是具有吸引力的。當(dāng)在單個(gè)分析樣品中應(yīng)包含全部病原體相關(guān)的MHC II型 Iigandome (其類似于哺乳動(dòng)物APC優(yōu)選人APC對(duì)于完全和復(fù)雜的病原體蛋白質(zhì)組的體內(nèi)加工和呈遞的結(jié)果)時(shí)，這個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案具有吸引力。簡而言之，為了制備這種混合物，將病原體細(xì)胞在兩個(gè)平行培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選直至靜止相。兩個(gè)平行培養(yǎng)物之間的唯一不同是一個(gè)培養(yǎng)物在存在wN(天然氮同位素)條件下實(shí)現(xiàn)，而另一個(gè)在存在1N 穩(wěn)定同位素條件下實(shí)現(xiàn)。在抗原脈沖實(shí)驗(yàn)中使用wN-和15N-標(biāo)記的病原體細(xì)胞1 1的混合物與APC優(yōu)選產(chǎn)生等拷貝數(shù)的輕(14N)和重(15N)形式的表位。這樣可便于隨后在LCMS 裝置中識(shí)別病原體相關(guān)的MHC II型表位。根據(jù)病原體，技術(shù)人員已知可以使用哪種合適的培養(yǎng)基以及其可以怎樣任選補(bǔ)加額外的營養(yǎng)物。通常，當(dāng)病原體細(xì)胞達(dá)到靜止相時(shí)，對(duì)其進(jìn)行熱失活。靜止相優(yōu)選是指優(yōu)選使用光密度測(cè)量法未檢測(cè)出細(xì)胞的額外生長。所述光密度優(yōu)選在590nm測(cè)量。隨后，病原體細(xì)胞可以在生理緩沖液如PBS中濃縮以獲得具有合適光密度(OD)、優(yōu)選在0. 6-1之間的全細(xì)胞制備物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物包含細(xì)胞的蛋白質(zhì)或者衍生自細(xì)胞的蛋白質(zhì)，優(yōu)選病原體細(xì)胞的蛋白質(zhì)。病原體細(xì)胞已經(jīng)在本文定義。優(yōu)選的蛋白質(zhì)是P.69 Pertactin，其是得自百日咳博德特氏菌的蛋白質(zhì)。當(dāng)已知得自病原體的蛋白質(zhì)是免疫原性的及需要鑒別新的、改良的或者優(yōu)勢(shì)表位時(shí)，典型使用這種類型的混合物。蛋白質(zhì)優(yōu)選存在于純化的制備物中。純化的制備物優(yōu)選是指所述制備物包含或者由至少80%、至少85%、 至少90%的所述蛋白質(zhì)組成，或者至少95%、或者至少98%、或者至少99% (w/w) 0蛋白質(zhì)可以從病原體直接純化，或者其編碼基因可以克隆進(jìn)表達(dá)所述蛋白質(zhì)的另一宿主中。這種
13宿主的優(yōu)選實(shí)例是大腸桿菌(E. coli)，如本文實(shí)驗(yàn)部分所述。獲得蛋白質(zhì)的方式不限于本發(fā)明中的特定方式，只要所述制備物的純度如本文定義即可。為了獲得所述蛋白質(zhì)，將病原體在如先前段落中所述的合適條件下培養(yǎng)。在宿主細(xì)胞的情況中，所述蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。優(yōu)選地，對(duì)于大腸桿菌，使用IPTG作為誘導(dǎo)劑。如果所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的去污劑使所述病原體或者宿主細(xì)胞裂解。隨后制備包含所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞溶質(zhì)細(xì)胞提取物。所述蛋白質(zhì)隨后從所述細(xì)胞溶質(zhì)提取物中純化。在大腸桿菌的情況中，所述蛋白質(zhì)可以存在于包涵體中。存在于包涵體中的蛋白質(zhì)的純化為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可以如實(shí)施例中所述進(jìn)行。隨后，蛋白質(zhì)制備物可以在生理緩沖液如PBS中濃縮或者稀釋或者可以進(jìn)一步純化以獲得具有合適濃度蛋白質(zhì)、優(yōu)選0. 3-2. 5mg/ml的蛋白質(zhì)制備物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，混合物衍生自細(xì)胞區(qū)室或者包含細(xì)胞區(qū)室，優(yōu)選病原體細(xì)胞。病原體細(xì)胞已經(jīng)在本文定義。優(yōu)選的區(qū)室是小泡，更優(yōu)選是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡(Outer Membrane Vesicle, OMV) 0當(dāng)已知得自病原體的小泡是所述病原體的免疫原性實(shí)體及需要鑒別新的、改良或者優(yōu)勢(shì)表位時(shí)，典型使用這種類型的混合物。細(xì)胞區(qū)室優(yōu)選存在于純化的區(qū)室制備物中，如前文段落中針對(duì)蛋白質(zhì)所闡述。純化的區(qū)室制備物優(yōu)選是指所述制備物包含或者由至少5 %的已知存在于這種制備物中的一種代表性蛋白質(zhì)組成。所述制備物優(yōu)選包含或者由至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少85 %、至少90 %或者至少95 %、或者至少 98%、或者至少99% (w/w)組成。來自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV中存在的代表性蛋白質(zhì)的實(shí)例是外膜蛋白質(zhì)孔蛋白A(PorA)。區(qū)室優(yōu)選直接純化自病原體。獲得區(qū)室的方式不限于本發(fā)明中特定方式，只要滿足包含所述區(qū)室的制備物的純度要求即可。為了獲得所述區(qū)室制備物，將病原體在如前兩個(gè)段落中所述合適條件下培養(yǎng)。根據(jù)選擇的區(qū)室的性質(zhì)，技術(shù)人員將已知怎樣將其從培養(yǎng)的病原體細(xì)胞分離及任選純化。制備包含OMV的制備物的一個(gè)優(yōu)選方式在實(shí)施例中描述。隨后，可以將所述區(qū)室制備物在生理緩沖液如PBS中濃縮或者稀釋或者可以進(jìn)一步純化以獲得具有合適濃度的代表所述區(qū)室的蛋白質(zhì)的純化的區(qū)室制備物。例如，如果使用來自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV作為所述區(qū)室，則純化的區(qū)室應(yīng)優(yōu)選含有 1. 2-2. 4mg/ml的主要代表性外膜蛋白質(zhì)孔蛋白A(PorA)。在本發(fā)明中可以使用包含MHC II型表位來源的任何其它混合物。優(yōu)選地，這種來源是蛋白質(zhì)來源。也可以使用包含病毒表位來源的混合物。優(yōu)選的病毒在后文定義。包含病毒表位來源的混合物優(yōu)選是包含病毒蛋白質(zhì)的混合物或者衍生自其中或者是病毒蛋白質(zhì)的來源，優(yōu)選復(fù)制性病毒生物體。當(dāng)應(yīng)鑒別誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的病毒相關(guān)的MHC II型表位時(shí)，這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案通常是具有吸引力的。與制備包含MHC II型表位來源的混合物同時(shí)，也制備包含來自已知是選擇的病原體的潛在靶位的哺乳動(dòng)物的APC的制備物。優(yōu)選地，APC得自人。技術(shù)人員已知怎樣從人分離APC。這通常是使用人全血進(jìn)行梯度離心技術(shù)進(jìn)行，優(yōu)選使用白細(xì)胞除去法暗黃覆蓋層(leukapheresis buffy coat)的梯度離心進(jìn)行。APC的性質(zhì)優(yōu)選通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)核實(shí)，使用特異于APC標(biāo)記的特異性抗體進(jìn)行。優(yōu)選使用的APC是人DC，更優(yōu)選人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(MDDC)，如實(shí)驗(yàn)部分所述。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以選擇使用來自特定HLA背景的APC。例如，如果使用來自HLA-DRl背景的APC，則將鑒別在這種環(huán)境中特異性呈遞的表位。我們也可以選擇平行使用來自不同HLA背景的APC以鑒別在幾個(gè)背景環(huán)境中呈遞的表位。也可以使用其它細(xì)胞類型如APC，優(yōu)選來自免疫系統(tǒng)的專門APC，如B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和除了 MDDC之外的樹突細(xì)胞世系。其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型也可以用作APC 以鑒別在所述細(xì)胞的抗原加工和呈遞背景環(huán)境中特異性產(chǎn)生的或者疾病狀態(tài)相關(guān)的表位。 在此，APC優(yōu)選隨后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾天(大約4-6天)，所述培養(yǎng)基中可以補(bǔ)加營養(yǎng)物。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將包含一或多個(gè)表位的等量的14N和1~來源的1 1混合物(全細(xì)胞或者細(xì)胞的蛋白質(zhì)或區(qū)室)與APC在合適培養(yǎng)基中保溫1-2天，所述培養(yǎng)基可以進(jìn)一步補(bǔ)加。補(bǔ)加物可以是佐劑。優(yōu)選的佐劑是LPS(脂多糖)。更優(yōu)選地，LPS來自S.abortis equi。這是所謂的抗原脈沖實(shí)驗(yàn)。在保溫結(jié)束時(shí)，收獲APC、洗滌并計(jì)數(shù)。在進(jìn)行進(jìn)一步表位分析之前將其冷凍。當(dāng)將要進(jìn)行分析時(shí)，如果APC是冷凍狀態(tài)則將其解凍。隨后根據(jù)已知技術(shù)對(duì)APC 進(jìn)行裂解以使MHC II型分子溶解。如實(shí)施例所述，優(yōu)選的裂解緩沖液包含1%CHAPS，是緩沖的及補(bǔ)加了蛋白酶抑制劑。如實(shí)施例所述，離心后獲得的上清隨后可以在一些CNBr-激活的、TRIS-封閉的瓊脂糖柱上純化以獲得包含一或多種表位的洗脫組合物。洗脫組合物可以通過膜濾進(jìn)一步純化、濃縮并在合適組合物或者樣品中重建，下載進(jìn)本發(fā)明的裝置中以鑒別洗脫組合物中存在的每種表位。根據(jù)技術(shù)人員已知的及在實(shí)施例中闡述的技術(shù)，將合適的組合物或樣品下載入本發(fā)明的裝置中，根據(jù)獲得的分析結(jié)果鑒別MHC II型表位。這種方法可以鑒別哺乳動(dòng)物指定病原體的潛在的任何MHC II型表位。其還提供了對(duì)于指定MHC II型表位的相對(duì)豐度的認(rèn)知。其也提供了對(duì)于表位的其它特征的認(rèn)知，包括由洗脫組合物中包含的多個(gè)長度變體的存在而反映出的表位長度變異以及表位的翻譯后修飾(PTM)，或者在指定HLA環(huán)境中蛋白質(zhì)或者表位多態(tài)性(例如在腦膜炎奈瑟氏球菌的區(qū)域4中大量證實(shí))對(duì)于呈遞的作用。這個(gè)技術(shù)是強(qiáng)力的且是開發(fā)功能疫苗所需的。鑒別的表位及其應(yīng)用另一方面，本發(fā)明提供了使用本文所述任何方法可獲得的表位。優(yōu)選的表位已經(jīng)在本文鑒別(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中表1-8所示，SEQ ID NO :1-153)。實(shí)施例中鑒別的每個(gè)SEQ ID NO均代表鑒別的表位。在括號(hào)內(nèi)指定的每個(gè)鑒別的表位的相鄰殘基優(yōu)選不認(rèn)為是該表位的一部分。優(yōu)選每個(gè)SEQ ID NO包括本文指定的任何PTM。麻疹病毒的優(yōu)選表位在表1和2中鑒別，選自SEQ ID NO :1_45。更優(yōu)選的表位選自SEQ ID NO :7-45，任選組合SEQ ID NO :1_6中至少一個(gè)。與流感病毒感染相關(guān)的優(yōu)選表位在表3中鑒別，選自SEQ ID NO 46-49和SEQ ID NO 52-58。百日咳博德特氏菌的優(yōu)選表位在表4和5中鑒別，選自SEQ ID NO :59_72。腦膜炎奈瑟氏球菌的優(yōu)選表位在表6、7和8中鑒別，選自SEQ ID NO :73_153。優(yōu)選的表位衍生自PorA蛋白，孔蛋白A血清亞型Pl. 5-2，10或者孔蛋白A血清亞型Pl. 7_2， 4。PorA蛋白可以再分為8個(gè)區(qū)域(見表6)-區(qū)域1相應(yīng)于PorA蛋白、優(yōu)選孔蛋白A血清亞型Pl.5-2,10或者孔蛋白A血清亞型Pl. 7-2，4的前20個(gè)氨基酸，-區(qū)域2相應(yīng)于氨基酸39-59，
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-區(qū)域3相應(yīng)于氨基酸91-111，-區(qū)域4相應(yīng)于氨基酸131-168，-區(qū)域5相應(yīng)于氨基酸191-224，-區(qū)域6相應(yīng)于氨基酸四2_306，-區(qū)域7相應(yīng)于氨基酸318_；349，-區(qū)域8相應(yīng)于氨基酸349-372。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用如下所述一或多個(gè)PorA表位區(qū)域4內(nèi)包含的PorA表位，和/或區(qū)域5內(nèi)包含的PorA表位和/或區(qū)域6內(nèi)包含的PorA表位，任選地組合區(qū)域1 和/或2和/或3和/或7和/或8內(nèi)包含的PorA表位。每個(gè)區(qū)域內(nèi)包含的優(yōu)選表位在表6中示出-區(qū)域1內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:73-76 表示，
-區(qū)域2內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:77-79 表示，
-區(qū)域3內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:80-91 表示，
-區(qū)域4內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:92-95 表示，
-區(qū)域5內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:96-99 表示，
-區(qū)域6內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO100表示，
-區(qū)域7內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO101表示，
-區(qū)域8內(nèi)包含的優(yōu)選的表位由SEQIDNO:102-110 表示。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，PorA表位選自SEQ ID NO :92_95，任選地組合至少一種其它鑒別的PorA表位。表7鑒別了從其它(非-PorA)蛋白質(zhì)中鑒別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由 SEQ ID NO :111-134表示。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位選自SEQ ID NO :111-134。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上述鑒別的Por A表位與從表7所示另一蛋白質(zhì)中鑒別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位組合使用。最優(yōu)選地，PorA表位選自SEQ ID N0:92_95，組合 SEQ ID NO :111-134 中至少一個(gè)。表8鑒別了從PorA和非-PorA蛋白質(zhì)中鑒別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由 SEQ ID NO :135-153表示。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位選自SEQ ID NO :135-153。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上述鑒別的腦膜炎奈瑟氏球菌表位與表8所示腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位組合使用。最優(yōu)選地，PorA表位選自SEQ ID NO :92-95，組合SEQ ID NO :135-153中至少一個(gè)。表3、4和5中示出的每個(gè)表位以及表2、6、7和8所示其它表位的大部分均被認(rèn)為是新的，其加強(qiáng)了本發(fā)明LCMS裝置的唯一性。任何這些表位均是摻入針對(duì)其所源自或者衍生自其中的病原體或者病毒的疫苗中的潛在候選物。因此，本發(fā)明還涉及包含在本文鑒別的表位的組合物，以生產(chǎn)預(yù)防和/或治療由攜帶這個(gè)表位的病原體導(dǎo)致的疾病的疫苗。應(yīng)理解本發(fā)明涵蓋了包含如本文鑒別的一個(gè)指定病原體的1、2、3、4、5、6、7、8、9或者更多個(gè)表位的組合物。任選地，已知表位可以與本文鑒別的表位組合。
如本文定義，表位通過具有的一定長度而鑒別。包含所述表位的組合物優(yōu)選不限于一定的長度。所述組合物可包含衍生自如本文定義的病原體的肽，所述肽包含鑒別的表位，優(yōu)選具有在天然加工和呈遞之后鑒別的特征，包括PTM。組合物也可以包含這樣的多肽，所述多肽包含鑒別的表位作為核心序列以及兩側(cè)具有有利于在體內(nèi)給予后呈遞所述表位的氨基酸序列。組合物也可包含這樣的多肽，所述多肽包含多個(gè)鑒別的表位及側(cè)翼序列。 然而，優(yōu)選表位在由這種組合物在體內(nèi)輸送之后，對(duì)于MHC I型表位長度為8-12個(gè)氨基酸， 或者對(duì)于MHC II型表位長度為11-34個(gè)氨基酸，優(yōu)選14-16個(gè)氨基酸。所述氨基酸序列優(yōu)選完全或者部分衍生自如本文定義的病原體表達(dá)的蛋白質(zhì)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含如本文鑒別的表位的肽用于作為疫苗的組合物中。包含MHC I型表位的肽的長度可以是 8-20個(gè)氨基酸或者更長。包含MHC II型表位的肽的長度可以是8-40個(gè)氨基酸或者更長。 包含MHC I型或II型表位的所述肽可包含一個(gè)表位及來自天然病原體蛋白的另外側(cè)翼序列或者非源自天然病原體蛋白的另外側(cè)翼序列。肽因此可由鑒別的表位組成，包含鑒別的表位，包含多個(gè)鑒別的表位或者具有與本文鑒別的表位序列之一具有至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95^^97^^99%或者100%相同性的氨基酸序列，以及其中優(yōu)選這個(gè)肽不是源自如本文定義的病原體的天然氨基酸序列。優(yōu)選地，肽通過其與鑒別的序列之一的相同性及具有如本文先前鑒別的長度而定義。相同性通過在排列兩個(gè)序列以保證獲得最大相同氨基酸數(shù)目之后確定兩個(gè)序列之間相同氨基酸的數(shù)目而計(jì)算。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋了包含如本文鑒別的表位的組合物可以是指在本文針對(duì)其已經(jīng)鑒別了一或多個(gè)表位的病原體的天然蛋白質(zhì)用作疫苗。當(dāng)病原體的新的天然蛋白質(zhì)在本文鑒別為具有至少一個(gè)表位時(shí)這是優(yōu)選的?；蛘?，可以使用所述天然蛋白質(zhì)的部分。在本發(fā)明中，“部分”是指所述成熟蛋白質(zhì)序列的氨基酸數(shù)目的至少lO^dO^dO^idO^jO^、 60%、70%、80%、90%或100%。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中(見表2，4_8_)，鑒別了一些病原體特異性蛋白質(zhì)。這些表中鑒別的每一蛋白質(zhì)或者其部分均可用于組合物中，作為針對(duì)相應(yīng)病原體的疫苗。用于本發(fā)明中所述組合物的(多)肽可以是簡單合成的。另一組合物可包含編碼多肽的遺傳(DNA)密碼，所述多肽包含以其最佳形式的一或多個(gè)鑒別的表位。本領(lǐng)域目前已知產(chǎn)生所述(多)肽或者所述DNA的許多方法。本發(fā)明因此進(jìn)一步涉及包含如本文先前定義的本發(fā)明表位的組合物。所述組合物優(yōu)選是藥物組合物，及優(yōu)選用作疫苗。疫苗可以用于哺乳動(dòng)物的免疫(產(chǎn)生免疫應(yīng)答)或者接種。組合物可進(jìn)一步包含佐劑。佐劑在本文被定義為包括這樣的任何物質(zhì)或化合物，當(dāng)其與表位組合使用時(shí)使哺乳動(dòng)物、優(yōu)選使人免疫，刺激免疫系統(tǒng)，從而激發(fā)、增強(qiáng)或者促進(jìn)針對(duì)所述表位的免疫應(yīng)答，優(yōu)選不產(chǎn)生對(duì)于佐劑自身的特異性免疫應(yīng)答。優(yōu)選的佐劑使針對(duì)指定表位的免疫應(yīng)答與在相同但不存在所述佐劑的條件下針對(duì)所述表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比增強(qiáng)至少1. 5、2、2. 5、5、10或者20倍。本領(lǐng)域可獲得在一組動(dòng)物或人體中確定超過相應(yīng)對(duì)照組的由佐劑產(chǎn)生的針對(duì)指定表位的免疫應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)學(xué)平均增強(qiáng)的檢測(cè)方法。所述佐劑優(yōu)選能增強(qiáng)針對(duì)至少兩個(gè)不同表位的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的佐劑通常是這樣的化合物， 其對(duì)于哺乳動(dòng)物是外源的，從而排除了哺乳動(dòng)物內(nèi)源的免疫刺激性化合物，如白細(xì)胞介素、 干擾素及其它激素。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物進(jìn)一步包含藥物可接受的載體。所述藥物組合物可進(jìn)一步包含藥物可接受的穩(wěn)定劑、滲透劑、緩沖劑、分散劑等。藥物組合物的優(yōu)選形式依賴于指定的給予模式和治療應(yīng)用。所述藥物載體可以是適于將活性成分即表位以及任選佐劑輸送至患者的任何相容的無毒性物質(zhì)。對(duì)于鼻內(nèi)輸送的藥物可接受的載體例如是水、緩沖鹽水溶液、甘油、聚山梨醇酯20、cremophor EL以及辛酸/癸酸甘油酯的水溶液混合物，且可以緩沖以提供中性PH環(huán)境。胃腸外輸送的藥物可接受的載體例如是無菌緩沖的0. 9% NaCl或者5%葡萄糖溶液，任選補(bǔ)加20%白蛋白。胃腸外給予的制備物必須是無菌的。胃腸外給予所述活性成分是根據(jù)已知方法進(jìn)行，例如通過皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或者病灶內(nèi)(intralesional)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)注射或者灌注或者口服途徑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選通過推注形式給予。肌內(nèi)注射的典型藥物組合物被制成含有例如I-IOml磷酸鹽緩沖鹽水和1-100μ g、優(yōu)選15-45 μ g本發(fā)明的表位。對(duì)于口服給予，活性成分可以在液體劑型中給予，如酏劑、糖漿和懸浮液?？诜o予的液體劑型可含有色素和調(diào)味劑以增加患者接受性。制備可通過胃腸外、口服或者鼻內(nèi)給予的組合物的方法為本領(lǐng)域熟知且在多種資料中更詳細(xì)描述，包括例如在 Remington' s Pharmaceutical Science (15th ed.，Mack Publishing, Easton, PA, 1980)中描述(在此以其全部內(nèi)容援引加入本文)。本發(fā)明表位的其它應(yīng)用另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明表位在評(píng)估哺乳動(dòng)物免疫狀況中的進(jìn)一步應(yīng)用。 在這個(gè)方面中，包含病原體表位的混合物可以與來自所述哺乳動(dòng)物的APC或者T細(xì)胞在體外保溫，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)進(jìn)行。評(píng)估哺乳動(dòng)物免疫狀況優(yōu)選是指評(píng)估所述哺乳動(dòng)物是否已經(jīng)感染指定的病原體或者評(píng)估給予的疫苗是否仍保護(hù)所述哺乳動(dòng)物免于未來感染所述病原體。優(yōu)選地，表位可以使用本文所述任何方法獲得。優(yōu)選的表位和包含所述表位的優(yōu)選的組合物已經(jīng)在本文鑒別。所述T細(xì)胞激活或者與APC相關(guān)的表位的加工和識(shí)別的檢測(cè)可表明所述哺乳動(dòng)物仍被保護(hù)免于所述病原體感染。特異性針對(duì)所述表位的T 細(xì)胞的激活可以在增殖測(cè)定中評(píng)估或者通過細(xì)胞因子或由這些T細(xì)胞產(chǎn)生的其它效應(yīng)分子的增加而評(píng)估。每種這些方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。所述應(yīng)用也被命名為體外“保護(hù)相關(guān)性(CoP) ”。在本文及權(quán)利要求書中，動(dòng)詞“包含”以其非限制性含義使用，是指包括該詞后面的項(xiàng)目，但是不排除未特別提及的項(xiàng)目。此外，動(dòng)詞“由……組成”可以由“基本上由……組成”代替，是指如本文定義的產(chǎn)物或者組合物除了特別指出的成分之外還可包含另外的成分，所述另外的成分不改變本發(fā)明的特有特性。此外，以不定冠詞“一個(gè)”提及某元件時(shí)，不排除存在一個(gè)以上所述元件的可能性，除非特別明確限定有且僅有一個(gè)所述元件情況。不定冠詞“一個(gè)”因此通常是指“至少一個(gè)”。本說明書中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)均以全部內(nèi)容援引加入本文。如下實(shí)施例只是例證本發(fā)明的目的，而無以任何方式限制本發(fā)明范圍之意。附圖描述

圖1是在第一個(gè)實(shí)施方案中LCMS裝備的示意圖。圖2是在第二個(gè)實(shí)施方案中在LCMS裝備中用于電噴射的發(fā)射器及其與與電噴射組合使用的分析柱裝配的橫截面圖。圖3a_3d示出根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案制備端頭(tip)的方法示意圖。
圖4示出第三個(gè)實(shí)施方案的連接元件的橫截面圖。圖5示出填充分析柱的方法中一個(gè)步驟的橫截面圖。圖6示出填充分析柱的方法中的第二個(gè)步驟。圖7示出在第七個(gè)實(shí)施方案中捕獲柱的示意圖。圖8是由MHC I型或者M(jìn)HC II型分子呈遞的T細(xì)胞表位的分配(allocation)的質(zhì)譜識(shí)別模式的示意圖。圖9示出復(fù)雜樣品分析中LCMS技術(shù)的組合改良的用途。圖10示出在復(fù)雜樣品分析中高質(zhì)量納級(jí)LC技術(shù)的結(jié)果。圖11示出來自人MDDC的MHC Iigandome的LCMS分析結(jié)果。圖12示出使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記定向LCMS鑒別病毒感染相關(guān)的上調(diào)的MHC I型自身表位的結(jié)果。圖13示出使用穩(wěn)定同位素定向LCMS鑒別復(fù)雜病原體全細(xì)胞制備物中病原體衍生的MHC II型配體的結(jié)果。圖14示出使用穩(wěn)定同位素定向LCMS鑒別單一重組表達(dá)的蛋白質(zhì)中病原體衍生的 MHC II型配體的結(jié)果。圖15示出使用穩(wěn)定同位素定向LCMS鑒別細(xì)菌膜制備物中病原體衍生的MHC II 型配體的結(jié)果。圖16示出使用穩(wěn)定同位素鑒別具有預(yù)料之外PTM的MHC II型表位的結(jié)果。圖17示出人MB71.5T細(xì)胞對(duì)于Ρ1.5-2，1(^ΠΡ1.7-2，4 “區(qū)域4”表位的差異識(shí)別。圖1-7的詳細(xì)描述圖1示意性示出LCMS裝備1的視圖。在左側(cè)示意性示出注射器閥2。閥2可以與連接泵優(yōu)選混合泵的電源3連接。所述閥還連接包含注射環(huán)路(loop) 5的環(huán)路4。注射器閥可以進(jìn)一步連接廢棄物出口 6和7及連接下一個(gè)閥的出口 8，所述下一個(gè)閥更具體地是在圖1右側(cè)示意性示出的所謂Deans閥10。所述閥的構(gòu)造是使得液流的一部分分流到出口 8。Deans閥10用于轉(zhuǎn)換(switching)、分流及指導(dǎo)柱流進(jìn)入分析柱11及最終進(jìn)入質(zhì)譜分析儀12。Deans閥使用簡單的6端口轉(zhuǎn)換閥遠(yuǎn)程實(shí)現(xiàn)分流。柱頭壓(column head pressure)通過限流器(restrictor) 13的尺寸而產(chǎn)生。Deans閥進(jìn)一步連接塞子14、15和廢棄物16、17。在一個(gè)實(shí)施方案中，LCMS裝置包括納級(jí)泵裝置。所述泵裝置包括泵并且能夠輸送 nl/min范圍的流速給持續(xù)變化的二元溶劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)高壓液相層析 (HPLC)泵。泵、優(yōu)選HPLC泵或者二元泵或四元泵，應(yīng)該能夠(i)以給定柱流速輸送線性和未延遲梯度或者精確梯度流(以精確及良好限定的比率混合至少兩種溶劑)，(ii)固相提取阱應(yīng)該不負(fù)面影響(總體)分離效率；及(iii)在ESI界面的峰加寬應(yīng)該不存在或者最小。非線性及延遲梯度可以由以相比于泵滯留體積(Vm)太低的流速(F)運(yùn)行泵而導(dǎo)致。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，納級(jí)LC泵用于本發(fā)明的LCMS裝置中。然而，它們很昂貴并且在非常低流速即低于30nl/min不能產(chǎn)生精確穩(wěn)定的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述泵裝置包括與分流裝置組合的泵優(yōu)選HPLC泵，作為方便的方式以非常精確方式產(chǎn)生希望的混合溶劑系統(tǒng)的低流速。所述系統(tǒng)基于先前為氣相層析中所謂cutting而開發(fā)的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)換機(jī)制，并且被稱為Deans轉(zhuǎn)換。在一個(gè)實(shí)施方案中使用 6端口轉(zhuǎn)換閥(稱為Deans閥)以遠(yuǎn)程方式實(shí)現(xiàn)柱流分流和引導(dǎo)。希望的柱頭壓產(chǎn)生自置于捕獲柱上游的限流器的尺寸(長度、內(nèi)徑)和泵的初級(jí)出口流速?？梢允褂肨連接器連接所述限流器和后續(xù)下游柱。納級(jí)HPLC系統(tǒng)包括溶劑真空脫氣裝置，溶劑混合泵、優(yōu)選四元混合泵、更優(yōu)選高壓混合二元泵，能注射至少10 μ 1樣品體積的自動(dòng)取樣器。優(yōu)選地，所有連接管材具有小于 105 μ m、優(yōu)選小于55 μ m、更優(yōu)選小于30 μ m的內(nèi)徑。所述管材由未去活化熔融二氧化硅制成。Deans閥10的分流及引導(dǎo)系統(tǒng)的一部分是位于兩個(gè)三向連接器20，21之間的捕獲柱19。所述捕獲柱包括靜止相床，包含大小至多5μπι的顆粒，所述靜止相床的尺寸為長度 5mm、優(yōu)選至少10mm、更優(yōu)選至少20mm，內(nèi)直大約50 μ m。在一個(gè)實(shí)施方案中，LCMS裝置包括位于分析柱11上游的固相提取(SPE)捕獲柱或捕獲柱19。捕獲柱可以與Deans閥10平行放置，其在文獻(xiàn)中也已知為Vented Column或 V-柱(Licklider et al. 2002)。捕獲柱能使得相對(duì)快上樣(轉(zhuǎn)移)相對(duì)大樣品體積進(jìn)入納級(jí)LC柱。捕獲柱19的內(nèi)徑應(yīng)該與分析或分離柱11的內(nèi)徑相稱。具有大內(nèi)徑(ID)的捕獲柱19的使用導(dǎo)致捕獲的化合物由于流動(dòng)相的線速度下降到遠(yuǎn)低于大約lmm/s的最佳值而以相對(duì)寬條帶轉(zhuǎn)移到分析柱11。捕獲柱19中的流動(dòng)相的線速度與柱/捕獲ID比率平方成比例，或者對(duì)于與以lmm/s線速度運(yùn)行的50 μ m ID分析柱11組合的300 μ m ID和IOOymID捕獲柱19而言分別是0. 03和0. 25mm/s。另外，大ID 捕獲柱19導(dǎo)致顯著延遲，因?yàn)椴东@柱19和連接管材的空體積在洗脫過程可開始之前應(yīng)該已經(jīng)通過柱。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析柱11可以包括靜止相床，其包含大小至多3μπι的顆粒， 所述靜止相床的尺寸為長度25cm、優(yōu)選至少50cm、更優(yōu)選至少95cm，內(nèi)徑大約25 μ m。這個(gè)柱的末端與導(dǎo)電納米噴射端頭或者發(fā)射器對(duì)接，一個(gè)例子示于圖2 (具有大約25 μ m的內(nèi)徑并且包含漸縮為在端頭的錐形末端內(nèi)徑為3. 5 μ m的熔融二氧化硅管材)，根據(jù)本發(fā)明具有金-碳涂層。具有這種分析柱11的LCMS裝備可以以大約30nl/min的流速運(yùn)行。高度推薦在分析肽樣品之前檢驗(yàn)層析系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用串聯(lián)質(zhì)譜儀12。質(zhì)譜儀能以至少10000FWHM的質(zhì)量分辨率運(yùn)行。質(zhì)譜應(yīng)該以譜連續(xù)模式(profile continue mode)以至少0. 9秒/掃描的掃描速率獲得。質(zhì)量測(cè)定的精確度應(yīng)該是IOOppm或更好。樣品組分可以基于分析物的一些物理、化學(xué)或者其它特異性質(zhì)如它們的分子大小、極性、電荷等分離。在一些實(shí)施方案中，幾種方法(幾種類型的層析)例如大小排阻層析、離子相互作用或者離子交換層析、特異分子相互作用(例如抗體-抗原)等組合在一起。若干這種層析方法也可以用于分級(jí)分離樣品。通過采用SCX層析作為第一維，其垂直于用作第二維的反相層析，分離效率顯著增加。在二維LCMS(2D-LC/MQ中的最佳表現(xiàn)在離線操作模式中獲得，因?yàn)槠涮峁┝嗽讵?dú)立優(yōu)化兩個(gè)分離系統(tǒng)中的最高自由度，并且其排除了有關(guān)分離效率的任何危害。SCX層析對(duì)于除去可能仍存在于肽樣品中并且可能在肽洗脫期間有干擾作用的任何殘余去污劑或緩沖液成分是重要的。這些化合物可以從SCX柱中在空體積中洗脫，因此將出現(xiàn)在通常不含肽的最早級(jí)分中。LC柱的分離效率可以表示為在單次運(yùn)行中可分離的組分?jǐn)?shù)目(即峰值容量)。柱分離效率是柱長度(L)和塔板高度(plate height, H)的商。根據(jù)Van Deemter (Van Deemter et al. 1956)，理論塔板高度(H)成比例地依賴于靜止相顆粒的顆粒大小(dp)。塔板計(jì)數(shù)的另一個(gè)參數(shù)是流動(dòng)相流速，其是具有最佳線速度 (接近lmm/s)的組合的線性和雙曲線函數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，柱頭壓被控制以使得流動(dòng)相具有大約這個(gè)值的線性速度。LCMS裝備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且他了解各種替代裝備是可能的這一事實(shí)。圖1示出的裝備僅僅是許多可能裝備之一的例子。圖2示出發(fā)射器30的端頭，發(fā)射器30是示意性示出的電噴射離子化單元500的一部分。由虛線示出的單元500包括電源501連接502至發(fā)射器30，特別是連接至涂層。發(fā)射器30用連接器32連接至分析柱31的末端。連接器32僅示意性示出。圖2 示出連接至柱31的末端33的發(fā)射器30的橫截面。在該特異實(shí)施方案中，發(fā)射器30和柱末端33之間的連接是對(duì)接。在再一個(gè)實(shí)施方案中，使用金剛石切割器制備柱31的遠(yuǎn)端末端33和發(fā)射器30的近端末端34以使得在柱和端頭之間有合適的對(duì)接。柱31的外徑36優(yōu)選在200-800 μ m范圍。管材可包括熔融二氧化硅。在熔融二氧化硅管材中，形成內(nèi)腔37， 其具有內(nèi)徑38，優(yōu)選在大約10 μ m至大約200 μ m范圍，更優(yōu)選在15 μ m和50 μ m之間。發(fā)射器30包括連接至柱末端33的近端末端34和具有錐形形狀的遠(yuǎn)端末端39。 錐形末端39具有減小的外徑和減小的內(nèi)徑。在圖3a_3d中，提供了制備發(fā)射器30的端頭的方法的例子。在圖3a所示第一步中，例如使用丁烷火炬(butane torch)44(至少部分)除去熔融二氧化硅管材43的涂層 42。在接下來的步驟中，熔融二氧化硅43的加熱末端46 (通過圖北示意性示出的手段) 在方向45拉伸，導(dǎo)致發(fā)射器30在所述方向被拉伸或者拉長。管材被擠壓，減小內(nèi)腔并最終閉合其。然后在所述熔融二氧化硅管材外表面上提供涂層47，使電流導(dǎo)電到達(dá)其錐形末端46以允許電噴射操作。端頭靠近其錐形末端46的內(nèi)徑41優(yōu)選在大約2-30 μ m、更優(yōu)選 3-10 μ m范圍。較小的內(nèi)徑將進(jìn)一步增加后續(xù)質(zhì)譜分析的靈敏性。在圖3c中，示出上面提到的涂層施加于端頭上。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括貴金屬如金的第一涂層施加到端頭46上。然而，已經(jīng)示出金涂層在電噴射期間惡化并且不能長期提供連續(xù)的電傳導(dǎo)。替代或者額外地，碳基傳導(dǎo)性涂層被施加于端頭46上。這個(gè)涂層可以通過噴射過程施加于端頭上。在一個(gè)實(shí)施方案中，用氣溶膠或者蒸氣沉積法沉積碳。碳顆?？梢詰腋∮诋惐贾小Ｔ诟鶕?jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，施加涂層的步驟可以重復(fù)一次或一次以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)涂層被施加于每個(gè)上面。優(yōu)選地使用涂層組合涂覆端頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，首先施加金涂層然后是碳基傳導(dǎo)性涂層。在再一個(gè)實(shí)施方案中，首先施加金涂層，然后所述金涂層被一層碳基傳導(dǎo)性涂
21層覆蓋。所述一層碳基傳導(dǎo)性涂層通過制備懸浮于Iml異丙醇中的50mg的Leit-C 碳顆粒并且將其噴射在發(fā)射器上(即在端頭上)而施加。Leit-C-plast 是具有高電導(dǎo)率和永久可塑性的粘合劑并且可得自 Electron Microscopy Sciences (EMS)，Hatford，UK。在一個(gè)實(shí)施方案中，傳導(dǎo)性氧化抗性材料被用作在端頭錐形末端金涂層上面的進(jìn)一步的涂層。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用碳基傳導(dǎo)性涂層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用硅合金。在再一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)電聚合物被用作本發(fā)明的涂層或者用作額外涂層。所述額外涂層可以粘附于金涂層。所述額外涂層提供保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 涂層被噴射在發(fā)射器的錐形末端上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氧化抗性涂層施加于錐形末端上。合適的溶劑如異丙醇用于噴射。在另一個(gè)實(shí)施方案中，待噴射在發(fā)射器錐形末端上的漿液含有在Iml異丙醇中的30-70mg、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中45_55mg的傳導(dǎo)性碳膠合物 (cement)0在圖3d中所示的后續(xù)步驟中，發(fā)射器30的閉合末端48用切割器49例如金剛石切割器除去。切割導(dǎo)致發(fā)射器30具有減小的內(nèi)徑的錐形末端39。擠壓管材43及在管材 43的自由末端施加拉力的組合效果產(chǎn)生內(nèi)徑的平穩(wěn)減小。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于熔融二氧化硅管材的連接器用于連接捕獲柱和/或分析柱的各自部分。在LCMS裝備中，使用三向連接器或者T-連接器連接柱或閥。在現(xiàn)有技術(shù)中，使用Upchurch 三向連接器(在現(xiàn)有技術(shù)中已知為through-hole union，來自Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA)。優(yōu)選地，具有外徑和內(nèi)徑、內(nèi)徑限定一個(gè)腔的由熔融二氧化硅組成的管材用這種連接器連接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中連接器是through-hole連接
ο在一個(gè)實(shí)施方案中，LCMS裝置包括具有25 μ m內(nèi)徑的納級(jí)柱。在使用肽的應(yīng)用中， 這些肽以具有典型地1納升或更少體積的濃縮條帶遷移通過這種柱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了缺乏死體積的用于納級(jí)管材的連接器，它們優(yōu)選地適于在超過400巴(即^104kPa)壓力下使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接器是適應(yīng)的Upchurch through-hole T-連接器。在一個(gè)實(shí)施方案中，T-連接器包括至少一個(gè)、可能兩個(gè)卡套(ferrule)、優(yōu)選三個(gè)卡套。管材、特別是微毛細(xì)(microcapillary)納級(jí)柱可以被接納在卡套的腔內(nèi)。這使得管材裝備在連接元件的內(nèi)體積中?？ㄌ浊皇呛线m大小的?？ㄌ浊皇峭ㄟ^腔(through cavity), 具有通常等于或接近于待接納在卡套腔中的管材的外徑的內(nèi)徑?？ㄌ浊慌c插入管材的管材的外徑具有摩擦性接觸。與連接器組合的卡套用于將管材的腔與連接元件的腔對(duì)準(zhǔn)(align)。連接元件包括用于安裝卡套的接納腔(receiving cavity)，其中安裝腔(fitting cavity)和卡套配合并且是可斷開的。在連接狀態(tài)，卡套將具有內(nèi)腔的管材相對(duì)于連接元件內(nèi)腔定位。優(yōu)選地，連接元件包括兩個(gè)卡套安裝腔組合。在目前Upchurch設(shè)計(jì)中，連接器的內(nèi)體積包括死體積。相對(duì)目前Upchurch設(shè)計(jì)，內(nèi)腔被擴(kuò)大很多。這與本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知技能是相反的。圖4示出圖1裝備1的三向連接或轉(zhuǎn)換元件20，21的細(xì)節(jié)。該圖不是按比例的。更特異地，所示元件的直徑比率不限于所示比率。三向連接元件20包括3個(gè)卡套51-53。所述卡套是適合在三向連接器20的三個(gè)末端的接納腔中的物體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述三個(gè)卡套具有不同大小。適合的卡套可以由于其形狀基本上相應(yīng)于腔的形狀而在腔中自身對(duì)準(zhǔn)。更特異地，在所示實(shí)施方案中，所述卡套可以具有相應(yīng)于腔的圓錐形式的圓錐形式。自身對(duì)準(zhǔn)將使得卡套的接納腔進(jìn)入相對(duì)于連接元件20的預(yù)定位置?？ㄌ?1-53可包括腔。管材M-56的外徑和腔的內(nèi)徑相適合以使得卡套在其腔中接納任何管材討-56?？ㄌ?1-53示出在連接狀態(tài)，接納在連接元件20，21的相應(yīng)腔中。提供了帽 (cap) 57-59，所述的帽包括固定系統(tǒng)(未示出細(xì)節(jié))以將帽57-59固定到連接器上并由此固定卡套51-53的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，固定系統(tǒng)包括鎖閉系統(tǒng)(locking system)，例如螺釘樣連接(screwlike connection)。固定系統(tǒng)還可以構(gòu)造并設(shè)置用于固定和夾緊卡套51-53在連接狀態(tài)，導(dǎo)致夾緊力施加在管材M-56的外徑上。這導(dǎo)致管材M-56被鎖定在它們各自位置。連接元件20、卡套51-53和帽57-59可以用各種制造技術(shù)制造，特別是通過注塑制造。管材M，56在這樣的狀態(tài)，其中它們被接納在卡套中，卡套連接至連接元件，基本上對(duì)準(zhǔn)。這意味著管材M，56的內(nèi)腔也基本上對(duì)準(zhǔn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接元件的內(nèi)體積、優(yōu)選連接器的T-body的內(nèi)體積與用于接納管材的卡套的腔對(duì)準(zhǔn)。在這種修改的連接元件中，優(yōu)選其中連接元件的內(nèi)體(inner body)的一部分已經(jīng)通過鉆進(jìn)除去的Upchurch元件，現(xiàn)在提供了一種連接元件，其使得管材對(duì)準(zhǔn)連接元件的兩個(gè)各自橫向末端并且管材的位置是它們的末端對(duì)接在連接元件內(nèi)，連接元件位于連接器優(yōu)選三向連接器的內(nèi)腔中。在所示實(shí)施方案中，熔融二氧化硅M，56的末端60，61已用金剛石切割器切割以得到直切口，使得管材M，56與連接狀態(tài)的卡套51，53對(duì)接。這防止在連接元件20本體內(nèi)存在死體積。盡管是對(duì)接連接，來自管材M，56內(nèi)的液體仍可以通過對(duì)接末端泄露，使得液體穿過管材55。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接元件包括固定元件用于將卡套相對(duì)于連接元件固定。 在一個(gè)實(shí)施方案中，固定裝置包括夾緊裝置。在一個(gè)實(shí)施方案中，夾緊卡套會(huì)導(dǎo)致夾緊管材在被接納在卡套中的位置。構(gòu)造和設(shè)置固定裝置以固定管材以及卡套在相應(yīng)位置。在再一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)管材連接在三向連接器中，其中連接元件的入口和出口呈一直線，第三個(gè)連接器垂直于這條直線連接。管材呈對(duì)接位置，這個(gè)對(duì)接連接不是必須在連接管材的精確正中，因?yàn)榈谌齻€(gè)連接器具有連接通道，泄露體積由于在液相層析中使用的高壓能夠到達(dá)這個(gè)連接通道。圖5和圖6顯示壓力容器或bomb 70。bomb 70可以含有層析顆粒的懸浮液，優(yōu)選含有懸浮的層析靜止相的小瓶。在一個(gè)實(shí)施方案中，管材被加熱，例如通過將管材置于溫度編程烘箱中加熱。優(yōu)選使用編程溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始溫度設(shè)為30°C，持續(xù)5分鐘，隨后在15分鐘內(nèi)增加至100°C，這個(gè)溫度保持5小時(shí)。隨后，玻璃料和管材被冷卻至環(huán)境溫度。之后，硬化的玻璃料和熔融二氧化硅被冷卻至室溫。接著，用熔融二氧化硅切割器修剪所形成的陶瓷玻璃料至長度大約為l_2mm。優(yōu)選使用直切口。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過填充柱而制造和提供納級(jí)LC柱。填充柱的方法包括在熔融二氧化硅(FS)管材中制備保留顆粒的玻璃料(a particle retaining frit)。切割所述管材以具有希望的長度。在一特異實(shí)施方案中，提供了比率為90/10(v/v)的硅酸鉀溶液 (本文也稱為KASIL)與甲酰胺的混合物。劇烈振蕩所述混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用渦旋混合物例如10秒渦旋。優(yōu)選地在其后立即將熔融二氧化硅浸入這個(gè)混合物一段短時(shí)間(不是關(guān)鍵的，例如1秒)以使得一段幾厘米長的所述混合物被吸入管材中。在一個(gè)實(shí)施方案中，填充LC分析柱包括將被提供有玻璃料的熔融二氧化硅管材裝配在壓力容器(bomb)中。所述壓力容器可以含有希望顆粒的漿液。優(yōu)選地，使用卡套將所述的管材裝配到所述壓力容器。優(yōu)選地，使用本發(fā)明的連接部件將管材連接在壓力容器中。優(yōu)選地，使用振動(dòng)元件(vibrating element) 74使整個(gè)柱振動(dòng)。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在柱長度上的至少兩個(gè)位置振動(dòng)柱。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少兩個(gè)頻率優(yōu)選超聲頻率進(jìn)行振動(dòng)。在特異的實(shí)施方案中，熔融二氧化硅柱的熔成玻璃料的末端被置于超聲浴(例如 Branson 200)中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，僅在固相顆粒被沖入熔融二氧化硅柱中之后進(jìn)行
超聲處理。在填充柱的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用高度濃縮(稠)的漿液。使用漿液是填充窄(25 μ m ID)且長柱的最方便方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，漿液含有至少150mg懸浮于Iml丙酮中的反相顆粒。在填充期間丙酮相對(duì)于異丙醇通過柱的線性速度是令人驚訝的7士 1倍。在制造填充柱的另一個(gè)特異實(shí)施方案中，熔成玻璃料的FS管材通過具有0. 5mm孔的卡套放置于(frit up)壓力容器中希望顆粒的漿液中?？ㄌ着c所述容器連接。接下來， 裝配在例如氦氣缸上的減壓器的第二級(jí)壓力被調(diào)節(jié)為大約50巴并例如通過開啟閥(例如 Swagelok SS-41GSX2閥)而將所述壓力施加于bomb。一旦柱準(zhǔn)備好，則用雙目鏡0 )目視檢查填充緊密性。在使用前，用HPLC泵以 250巴壓力用乙腈/水(85/15，ν/ν)加0. IM乙酸沖洗柱。優(yōu)選柱在使用前測(cè)試?？梢詸z查柱的背壓(巴/cm)。將一插套(內(nèi)徑0. 4mm)置于柱的熔成玻璃料的末端。測(cè)量插套中彎月面的位移(mm) 1分鐘。體積根據(jù)如下得出流速(nl/min)=位移(mm) χ 100 (n 1/mm)。讀出泵的壓力并計(jì)算橫過柱的標(biāo)準(zhǔn)化壓降(Pb，巴/cm柱長度)Pb =[時(shí)間 / 體積]χ [ (ID/50) 2X125] xP/L其中“時(shí)間”是以分鐘表示的流量計(jì)量時(shí)間，“體積”是以nl表示的收集的體積， “ID”是以ym表示的柱內(nèi)徑，“P”是以巴表示的流量計(jì)量期間柱頭壓，“L”是以cm表示的
柱長度。提供了熔融二氧化硅管材71，在管材71的一個(gè)末端形成多孔陶瓷玻璃料72。另一末端連接于高壓容器70。所述高壓將部分懸浮顆粒帶入腔。在顆粒流動(dòng)進(jìn)入腔期間，可以使用超聲振動(dòng)元件74振動(dòng)柱或者柱71的部分以防止在顆粒中形成空體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，振動(dòng)元件74置于靠近柱中的材料阻塞的位置。當(dāng)發(fā)生下游阻塞時(shí)，柱可以被提起來到漿液外(但仍在容器中)并且沖出液體至干燥。隨后，將FS放回漿液中，重新開始填充過程直至獲得希望的床長度。圖7示意性示出待與本發(fā)明的實(shí)施方案之一組合使用的液相層析應(yīng)用的二維。作為第一維，使用強(qiáng)陽離子交換(SCX)及在示出的實(shí)施方案中使用SCX與弱陰離子交換(WAX) 樹脂的混合床。如Motoyama所述的(Motoyama et al. 2007)陰離子和陽離子交換顆粒的混合床是優(yōu)選的。第二維可以是所示出的C18反相(RP)層析。SCX和反相層析的相容性差，特別是結(jié)合使用陽離子溶劑、緩沖液或者介質(zhì)時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用溶劑介質(zhì)81如甲酸或者鹽酸(HC1)。盡管這些介質(zhì)的洗脫強(qiáng)度較低，但是特別是甲酸顯示出回收結(jié)合在陰離子-陽離子交換(ACE)樹脂上的肽的高效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶解消化的蛋白質(zhì)的多維LCMS/MS分析，其中SCX分級(jí)分離與RP分離結(jié)合使用。這些分析技術(shù)聯(lián)用以增加分離效率和分析的動(dòng)力學(xué)范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在線多維LC方法，其使用陰離子和陽離子交換顆粒的混合床作為第一分離維。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用根據(jù)Motoyama (Motoyama et al. 2007)的混合離子交換床。在LCMS裝置的一個(gè)實(shí)施方案中，樣品以在線方式分級(jí)分離。優(yōu)選地，在LCMS裝置中構(gòu)造并設(shè)置二維層析。優(yōu)選地所述分離機(jī)制的至少一種使用樣品組分的疏水性質(zhì)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所用的分離機(jī)制的至少一種是SCX，其優(yōu)選用于分級(jí)分離HLA-DR洗脫樣
P
ΡΠ O在一個(gè)實(shí)施方案中，使用正交分級(jí)分離。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中使用SCX分級(jí)分離。在一個(gè)組合裝備中，總分析時(shí)間可以容易地增加典型15倍。SCX維可以以在線及離線方式使用。 SCX樹脂包含顆粒表面具有強(qiáng)負(fù)電基團(tuán)的顆粒，使得結(jié)合帶正電分子。SCX樹脂能夠保持(保留/結(jié)合)帶正電肽。通常，結(jié)合分子通過用增加強(qiáng)度的合適陽離子鹽水溶液的(連續(xù)/非連續(xù))梯度沖洗樹脂來置換/洗脫而釋放/回收。因?yàn)樘荻龋瑑H松散結(jié)合的分子會(huì)比強(qiáng)結(jié)合分子走得更快。這導(dǎo)致復(fù)雜樣品的希望的分離。第二維可以是反相層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二個(gè)分離步驟優(yōu)選包括C18 RP層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，LCMS裝置的C18反相包括混合陰離子和陽離子交換固相提取捕獲柱。SCX和RP分離之間的正交性是由于SCX使用靜電相互作用保留肽這一事實(shí)。在實(shí)踐中，SCX肽分離中的保留是靜電(主要)和疏水(次要)相互作用的組合，后者由磺?；酆衔镏麈湹氖杷再|(zhì)產(chǎn)生。這種“混合模式”性質(zhì)已被認(rèn)識(shí)到是SCX可以分離具有相同凈電荷的結(jié)構(gòu)相似肽的原因之一。離子交換(IEX)和RP分離之間的正交性是基于靜電相互作用和疏水性。在實(shí)踐
25中，IEX肽分離中的保留是靜電(主要)和疏水(次要)相互作用的組合，后者由與在二氧化硅顆粒表面性質(zhì)的硅烷醇基的疏水相互作用產(chǎn)生。這種“混合模式”性質(zhì)已被認(rèn)識(shí)到是 IEX可以分離具有相同凈電荷的結(jié)構(gòu)相似肽的原因之一。優(yōu)選地，LCMS方法包括使用弱陰離子交換(Poly WAX LP , The Nest Group, Inc. 45 Valley Road Southborough, MA 01772-1323，本文也稱為 WAX)分級(jí)分離的步驟。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，WAX顆粒包括一層交聯(lián)涂層，所述涂層包含正陽離子顆粒。更優(yōu)選地，WAX顆粒包括與線性聚乙烯亞胺交聯(lián)的基于二氧化硅的材料。LCMS裝置優(yōu)選包括ACE固相提取柱作為回收結(jié)合的肽的第一維。在一個(gè)實(shí)施方案中，SCX中的肽洗脫可以用揮發(fā)性有機(jī)鹽如醋酸銨實(shí)現(xiàn)。在醋酸中的醋酸銨已被提議為用于從ACE柱分離肽的合適溶劑介質(zhì)。圖8是用于由MHC I型或MHC II型分子呈遞的T細(xì)胞表位的分配的質(zhì)譜識(shí)別模式示意圖。上圖MHC I型相關(guān)肽通過它們的二項(xiàng)式質(zhì)譜同位素分布而鑒定，所述分布是由于摻入天然和同位素標(biāo)記的氨基酸殘基(在感染期間以等摩爾量存在于培養(yǎng)基中)所致。 自身肽的上調(diào)程度可以基于天然表位的單一同位素質(zhì)量(m)和單標(biāo)記表位的單一同位素質(zhì)量(m+Δ)的強(qiáng)度比率而計(jì)算。對(duì)于從頭合成的蛋白質(zhì)和病原體來源的蛋白質(zhì)，理論同位素模式將顯示精確的二項(xiàng)式分布。含有至多2個(gè)標(biāo)記的氨基酸殘基的表位的理論同位素分布模式在上圖中給出，上圖為自身肽的未改變的表達(dá)及上調(diào)5倍、20倍和100倍的表達(dá)以及針對(duì)從頭合成的上調(diào)的自身肽或者感染后的病毒肽。下圖源自病原體的MHC II型相關(guān)肽可以無疑義地與自身肽區(qū)分，基于實(shí)驗(yàn)方法II中描述的其特征性質(zhì)譜雙峰。圖9示出來自衍生自MV感染的WH細(xì)胞的未分級(jí)分離的HLA-A2 Iigandome的LCMS 基峰離子示蹤，所述示蹤采用如實(shí)驗(yàn)方法I所述的標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)后獲得(上圖)以及采用平臺(tái)LCMS技術(shù)后獲得(下圖)。圖10示出高質(zhì)量納級(jí)LC技術(shù)在復(fù)雜樣品分析中的應(yīng)用。使用不同梯度譜在90cm 長C18柱(50μπι ID,df = 5ym)上分離胰蛋白酶化肽，所述梯度譜范圍為2%/min有機(jī)改性劑乙腈(上圖)增加至6.7%乙腈/小時(shí)(中間圖)及至4%乙腈/小時(shí)(下圖)。半最大峰寬(peak-width-at-half-maximum) (FffHM)從3增加至大約30秒。峰容量從陡梯度中的大約300(上圖)增加至緩梯度中的大約900(下圖)。增加工作循環(huán)(作為運(yùn)行時(shí)間百分比的洗脫窗)和MS源中化合物的擴(kuò)大存在使得可以對(duì)低豐度肽進(jìn)行深入的數(shù)據(jù)依賴性多級(jí)LCMS分析(即肽挖掘(ρ印tide mining) )0對(duì)于圖11，來自人MDDC的復(fù)雜MHC II型Iigandome在分別用3_ μ m和5_ μ m C18顆粒填充的25-μπι ID柱(圖Α，基峰離子示蹤)和50-μ m ID柱(圖B，基峰離子示蹤)上用相同梯度斜率分析。固相參數(shù)確定在MHC II型ligandome分析中的LCMS性能。 25-μ m ID柱顯示在靈敏性和峰分辨率方面顯著改善的LCMS性能。圖C和D詳細(xì)示出分別在25-μπι ID和50-μπι ID柱上這個(gè)樣品中兩個(gè)同重肽(即不相同的肽序列，但是具有相同的質(zhì)量[Μ+2Η]2+ = 615. 4Da)的LC性能差異。對(duì)于圖12，對(duì)分離自在用流感病毒感染后的人MDDC的HLA-A2 ligandome以及如實(shí)驗(yàn)方法I (方法C)所述使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸進(jìn)行LCMS分析。上圖顯示通過幾乎二項(xiàng)式分布的同位素模式示出的帶2電荷的上調(diào)的表位。三個(gè)標(biāo)記殘基摻入表位中。在 m/z 573.3Da(下圖)獲得的這個(gè)肽的MS/MS譜揭示肽序列(基于y_型離子系列及精確質(zhì)量測(cè)定)為VVSEVDIAKAD。這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)已在感染期間用亮氨酸(L)、纈氨酸(V)和甲硫氨酸(M)作為培養(yǎng)基中的標(biāo)記殘基進(jìn)行。這個(gè)肽中的三個(gè)標(biāo)記殘基全部是纈氨酸(V)。這個(gè)表位的上調(diào)程度可以基于在m/z 573. 306Da的天然表位的單一同位素質(zhì)量m與在m/z 576. 313Da的單一標(biāo)記的異構(gòu)體的單一同位素質(zhì)量[m+3]的質(zhì)譜強(qiáng)度比率而計(jì)算(見實(shí)驗(yàn)方法I)。對(duì)于這個(gè)特定表位，由于流感病毒感染導(dǎo)致的上調(diào)程度等于16。
對(duì)于圖13，對(duì)分離自如實(shí)驗(yàn)方法II (方法D)所述用14N-和15N-標(biāo)記的百日咳博德特氏菌全細(xì)胞制備物脈沖后的人MDDC的HLA-DR2 Iigandome進(jìn)行LCMS分析。上圖顯示ESI質(zhì)譜，含有在m/z 788. 94Da和797. 42Da的帶2電荷的質(zhì)譜雙峰。插圖示出去卷積 (deconvoluted)質(zhì)譜，表示含有17個(gè)氮原子的候選百日咳博德特氏菌肽。所述MS譜符合使用穩(wěn)定同位素方法的細(xì)菌來源表位正分配(positive allocation)的一般標(biāo)準(zhǔn)(見文字)。下圖顯示在m/z 788. 94Da的這個(gè)肽的去卷積MS/MS譜，揭示推定的周質(zhì)蛋白(登錄號(hào)CAE43606)來源肽AAFIALYPNSQLAPT序列(b_型離子系列)。對(duì)于圖14，對(duì)分離自如實(shí)驗(yàn)方法II (方法E)所述用14N-和15N-標(biāo)記的百日咳博德特氏菌rP. 69 Prnl脈沖后的各種人MDDC的異質(zhì)混合物的HLA-DR Iigandome進(jìn)行LCMS 分析。上圖顯示ESI質(zhì)譜，含有在m/z 770. 43Da和780. 39Da的帶2電荷的質(zhì)譜雙峰。插圖示出去卷積質(zhì)譜，表示含有20個(gè)氮原子的候選rP. 69 Prnl來源肽。所述MS譜符合使用質(zhì)量標(biāo)記輔助方法rP. 69 Prnl來源表位正分配的一般標(biāo)準(zhǔn)(見文字)。下圖顯示在m/z 770. 43Da這個(gè)肽的去卷積MS/MS譜，揭示rP. 69 Prnl來源肽LRDTNVTAVPASGAPA序列(b-型離子系列)。對(duì)于圖15，對(duì)分離自如實(shí)驗(yàn)方法II (方法F)所述用不同的14N-和15N-標(biāo)記的腦膜炎奈瑟氏球菌OMV制備物脈沖后的人MDDC的HLA-DR1/P1. 7-2,4和HLA-DR2/P1. 5-2,10 Iigandome 進(jìn)行 LCMS 分析。在圖 A 的 HLA-DR1/P1. 7-2，4 樣品及圖 B 的 HLA-DR2/P1. 5-2,10 樣品的Iigandome中通過檢索算法均檢測(cè)到譜雙峰。MS測(cè)序鑒別了 Pl. 7_2，4衍生的表位 SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK (圖 B)及其 Pl. 5-2，10 同系物 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK (圖 D)。在這些表位的第3位和第16位的殘基是菌株特異性的。所述LCMS譜符合使用質(zhì)量標(biāo)記輔助方法(實(shí)驗(yàn)方法II)的細(xì)菌來源表位的一般標(biāo)準(zhǔn)。另外，在每個(gè)表位中所含的氮原子數(shù)可以從LCMS譜中推導(dǎo)出。在圖A中所述帶2電荷質(zhì)譜雙峰(Δ = 12Da)和在圖B中所述帶3 電荷質(zhì)譜雙峰(Δ = 8. ODa)之間的質(zhì)量差異顯示每個(gè)表位含有24個(gè)N原子。事實(shí)上，兩個(gè)鑒別的表位均符合這些數(shù)據(jù)。對(duì)于圖16，對(duì)分離自如實(shí)驗(yàn)方法II (方法F)所述用14N-和15N-標(biāo)記的腦膜炎奈瑟氏球菌P1. 7-2，40MV制備物脈沖后的人MDDC的HLA-DRl 1 igandome進(jìn)行LCMS分析。作為代表區(qū)域8的一組長度變體之一，鑒別了腦膜炎奈瑟氏球菌P. 1-7-2，4來源表位 IGNYTQINAASVGL(圖A和C)。在這個(gè)天然表位的豐度，檢測(cè)到一個(gè)帶2電荷質(zhì)譜雙峰， 代表不規(guī)則Pl. 7-2，4衍生表位，其顯示出與天然表位的令人驚訝的相似性，除了 C末端氨基酸殘基僅+IDa不同。IGNYTQINAASVG-[+114Da](圖B和D)(注意該不規(guī)則表位中所含的病原體衍生的氮原子數(shù)根據(jù)其離子對(duì)推導(dǎo)是18，與天然表位的17不同)。結(jié)果，非天然表位(D)的完整y_型離子系列與天然表位(C)相比位移+IDa，而b-型離子系列保持未變。 所述雙峰的重離子和輕離子的集合y-和b-型離子系列表明這個(gè)非天然表位是病原體衍生蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)剪切事件及隨后同一個(gè)Pl. 7-2，4分子的不同片段的分子內(nèi)連接的結(jié)果，導(dǎo)致產(chǎn)生剪接的MHC II型配體。圖17示出人MB71.5 T細(xì)胞對(duì)Pl. 5-2，10和Pl. 7-2，4 ‘區(qū)域4，表位的差異識(shí)別。八僅871.51~細(xì)胞，在用重組？1.5-2，10蛋白體外再刺激(2x)來自供體MB71的PBMC 后產(chǎn)生，在用合成肽 PEFSGFSGSVQFVPAQNS (S011-24)和 SGSVQFVPAQNSKSAYTP (S011-25) 脈沖的自體PBMC存在下增殖，但是用PDFSGFSGSVQFVPIQNS(S004. 29)或 SGSVQFVPIQNSKSAYTP (S004. 30)不增殖。B :MB71. 5T細(xì)胞僅識(shí)別在“區(qū)域4〃序列的C末端部分表達(dá)丙氨酸(A)的PorA變體，即Pl. 5-2，10，Pl. 5-1，2-2和Pl. 22，14，但是不識(shí)別在該位置表達(dá)異亮氨酸(I)的變體，即Pl. 7-2,4, Pl. 7，16和Pl. 19，15 (見結(jié)果部分文字)。
實(shí)施例 實(shí)驗(yàn)方法I :MHC I 型 Iigandome麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒將Edmonston B株系的噬斑純化的麻疹病毒(后文稱作MV)在Vero細(xì)胞中生長。 流感病毒(A/Wisconsin/67/2005株)在MDCKl細(xì)胞中生長。噬斑純化的呼吸道合胞病毒 (RSV-A2 no. VR-1302，ATTC)在 h印-2 細(xì)胞中生長。人B細(xì)胞系冊(cè)和MB02及人單核細(xì)胞衍牛的樹突細(xì)胞將表達(dá)HLA-A*0201的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系WH和表達(dá)HLA_A*0201，_B*0701的^V 轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系MB-02在補(bǔ)加抗生素和5%胎牛血清(后文稱作FBS，Harlan，USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(后文稱作MDDC)根據(jù)Sal lusto (Sal lusto et al. 1994)所述程序進(jìn)行培養(yǎng)。簡而言之，通過對(duì)從HLA-A*0201，_B*0701純合血液供體中知情同意獲得白細(xì)胞除去法暗黃覆蓋層的Iymphopr印(Axis-shield，Norway)進(jìn)行密度離心新鮮分離1 X 109PBMC。將PBMC以5xl06/ml密度種植在濕化保溫儀中的150_mm組織培養(yǎng)皿(Corning Costar，USA)中在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，所述培養(yǎng)皿中具有補(bǔ)加抗生素(GibcoBRL，USA)和 FBS 的 Iscove，s Modified Dulbecco' s 培養(yǎng)基(GibcoBRL, USA)。在除去未粘附的級(jí)分之后，將粘附細(xì)胞在含有抗生素、FBS、500U/ml重組人 GM-CSF (PeproTech,USA)和 250U/ml 重組人 IL_4 (Strathman Biotech, Deutschland)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)6天。在第3天更換培養(yǎng)基和生長因子。在第6天，MDDC準(zhǔn)備好進(jìn)行病毒感染。在病毒感染之前和之后，將1 %等份的MDDC通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)鑒定，以證實(shí)MDDC 的純度以及成熟(數(shù)據(jù)未示出)。肽合成使用SYRO II 同時(shí)多個(gè)肽合成儀(MultiSyntech GmbH, ffitten, Germany)通過固相FMOC化學(xué)制備合成的肽標(biāo)準(zhǔn)物。所述合成的肽的純度和性質(zhì)通過反相高效液相層析 (HPLC)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)方法A、A’、B、C和C’使得人細(xì)胞批次表達(dá)病毒感染相關(guān)的MHCI型 Iigandome0在方法A中，使用IO7組織培養(yǎng)感染劑量5(1/ml MV原種在含有抗生素和1 % FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)基中感染2 X IO9WH細(xì)胞的B細(xì)胞批次2小時(shí)，感染復(fù)數(shù)(后文稱作m.o. i.) 為0.5。之后，洗滌細(xì)胞并生長40小時(shí)以使得MV相關(guān)的MHC I型Iigandome表達(dá)。制備2X109未處理的WH細(xì)胞的另一細(xì)胞批次，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后表達(dá)對(duì)照MHC I型 ligandome。在分別制備和分析MHC I型Iigandome之前收獲這兩個(gè)細(xì)胞批次，洗滌、計(jì)數(shù)、 沉淀、速凍及貯存在_70°C。相似地，在方法A’中，使用IO8組織培養(yǎng)感染劑量5(l/ml流感病毒原種在含有抗生素和1 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中感染3. 5xl08MB_02細(xì)胞的B細(xì)胞批次1小時(shí)，感染復(fù)數(shù)(后文稱作m. ο. i.)為5。之后，洗滌細(xì)胞并使其生長另外9小時(shí)以使得流感病毒相關(guān) MHC I型ligandome表達(dá)。在制備和分析MHC I型ligandome之前，收獲該細(xì)胞批次，洗滌、 計(jì)數(shù)、沉淀、速凍及貯存在-70°C。
在方法B中，IO7組織培養(yǎng)感染劑量5(1/ml MV用于在含有抗生素和1 % FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基中感染1.5X109WH細(xì)胞的B細(xì)胞批次2小時(shí)，m. ο. i.為0. 5。隨后將這些細(xì)胞保溫40小時(shí)以使得病毒感染相關(guān)的MHC I型ligandome在RPMI-1640培養(yǎng)基中表達(dá)，所述培養(yǎng)基中無L-亮氨酸和L-甲硫氨酸(Invitrogen)，補(bǔ)加5% FBS，而且對(duì)于 50%標(biāo)準(zhǔn)濃度的L-亮氨酸和L-甲硫氨酸補(bǔ)加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸13C6-L-亮氨酸和 13C5Z5N1-L-甲硫氨酸(每個(gè)氨基酸與其未標(biāo)記的輕同位素相比質(zhì)量增加6Da ；Cambridge Isotope Laboratories)，對(duì)于另外50%補(bǔ)加未標(biāo)記的氨基酸L-亮氨酸和L-甲硫氨酸 (Sigma-Aldrich)。這些氨基酸是HLA-A2配體的主要錨殘基。含有5% FBS和100%未標(biāo)記的氨基酸的RPMI-1640培養(yǎng)基用于制備另一批次1.5X IO9未感染的WH細(xì)胞。在制備和分析MHC I型ligandome之前，收獲這兩個(gè)細(xì)胞批次，洗滌、計(jì)數(shù)、以1 1細(xì)胞比率混合， 然后沉淀為一個(gè)單一細(xì)胞批次、速凍及貯存在-70°C。在方法C中，使用7 X IO7噬斑形成單位/ml流感病毒感染2. 2 X 107HLA_A*0201純合MDDC細(xì)胞批次4小時(shí)，m. ο. i.為2。隨后將這些細(xì)胞保溫40小時(shí)，使得病毒感染相關(guān)的 MHC I型ligandome在RPMI-1640培養(yǎng)基中表達(dá)，所述培養(yǎng)基中無L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸(Invitrogen)，補(bǔ)加5% FBS，而且對(duì)于50%標(biāo)準(zhǔn)濃度的L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸補(bǔ)加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸13C6-L-亮氨酸、13C5,15N1-L-甲硫氨酸和13C5, 15N1-L-纈氨酸(每個(gè)氨基酸與其未標(biāo)記的輕同位素相比質(zhì)量增加6Da ；Cambridge Isotope Laboratories)，對(duì)于另外50%補(bǔ)加未標(biāo)記的氨基酸L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸 (Sigma-Aldrich)。制備另一 2. 2 X 107HLA_A*0201純合MDDC細(xì)胞批次，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后表達(dá)對(duì)照MHC I型ligandome。在制備和分析MHC I型ligandome之前，收獲這兩個(gè)批次細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)、以1 1細(xì)胞比率混合，然后沉淀為一個(gè)單一細(xì)胞批次、速凍并貯存在-70°C。相似地，在方法C’中，使用噬斑純化的呼吸道合胞病毒感染 2. 5X107HLA-A*0201，-B*0701純合MDDC細(xì)胞批次3小時(shí)，m. o. i.為5。隨后將這些細(xì)胞保溫48小時(shí)，使得病毒感染相關(guān)的MHC I型ligandome在完全RPMI-1640培養(yǎng)基中表達(dá)。在制備和分析MHC I型ligandome之前，收獲細(xì)胞批次、洗滌、計(jì)數(shù)、沉淀、速凍并貯存在_70°C。MHC I 型 ligandome 的分離將根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法A、A’、B、C或者C’生長的細(xì)胞批次解凍及裂解，以使MHC I型分子溶解，隨后分離病毒感染相關(guān)的MHC I型ligandome。簡而言之，將細(xì)胞在含有1 % CHAPS(Roche)和蛋白酶抑制劑的pH = 8. 0的TRIS-HCl緩沖液中裂解。離心后，將上清相繼經(jīng)過三個(gè)CNBr-激活的TRIS-封閉的瓊脂糖柱第一個(gè)非免疫球蛋白結(jié)合的柱(即預(yù)清除柱(preclearU)、第二個(gè)結(jié)合正常小鼠免疫球蛋白(即預(yù)清除柱2)以及第三個(gè)結(jié)合特異于人MHC I型分子的特異性小鼠抗體(即清除柱)。在一個(gè)實(shí)例中，使用與HLA-A2分子 (克隆BB7. 2)反應(yīng)的小鼠抗體；在另一個(gè)實(shí)例中，使用與HLA-B分子(克隆Bi. 23. 2)反應(yīng)的小鼠抗體。保留在清除柱上的MHC I型分子及相關(guān)的肽用10% (ν/ν)乙酸洗脫，并經(jīng)過 10-kDa分子量截?cái)嘀禐V膜。使用真空離心使濾物濃縮為士 10μ1，隨后在5%甲酸和5% 二甲亞砜中重建至終體積為100 μ 1，在-70°C溫度下貯存直至進(jìn)行分析。將所述肽混合物摻加已知量的兩種合成的肽標(biāo)準(zhǔn)物(血管緊張素-III和催產(chǎn)素，Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)以校準(zhǔn)在隨后的樣品處理期間的樣品損耗。標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)
通過納流(nanoflow)液相層析結(jié)合電噴射離子化質(zhì)譜分析(后文稱作LCMS)分析肽樣品。將代表士 IO9B-細(xì)胞或者1-2 X IO7MDDC的等份肽樣品加樣于標(biāo)準(zhǔn)納流LC柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)C18前置柱中，通過標(biāo)準(zhǔn)MicroTee管狀元件相繼連接20-cm長分析柱，所述分析柱內(nèi)徑(后文稱作ID)為50 μ m，充填5- μ m C18顆粒。使用的流動(dòng)相是線性梯度，流速為125nl/ 分鐘的乙腈，在55分鐘內(nèi)從僅100% A (水+0. I-M乙酸)至在A中僅60%乙腈+0. I-M乙酸。柱端頭用金涂層，柱頭壓為150bar。在質(zhì)譜分析儀(Q-TOF，Waters Corp.)上以每秒 “質(zhì)量與電荷比率”(后文稱作m/z)記錄質(zhì)譜，至少10，000半峰全寬(Full Width at Half Maximum)(后文稱作FWHM)的分辨超過300-1，500Da (MS分析)。對(duì)于候選病毒感染相關(guān)的MHC I型表位的MS測(cè)序(MS/MS分析)，主要使用隨后的肽樣品等份，MSl分析的周期與預(yù)選質(zhì)量或者質(zhì)譜分析儀中洗脫時(shí)間最富集的質(zhì)量的碰撞誘導(dǎo)斷裂的周期交替。MS/MS譜在掃描速度lsec/scan、質(zhì)量范圍50_2，OOODa及質(zhì)量分辨為5，OOOFffHM的條件下獲得。最佳碰撞能量主要依賴于表位的性質(zhì)和所用質(zhì)譜儀的類型，且在這些實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化。對(duì)MS/MS譜的解釋通過人工或者使用軟件工具解釋，例如 Mascot(Perkins et al. ,1999 at www. matrixscience. com, Matrix Science Ltd., London UK)>ProteinProspector(www. prospector, ucsf. edu,University of California, San Francisco, CA, USA)、Biofforks (Thermo Scientific, ffaltham, MA, USA)禾口 / 或 ProteinLynx (Waters Corp.，Milford, MA, USA)。對(duì)于鑒別的表位的半定量，相關(guān)應(yīng)答因數(shù)通過將鑒別的表位的合成類似物的強(qiáng)度量除以標(biāo)準(zhǔn)肽血管緊張素-III和催產(chǎn)素的平均強(qiáng)度量而計(jì)算。這些因數(shù)隨后用于對(duì)在細(xì)胞批次中存在的天然表位的數(shù)目進(jìn)行半定量。候選MV相關(guān)的MHC I型配體的鑒別在方法A中，對(duì)比衍生自MV感染的和未感染的WH細(xì)胞的MHC I型Iigandome中的MS離子示蹤，質(zhì)量對(duì)質(zhì)量。對(duì)于此的標(biāo)準(zhǔn)程序是使用在兩個(gè)樣品中均存在的富集肽離子評(píng)估在μ LC保留時(shí)間內(nèi)發(fā)生的微小改變。對(duì)僅在感染的WH細(xì)胞中出現(xiàn)的肽質(zhì)量進(jìn)行測(cè)序
及半定量。在方法B和C中，基本質(zhì)譜信息(由“質(zhì)量值”和“強(qiáng)度值”定義)從得自MHC I型 Iigandome的MS譜中提取并用于算法搜索。首先，基于如下各項(xiàng)計(jì)算模擬的同位素模式 (i)使用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的類型和數(shù)目，(ii)這些穩(wěn)定同位素的天然發(fā)生率，(iii)推測(cè)的摻入表位中的標(biāo)記的氨基酸的最大數(shù)目，(iv)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及(ν)涉及的離子的電荷狀況。每個(gè)單獨(dú)模擬的同位素模式均沿著MS譜的質(zhì)量軸以數(shù)學(xué)方式移動(dòng)。
圖8上圖示出了在如方法B中方法所述，在使用兩種穩(wěn)定同位素后提取自病毒感染的細(xì)胞批次的病毒和自身MHC I型配體的模擬的同位素模式。在兩個(gè)位置表達(dá)例如甲硫氨酸和/或亮氨酸的病毒表位可以通過質(zhì)量m (50)、m+Δ (100)和m+2 Δ (50)的相對(duì)比率識(shí)另|J，其中對(duì)于帶單電荷的離子△是6Da，其對(duì)于方法B中的標(biāo)記和細(xì)胞混合程序固有的三個(gè)同位素變體是典型的(圖8，上圖，右側(cè)模式)。另外，保持未改變的或者在病毒感染期間被上調(diào)的自身表位可以通過它們自己的同位素模式識(shí)別(圖8，上圖，左側(cè)4個(gè)模式)。另外， 可以計(jì)算上調(diào)程度，基于單標(biāo)記異構(gòu)體(Ι[ω+Δ])和天然表位(Im)的單一同位素質(zhì)量的強(qiáng)度比率，公式為
強(qiáng)度比率、
上調(diào)程度=2Χ --
yx-強(qiáng)度比率j其中χ代表表位內(nèi)所含的標(biāo)記氨基酸的最大數(shù)。上調(diào)至少2倍被認(rèn)為是與感染顯著相關(guān)的。因此，同位素模式針對(duì)3個(gè)標(biāo)記的氨基酸的使用而被模擬，如方法C。匹配同位素簇被選擇作為候選的病毒感染相關(guān)的MHC I型配體以用于進(jìn)一步LCMS/MS分析。平臺(tái)LCMS技術(shù)對(duì)于病毒感染相關(guān)的MHC I型ligandome的“肽挖掘”，修改LCMS系統(tǒng)的一些獨(dú)立參數(shù)以獲得靈敏性改良一或多個(gè)數(shù)量級(jí)的平臺(tái)LCMS技術(shù)，由此可以檢測(cè)例如在成批的 IO7-IO8個(gè)細(xì)胞中以單拷貝/細(xì)胞存在的MHC I型表位。所述平臺(tái)LCMC技術(shù)組成為標(biāo)準(zhǔn)納流LC柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)C18前置柱，通過修飾的 MicroTee管狀元件相繼連接于長度> 90cm的分析柱，所述分析柱ID為25 μ m,致密填充了 3ym C18顆粒。使用的流動(dòng)相是平緩線性梯度，流速為30nl/分鐘的乙腈，在240分鐘內(nèi)從在A(水+0. IM乙酸)中8%乙腈+0. IM乙酸至在A中28%乙腈。柱端頭用碳涂層，柱頭壓 ^ 400bar。如標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)所述進(jìn)行表位的MS譜解釋、隨后的MS/MS分析以及半定量。使用肽樣品分析平臺(tái)LCMS技術(shù)的優(yōu)越性，所述肽樣品得自在方法A中描述的MV 感染的WH B-細(xì)胞批次，得自在方法A’中描述的流感病毒感染的MB-02 B細(xì)胞-批次，以及得自在方法C’中描述的RSV-感染的MDDC細(xì)胞批次(如后文示出)。結(jié)果MHCI 型 ligandome標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)可以鑒別有限數(shù)目的HLA-A2-結(jié)合的MV表位在MV感染后如所述從人WH細(xì)胞獲得MHC I型配體以通過標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)鑒別MV 相關(guān)的MHC I型表位。研究兩個(gè)HLA-A2 ligandome樣品，一個(gè)通過方法A分析(減法分析)，一個(gè)HLA-A2 ligandome樣品通過方法B分析(同位素標(biāo)記)。在每種方法中，可以檢測(cè)三個(gè)候選的病毒相關(guān)的MHC I型表位，在MS/MS測(cè)序之后證實(shí)其是MV表位(表1)。如所公布的，標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)使得可以鑒別共4個(gè)不同的表位，含有超優(yōu)勢(shì)(supradominant) MV_C84_92表位，發(fā)現(xiàn)其以> 100，000拷貝/細(xì)胞表達(dá)。對(duì)比實(shí)施例平臺(tái)LCMS技術(shù)可以鑒別10-15倍更多的MV表位盡管標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)能支持在復(fù)雜的MHC I型ligandome樣品中以亞飛摩爾范圍在幾千個(gè)化學(xué)相似的自身表位中鑒別和鑒定一些、可能是最富集的病毒表位，但是有跡象表明現(xiàn)有技術(shù)存在關(guān)于重要的其它次優(yōu)勢(shì)病毒表位的知識(shí)缺口。我們探討了如果在該技術(shù)的LC部分進(jìn)行嚴(yán)格修飾將產(chǎn)生使得可以檢測(cè)和鑒定次優(yōu)勢(shì)MHC I型配體的平臺(tái)LCMS技術(shù)。圖9示出了對(duì)于一個(gè)單一 MV感染相關(guān)的MHC I型樣品(如在方法A中制備)的級(jí)分的典型LCMS峰性能，使用標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)(上圖)或者含有如在方法中所述的一些組合的獨(dú)立修飾的平臺(tái)LCMS技術(shù)(下圖)。下圖LCMS運(yùn)行的在線數(shù)據(jù)依賴性LCMS/MS測(cè)序(平臺(tái)技術(shù))可以鑒別39個(gè)MV衍生的HLA-A2配體，代表31 個(gè)不同表位(表2)。這些天然呈遞的表位中的26個(gè)表位是新的MV表位，3個(gè)是使用標(biāo)準(zhǔn) LCMS技術(shù)已經(jīng)鑒別的表位(表1)，2個(gè)盡管新鑒別是量化的天然HLA-A2配體，但是在文獻(xiàn)中描述為是小鼠和人 MV CD8+T 細(xì)胞表位(Neumeister et al. 1998，Nanan et al. 1995)。 因此，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)LCMS方法的平臺(tái)修改可以鑒別出至少10倍以上的表位。通過平臺(tái)LCMS技術(shù)從其它病毒中講行MHC I型Iigandome表位挖掘的其它實(shí)例

為了進(jìn)一步分析其優(yōu)越性，使用平臺(tái)LCMS技術(shù)分析如方法A’和C’所述從其它病毒感染的細(xì)胞批次中制備的MHC I型ligandome。鑒別6個(gè)病毒MHC I型表位，其通過標(biāo)準(zhǔn) LCMS技術(shù)不可檢測(cè)4個(gè)表位涉及流感病毒感染，2個(gè)表位涉及RSV感染(表2)。平臺(tái)LCMS技術(shù)對(duì)MHC I型ligandome的表位挖掘是通過對(duì)LC方法講行一勝獨(dú)立改良而實(shí)現(xiàn)為了體會(huì)所述方法中一個(gè)修飾對(duì)于峰性能和肽挖掘的作用，在單獨(dú)的支持性實(shí)驗(yàn)中研究梯度傾斜度組合長柱的作用以及C18顆粒大小組合柱ID的影響。如圖10所示，使用復(fù)雜胰蛋白酶化蛋白消化物，應(yīng)用更平緩和擴(kuò)展的梯度斜率組合90cm長柱可以增加層析中肽的峰容量及擴(kuò)展峰寬。這使得允許在MS來源中大量存在化合物，便于低豐度肽的綜合數(shù)據(jù)依賴性多級(jí)MS/MS分析(肽挖掘)。正如所期望的，當(dāng)使用充填在較小ID (25 μ m)的柱中的3-μ m C18顆粒時(shí)獲得LCMS系統(tǒng)的4倍的較高靈敏性，使用充填在50-μ m ID柱中的3-μπι C18顆粒則相反(圖11，上組)。出人預(yù)料地，分離效率也由較小ID柱改良(圖 11，下組)。平臺(tái)LCMS分析可以鑒別MV表位的特有特征MHC I型配體的除了序列信息和多樣性之外的重要特征是表位的長度變化、豐度和可能的ΡΤΜ。表2示出了在MV衍生的HLA-A2配體中發(fā)現(xiàn)的5個(gè)不同長度的肽8_聚體(η =2)，9-聚體(η = 21)，10-聚體(η = 9)，11-聚體(η = 5)及 12-聚體(η = 2)。因此，9-聚體是最普遍的，根據(jù)半定量數(shù)據(jù)，分別呈現(xiàn)26%和18%的MV-衍生的HLA-A2 ligandome的兩個(gè)最富集的肽種類均是9-聚體。從先前的研究中已知是超優(yōu)勢(shì)表位的KLWESPQEI (表1) 在這個(gè)分析中未充分呈現(xiàn)。這是預(yù)期的，因?yàn)閮H含有這個(gè)特殊表位的小HPLC級(jí)分為其它研究目的而從樣品中選擇性除去。從7個(gè)表位中，鑒別共有相同核心表位的2或3個(gè)長度變體(表2)。 此外，來自大結(jié)構(gòu)蛋白的表位RAN*VSLEEL、來自融合糖蛋白FO前體的KLMPN*ITLL 以及來自血凝素糖蛋白的LSVDLSpPTV (表2)是翻譯后修飾的表位，不可如此從翻譯的基因組中推導(dǎo)。這種修飾在關(guān)于病毒MHCI型表位的文獻(xiàn)中未描述。病毒感染相關(guān)的上調(diào)的MHC I型自身表位的鑒別如圖8所示，不僅病毒特異性表位、而且從頭誘導(dǎo)或者上調(diào)的自身表位通過組合使用同位素標(biāo)記與MHC I型分離和LCMS技術(shù)也可以被檢測(cè)。流感病毒感染相關(guān)的HLA-A2 ligandome分離自人MDDC，如方法C所述，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)。查找匹配應(yīng)用三個(gè)標(biāo)記的氨基酸的上調(diào)的肽的模擬同位素模式的同位素簇。圖12例證了具有3個(gè)同位素標(biāo)記的氨基酸的同位素簇的實(shí)例。所述表位被鑒別為VVSEVDIAKAD，衍生自人干擾素誘導(dǎo)的GTP-結(jié)合蛋白Mxl (登錄號(hào)P20591)。在流感病毒感染后鑒別出6個(gè)其它上調(diào)的自身表位(表3)。 盡管已經(jīng)報(bào)道其它自身表位是在病毒感染后上調(diào)的天然存在的MHC I型配體，但是本發(fā)明中鑒別的表位是新的表位且能與流感病毒感染特異性相關(guān)。實(shí)驗(yàn)方法II :MHC II 型 Iigandome 百日咳博德特氏菌菌株509在天然的含有14N的基本Bioexpress細(xì)胞生長培養(yǎng)基中或者在98% -富集的15N-穩(wěn)定同位素標(biāo)記的基本Bioexpress細(xì)胞生長培養(yǎng)基 (Cambridge Isotope Laboratories，USA)中生長至靜止期，兩個(gè)培養(yǎng)基均含有過濾的 0. 15%乳酸(Fluka, Switzerland)及 18. 6mM NaOH0 生長后，14N-禾口 15N-標(biāo)記的細(xì)菌培養(yǎng)物通過在56°C保溫30分鐘而熱失活，并通過在2000g離心20分鐘并將沉淀置于1/5體積 PBS中而在PBS中濃縮5倍。14N-和15N-標(biāo)記的全細(xì)胞制備物的光密度在590nm測(cè)量，為進(jìn)行抗原呈遞細(xì)胞的抗原脈沖，基于這些OD59tl值制備這些制備物的1 1混合物。從百日咳博德特氏菌制備重組P. 69 Pertactin含有編碼百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin野生型變體P. 69 Prnl (登錄號(hào) AJ011091)的胞外結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pPRNl (Hijnen et al. 2005)的大腸桿菌菌株BL21_Codonp Ius (DE3) -RP (Stratagene, la Jolla, CA)在天然的 14N 標(biāo)記的基本 Bioexpress 細(xì)胞生長培養(yǎng)基中或者在98原子％富集的15N-標(biāo)記的基本Bioexpress細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Cambridge Isotope Laboratories, USA)中在 250rpm 下于 37 °C 生長，直至 OD59tl 達(dá)到 0. 6-0. 8。隨后，培養(yǎng)物用ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，并再保溫4小時(shí)。誘導(dǎo)的14N-和15N-標(biāo)記的細(xì)菌通過在4°C 5000g離心10分鐘收集，隨后用Bug Buster試劑 (Novagen, Darmstadt, Germany)裂解。細(xì)胞裂解物用每克濕細(xì)胞糊用5，000U溶菌酶和125U benzonase核酸酶處理。離心收集包涵體并用1 10稀釋的Bug Buster試劑洗滌3次。 純化的14N-和15N-標(biāo)記的包涵體溶解在6M鹽酸胍(GuHCl)，IOmM苯甲脒，ImM EDTA, IOOmM NaCl和50mM Tris ‘ HCl pH = 8. 8中。14N-和15N-標(biāo)記的rP. 69 Prnl蛋白質(zhì)的重折疊通過快速50倍稀釋進(jìn)不含GuHCl的相同緩沖液中起始。在4°C對(duì)ImM EDTA, IOOmM NaCl禾口 50mM Tris -HCl pH = 8. 8過夜透析過程中使蛋白質(zhì)充分重折疊。隨后，用50kDa分子量截
(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA), Μ /fft WS&MXi 50mM Tris · HCl pH = 8. 8透析2次。蛋白質(zhì)在具有50_kDa截?cái)嘀档腁micon Ultra-15濃縮器 (Millipore,Billerica,MA)上濃縮。最后向lmg/ml濃縮蛋白質(zhì)中加入2 μ g蛋白酶抑制劑 (Roche，Penzberg，Germany) 。 ^jitif 入MDDC 白勺Bicinchoninic Acid( VX 下稱為 BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)中測(cè)量的蛋白質(zhì)含量，制備14N-和15N-標(biāo)記的rP. 69 Prnl蛋白的1 1蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)混合物。腦膜炎奈瑟氏球菌等基因菌株在基本培養(yǎng)基中的生長及OMV制備腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76的兩個(gè)分別表達(dá)可變主要外膜蛋白孔蛋白A(以下稱為 PorA)的血清亞型 Pl. 5-2，10 或 Pl. 7-2，4 的 class 3、class 等基因菌株(Peeter et al. 1996)在天然的含有14N的基本Bioexpress細(xì)胞生長培養(yǎng)基中或者在98%富集的15N-標(biāo)記的基本 Bioexpress 細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Cambridge Isotope Laboratories, USA)中生長至靜止期。從這些培養(yǎng)物制備14N-和15N-標(biāo)記的外膜小泡(以下稱為0MV)批次，并根據(jù)Claassen (Claassen et al. 1996)所述鑒定。為進(jìn)行人MDDC的抗原脈沖，基于在BCA蛋白質(zhì)測(cè)定(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)中測(cè)量的蛋白質(zhì)含量制備 14N-和15N-標(biāo)記的OMV批次的1 1蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)混合物。&縣·；麵馳表汰禾口統(tǒng)為進(jìn)行全細(xì)胞百日咳博德特氏菌制備物的蛋白質(zhì)分析，從14N-和15N-標(biāo)記的全細(xì)胞百日咳博德特氏菌制備物的小等份制備膜復(fù)合物。細(xì)菌細(xì)胞批次在7000g離心(15分鐘， IO0C )，沉淀重懸于IOmM Tris -HCl pH = 8. 0中。這些懸浮液在冰上超聲處理以破壞細(xì)胞膜，在6500g離心(10分鐘，IO0C )，收集上清。離心膜片段(40000g，1小時(shí))并置于IOmM Tris -HCl pH = 8. 0中的十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)中。膜復(fù)合物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(以下稱為SDS-PAGE)，之后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用抗已知毒力因子絲狀血凝素(1 500，克隆31E5)，P. 69 Pertactin(1 50，克隆Pem4)，百日咳毒素亞基1(1 1，000，克隆151C1)，百日咳毒素亞基4(1 100，克隆1-227)和Fimbriae 2(1 1，000，克隆21E7)的單克隆抗體探查(western印跡)，所有單克隆抗體均來自荷蘭 Netherlands Vaccine Institute。之后，膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG(1 5, 000 ； SBA, UK)保溫，用即用AP綴合物底物試劑盒(Biorad，USA)檢測(cè)信號(hào)。同位素標(biāo)記效率用P. 69 Pertactin作為代表性蛋白質(zhì)例子研究。在SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)后，14N-和15N-標(biāo)記的69-kDa條帶從凝膠上切下。將14N-和15N-標(biāo)記的P. 69 Pertactin及其胰蛋白酶消化物分別進(jìn)行LCMS (P. 69 Pertactin)和LCMS/MS (消化物)。14N-和15N-標(biāo)記的rP. 69 Pertactin制備物中蛋白質(zhì)的完整性及14N-和15N-OMV 制備物中PorA的完整性以及蛋白質(zhì)及胰蛋白酶消化物的同位素標(biāo)記效率用上述針對(duì)百日咳博德特氏菌膜復(fù)合物所述相似技術(shù)(SDS-PAGE，western印跡，LCMS和LCMS/MS)評(píng)估，特別是通過分別靶向P. 69 Pertactin和PorA進(jìn)行。對(duì)PorA，在western印跡中使用血清亞型特異性單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)方法D、E和F導(dǎo)致表達(dá)病原體相關(guān)MHC II型Iigandome的人MDDC批次在方法D中，人MDDC根據(jù)有小改變的實(shí)驗(yàn)方法I中所述程序進(jìn)行培養(yǎng)。在此，用白細(xì)胞除去法暗黃覆蓋層分離IxIO9PBMC,所述暗黃覆蓋層經(jīng)知情同意得自HLA-DR2純合血液供體。在第6天，仍未成熟的MDDC用終濃度為OD59tl = 0. 028的14N-和15N-標(biāo)記的全細(xì)胞百日咳博德特氏菌制備物的1 1混合物脈沖。在第8天，收集全細(xì)胞百日咳博德特氏菌脈沖的MDDC，在PBS中洗滌并計(jì)數(shù)。沉淀20x106MDDC，冷凍，在-80°C儲(chǔ)存直至肽分離和分析。在全細(xì)胞百日咳博德特氏菌脈沖之前和之后的小等份(1%)MDDC經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定以驗(yàn)證MDDC純度及成熟(未示出)。在方法E中，如上，人MDDC根據(jù)有小改變的實(shí)驗(yàn)方法I中所述程序進(jìn)行制備。在此，經(jīng)知情同意得自代表HLA-DR分型的異質(zhì)群體的9個(gè)不同血庫供體的PBMC分別培養(yǎng) (3xl08PBMC/供體)以生長MDDC。在第6天，仍未成熟的MDDC用最終蛋白質(zhì)濃度為10yg/ml 的14N-和15N-標(biāo)記的rP. 69 Pertactin制備物的1 1混合物在20ng/ml來自S. abort is equi的LPS的存在下脈沖。在第8天，收獲rP. 69 Pertactin-脈沖的MDDC (η = 9)，在PBS 中洗滌，合并并且計(jì)數(shù)。然后沉淀70χ106合并的MDDC，冷凍并儲(chǔ)存在-80°C直至肽分離和分析。在百日咳博德特氏菌rP. 69 Pertactin脈沖之前和之后的小等份(1%)MDDC經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定以驗(yàn)證MDDC純度及成熟(未示出)。
在方法F中，如上，人MDDC根據(jù)有小改變的實(shí)驗(yàn)方法I中所述程序進(jìn)行制備。在此，經(jīng)知情同意得自HLA-DRl純合供體及經(jīng)知情同意得自HLA-DR2純合供體的PBMC被分別培養(yǎng)QxIO9PBMC/供體)以生長MDDC。在第6天，每個(gè)MDDC批次分成兩個(gè)等份并用最終蛋白質(zhì)濃度為25 μ g/ml的14N-和15N-標(biāo)記的Pl. 7-2，40MV的1 1混合物或者14N-和 15N-標(biāo)記的Pl. 5-2，100MV的1 1混合物在20ng/ml來自S. abort is equi的LPS的存在下脈沖。在第8天，收獲4種不同的OMV脈沖的MDDC批次，在PBS中洗滌，計(jì)數(shù)，沉淀，冷凍并儲(chǔ)存在_80°C直至各個(gè)肽分離和分析。在OMV脈沖之前和之后的小等份(1%)的每種 MDDC批次經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定以驗(yàn)證MDDC純度及成熟(未示出)。肽合成合成肽標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)固相FMOC化學(xué)使用SYRO II同時(shí)多個(gè)肽合成儀(MultiSyntech GmbH, ffitten, Germany)制備。合成的肽的純度和性質(zhì)經(jīng)反相高效液相層析(HPLC)評(píng)估。MHC II 型 Iigandome 的分離根據(jù)方法D、E和F制備的MDDC批次解凍并裂解以溶解MHC II型分子，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法I所述的MHC I型Iigandome分離經(jīng)如下小改變而經(jīng)免疫化學(xué)分離病原體相關(guān)的MHC II型ligandome。在清除步驟中，使用特異于人HLA-DR分子的小鼠抗體(克隆B8. 11. 2)， 用10%乙酸從清除柱洗脫后，HLA-DR分子和締合肽通過ΙΟ-kDa分子量截?cái)嘀的V器，濾過物加熱15分鐘至700C ο MHC II型Iigandome的濃縮、重建、摻加(spiking)和儲(chǔ)存均類似于實(shí)驗(yàn)方法I中針對(duì)MHC I型ligandome所述的程序。平臺(tái)LCMS分析肽樣品經(jīng)本文上面所述的優(yōu)化的納流液相層析結(jié)合電噴射離子化-質(zhì)譜分析 (平臺(tái)LCMS)進(jìn)行分析。代表l-hl07MDDC的肽樣品等份上樣到C18前置柱，其經(jīng)修改的 MicroTee管狀元件順序連接25-cm長分析柱，所述分析柱具有25- μ m ID，用3- μ m C18顆粒致密填充。所用流動(dòng)相是流速為30μ Ι/min乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度，在45分鐘內(nèi)從100% A(水+0. I-M乙酸)至在A中的60%乙腈+0. I-M乙酸。柱端頭用金和碳涂覆，柱頭壓> 250巴。以1秒/掃描的掃描速率記錄質(zhì)譜，質(zhì)量范圍為300-1，500Da,質(zhì)量分辨率至少為10，OOOFffHM(MS分析)。對(duì)于候選病原體相關(guān)MHC II型表位的MS測(cè)序(MS/MS分析)，多數(shù)使用肽樣品的第二個(gè)等份，MSl分析循環(huán)與預(yù)選擇質(zhì)量或者在洗脫進(jìn)質(zhì)譜儀時(shí)最豐富的質(zhì)量上的碰撞誘導(dǎo)斷裂的循環(huán)交替。以1秒/掃描的掃描速率獲得MS/MS譜，質(zhì)量范圍為50-2，000Da，質(zhì)量分辨率為5，000FWHM。最佳碰撞能量主要取決于表位的性質(zhì)和所用質(zhì)譜儀的類型，并且在這些實(shí)驗(yàn)中被優(yōu)化。MS/MS譜的解釋手工進(jìn)行或者使用軟件工具，例如Mascot (Perkins et al. 1999. , www. matrixscience. com, Matrix Science Ltd. , London UK), ProteinProspector (www. prospector, ucsf.edu, Univ. of California, San Francisco, CA,USA),Bio Works (Thermo Scientific,ffaltham,MA,USA)和 / 或ProteinLynx (Waters Corp.，Milford, MA, USA)。為量化鑒別的表位，通過鑒別的表位的合成類似物的強(qiáng)度量除以標(biāo)準(zhǔn)肽血管緊張素III和催產(chǎn)素的強(qiáng)度量的平均值而計(jì)算相對(duì)應(yīng)答因數(shù)。這些因數(shù)隨后用于細(xì)胞批次中存在的天然表位數(shù)的半量化。在線2-維平臺(tái)LCMS分析
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通過在線2維納級(jí)液相層析結(jié)合電噴射離子化_質(zhì)譜分析(2D-LCMS)分析肽。代表1-2x107MDDC的肽樣品等份被上樣到包含以干顆粒重量為2-3比率混合的弱陰離子交換顆粒(例如Poly WAX LP ，得自PolyLC, Columbia, MD, USA)和強(qiáng)陽離子交換顆粒(例如 PolySULFOETHYL Aspartamide ，得自 PolyLC，Columbia, MD, USA)混合物的前置柱中。這種混合的陰離子-陽離子交換(ACE)靜止相以漿液填充在熔融二氧化硅管材中并夾心在兩個(gè)C18顆粒(例如尺印1~08丨1-卩1^ (1840，5“111顆粒大小，120 A孔徑，得自Dr. Maisch, Germany)床長度之間。前置柱床的每個(gè)部分的長度是20mm，前置柱的內(nèi)徑是50 μ m。 C18-ACE-C18夾心前置柱經(jīng)修改的MicroTee管狀元件連續(xù)連接至25 μ m ID的用3_μπι C18 顆粒(例如R印!·08丨1- 皿 (1840，3“111顆粒大小，120入孔徑，得自Dr. Maisch, Germany) 致密填充的25cm長分析柱。所用流動(dòng)相是流速為30 μ 1/min乙腈+0. I-M乙酸，從100% A(水+0. I-M乙酸)至在A中的60%乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度。柱端頭用金和碳涂覆，柱頭壓> 250巴。以1秒/掃描的掃描速率記錄質(zhì)譜，質(zhì)量范圍為300-1，500Da，質(zhì)量分辨率至少為10，000FWHM(MS分析)。進(jìn)行5個(gè)隨后的注射、分析分離和MS分析循環(huán)，注射等份包含水的含有增加量的甲酸和二甲基亞砜(DMSO)的無鹽洗脫溶劑，濃度分別為InM， 1 μ Μ, IOmM, IM和2M，隨后用上述乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度和質(zhì)譜分析條件進(jìn)行肽的分離和MS分析。候詵病原體相關(guān)的MHC II型配體的鑒別為將病原體衍生的MHC II型配體與自身衍生的配體區(qū)分開，從MS譜中提取關(guān)鍵的質(zhì)譜信息(由“質(zhì)量值”和“強(qiáng)度值”定義)并用于MHC II型質(zhì)譜解釋算法，檢索質(zhì)譜雙峰。為了明確地將質(zhì)譜雙峰歸為候選病原體相關(guān)的MHC II型配體，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)必須滿足(i) “輕”和“重”表位的單一同位素質(zhì)量的質(zhì)量差異(Am)必須是“輕”表位質(zhì)量的大約1.2%。這個(gè)相對(duì)質(zhì)量差異基于蛋白質(zhì)和肽中氮原子的平均天然發(fā)生率。每個(gè)氮原子質(zhì)量增加IDa導(dǎo)致針對(duì)完整肽/蛋白質(zhì)的1. 2%的相對(duì)質(zhì)量增量；(ii) “輕”和“重”表位的電荷狀態(tài)(Z)必須相等；(iii) “輕”和“重”表位的強(qiáng)度比必須是大約1 ；(iv) “重”表位的質(zhì)譜模式必須體現(xiàn)98原子％富集的15N-同位素的摻入，觀測(cè)為 [M*-l]和[M*-2]同位素峰(M*代表含有15N-同位素均勻摻入的“重”表位的單一同位素質(zhì)量)；(ν)計(jì)算的存在于候選表位中的氮原子數(shù)必須是整數(shù)。這個(gè)數(shù)可以通過“輕”和 “重”表位的單一同位素質(zhì)量的絕對(duì)質(zhì)量差異(Δπι)乘以這些表位的電荷狀態(tài)(ζ)而計(jì)算。圖8 (下圖，右側(cè)譜)示出當(dāng)使用穩(wěn)定同位素及滿足上述標(biāo)準(zhǔn)時(shí)提取自抗原脈沖的 MDDC的病原體相關(guān)的II型配體的模擬的同位素模式。候選病原體相關(guān)的MHC II型配體通過將模擬的同位素模式沿肽洗脫物的MS譜的質(zhì)量軸數(shù)學(xué)移動(dòng)而檢索。選擇匹配同位素簇用于進(jìn)一步LCMS/MS分析。免疫淋巴細(xì)胞知情同意后獲得來自Sanquin (Amsterdam)的健康血庫供體的外周血 (S03. 0015—X) 。fycoll_hyp￡ique(Ph￡irm￡ici￡i Biotech, Uppsala Sweden)
黃覆蓋層細(xì)胞而分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并新鮮使用或者冷凍保存直至用于實(shí)驗(yàn)。 PBMC在完全培養(yǎng)基即補(bǔ)加2%人AB血清(Harlan，USA)的AIM-V培養(yǎng)基(GibcoBRL，USA)中培養(yǎng)。雌性spf Balb/c小鼠和C57black/6小鼠購自Harlan并在常規(guī)條件下保持。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過The Animal Ethics Committee of the NVI批準(zhǔn)。各組4只小鼠在第0天和第28天用含有在PBS中的rPl. 7-2,4或rPl. 5-2,10 (1. 5 μ g)的LpxLl佐劑化脂質(zhì)體或者用如實(shí)驗(yàn)方法II所述制備的Pl. 7-2，4或Pl. 5-2，100MV (Ijyg PorA/劑)皮下免疫。 在第42天解剖后，通過機(jī)械解離器官通過70-μ m孔徑尼龍濾器獲得單個(gè)脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。脾細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞用IOmM KHCO3,0. ImM EDTA在4°C裂解2分鐘。脾細(xì)胞置于完全 IMDM-10 培養(yǎng)基中，即補(bǔ)加 10% FCS (HyClone，USA)和 pen/str印/glu (GibcoBRL， USA)的 Iscove，s Modified Dulbecco' s Medium (GibcoBRL, USA)。淋巴結(jié)細(xì)胞置于補(bǔ)加 5%正常小鼠血清(Harlan，USA)和pen/str印/glu的完全I(xiàn)MDM-5培養(yǎng)基中。PorA肽和蛋白質(zhì)如所述制備的具有12個(gè)氨基酸重疊的分別跨越整個(gè)Pl. 7-2，4和Pl. 5-2,10蛋白的重疊合成18聚體肽通過smart pooling集合成16個(gè)集合(A至H及1至8)，即由此每個(gè)合成肽在兩個(gè)不同的8肽集合中表現(xiàn)。重組？1.7-2，4和？1.5-2，10蛋白(以下稱為 rP1.7-2，4和rP1.5-2，10)使用來自所提到的腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76的等基因菌株的 PorA基因通過現(xiàn)有技術(shù)已知的重組蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)獲得。增殖測(cè)定對(duì)于P. 69 Pertactin特異性人增殖測(cè)定，IO5PBMC在不存在或者存在1或10 μ M 相關(guān)肽條件下在完全培養(yǎng)基中以150 μ 1/孔在37°C 5 % CO2氣氛下保溫。對(duì)于PorA特異性人增殖測(cè)定，IO5PBMC或^104ΜΒ71. 5T細(xì)胞在不存在或者存在指示濃度的相關(guān)肽、肽集合或 PorA rPl. 7-2,4, Pl. 5-2,10，Pl. 7，16，Pl. 19，15 或 Pl. 22，14 條件下在完全培養(yǎng)基中以 150μ 1/孔在37°C 5% CO2氣氛下保溫。在第4天，取100-μ 1體積進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定。然后在收獲細(xì)胞之前18小時(shí)將0.5 μ Ci (18. 5kBq) 3H-胸苷(Amersham, USA)加入培養(yǎng)物中。 CPM的確定和結(jié)果的計(jì)算如針對(duì)免疫脾細(xì)胞的增殖測(cè)定所述進(jìn)行。結(jié)果表示為來自至少一式三份孔的SI 士SD。區(qū)域4特異性T細(xì)胞系MB71. 5通過在完整培養(yǎng)基中用0. 5 μ g/ml rPl. 5-2，1重復(fù)體外再刺激MB71 PBMC而產(chǎn)生。對(duì)于小鼠增殖測(cè)定，來自Pl. 7-2，4或P. 15_2，10免疫的Balb/c或C57Black/6小鼠的脾細(xì)胞在96孔圓底平板(Greiner)中在存在rPorA或18聚體寡肽或者僅培養(yǎng)基的條件下以1. 5x10s細(xì)胞/150 μ 1在IMDM-IO中培養(yǎng)。在第4天，將0. 5 μ Ci (18. 5kBq)3H-胸苷 (Amersham,USA)加入孔中，細(xì)胞再培養(yǎng)18小時(shí)。收獲細(xì)胞，3H-胸苷摻入用Wallac 1205 β 平板液體閃爍計(jì)數(shù)器確定為每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。結(jié)果表示為來自一式三份孔的刺激指數(shù) (Si) 士SD，計(jì)算為在抗原存在下培養(yǎng)物的CPM除以在僅培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)物的CPM的商。結(jié)果II :MHC II 型 jigandome在基本培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)表汰及mN*1^同位素標(biāo)記的效率如實(shí)驗(yàn)方法II的方法D所述產(chǎn)生的14N-和15N-標(biāo)記的全細(xì)胞百日咳博德特氏菌制備物的膜復(fù)合物中的細(xì)菌蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離并用Western印跡分析。絲狀血凝素 (Filamentous Hemagglutinin)、P. 69 Pertactin、百日咳毒素亞基 1 禾口 4 以及 Fimbriae 2以相似比率在wN-和15N-標(biāo)記的制備物中表達(dá)，提示在重同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基中的正常蛋白質(zhì)表達(dá)。提取自wN-和15N-P. 69 Pertactin條帶的蛋白質(zhì)的LCMS分析證實(shí)P. 69 Pertactin蛋白的重形式相對(duì)于其輕形式的1.2%的質(zhì)量增量。另外，得自wN-和15N-P. 69Pertactin的胰蛋白酶消化產(chǎn)物的MS/MS譜揭示典型的片段化為重和輕氨基酸，證實(shí)在遍及P. 69 Pertactin蛋白的全序列上的成功的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。類似地，對(duì)如實(shí)驗(yàn)方法II的方法E所述的rP. 69 Pertactin以及方法F所述的衍生自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV制備物也評(píng)價(jià)了蛋白質(zhì)表達(dá)及wN-和15N-標(biāo)記效率。對(duì)于 rP. 69 Pertactin和PorA制備物分別觀測(cè)到了蛋白質(zhì)完整性和遍及全蛋白的成功標(biāo)記。實(shí)飧她D Φ HLA-DR2-結(jié)合的百日晐t軎德特氏菌表擬的鑒另I丨病原體相關(guān)的HLA-DR配體從如實(shí)驗(yàn)方法II所述用14N-和1N-標(biāo)記的全細(xì)胞百日咳博德特氏菌制備物的1 1(0D/0D)混合物脈沖的HLA-DR2純合MDDC提取。用數(shù)學(xué)檢索算法在LCMS譜中檢索代表候選百日咳博德特氏菌MHC II型配體的質(zhì)譜雙峰。圖13(上圖)示出在m/z 788. 94Da和797. 42Da檢測(cè)的匹配同位素簇的例子，代表含有17個(gè)氮原子的候選表位(圖13，插圖)。表位的MS/MS譜(圖13，下圖)揭示出部分序列，鑒別了衍生自百日咳博德特氏菌的推定周質(zhì)蛋白(登錄號(hào)CAE43606)的表位。6個(gè)其它譜雙峰被測(cè)序， 代表衍生自百日咳博德特氏菌的4個(gè)不同蛋白質(zhì)的4個(gè)表位的長度變體(表4)。所述表位用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)半量化。實(shí)驗(yàn)方法E中HLA-DR-結(jié)合的百日咳博德特氏菌rP. 69 Pertactin表位的鑒別
病原體相關(guān)的HLA-DR配體從如實(shí)驗(yàn)方法II所述用wN-和15N-標(biāo)記的rP. 69 PertactinWl 1 (0D/0D)混合物脈沖的HLA-DR雜合的MDDC的集合批次提取。用數(shù)學(xué)檢索算法在LCMS譜中檢索代表候選P. 69 Pertactin MHC II型配體的質(zhì)譜雙峰。圖14(上圖)示出在m/z 770. 43Da和780. 39Da檢測(cè)的匹配同位素簇的譜雙峰的例子，代表含有20 個(gè)氮原子的候選表位(圖14，插圖)。表位的MS/MS譜(圖14，下圖)揭示出P. 69 Prnl (登錄號(hào)AJOl 1091)的匹配肽序列LRDTNVTAVPASGAPA的b_型離子系列。總共5個(gè)譜雙峰被測(cè)序，它們代表來自百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin的2個(gè)表位區(qū)域的長度變體(表5)。 所述表位用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)半量化。通過用代表表位的合成標(biāo)準(zhǔn)物體外再刺激來自一組健康成年供體的PBMC，我們研究了所述兩個(gè)百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin表位區(qū)域在人中的免疫原性。對(duì)于包含 ASTLffYAESNALSKRLG序列的第二個(gè)表位區(qū)域，在至少2個(gè)供體中觀測(cè)到免疫識(shí)別(表5)，提示這個(gè)表位是功能性人表位。實(shí)驗(yàn)方法F中HLA-DRl和2結(jié)合的腦膜炎奈瑟氏球菌表位的鑒別病原體相關(guān)的HLA-DR配體從如實(shí)驗(yàn)方法II所述用標(biāo)記的OMV制備物脈沖的 4個(gè)MDDC批次提取，從而代表下述的HLA-DR等位基因和PorA血清亞型組合HLA_DR1/ Pl. 7-2，4，HLA-DR2/P1. 7-2,4, HLA-DR1/P1. 5-2，10，和 HLA-DR2/P1. 5-2, IO0 用數(shù)學(xué)檢索算法在LCMS譜中檢索代表衍生自Pl. 7-2，4或Pl. 5-2,10的候選MHC II型配體的質(zhì)譜雙峰。圖15示出譜雙峰的兩個(gè)例子，在HLA-DR1/P1. 7-2，41igandome中，一對(duì)[MH2]2+離子在 m/z 1065. OlDa 和 1076. 47Da 被檢測(cè)到(圖 A)，在 HLA-DR2/P1. 5-2, IOligandome 中，一對(duì)[MH3]3+離子在m/z 701. OlDa和708. 67Da被檢測(cè)到(圖B)。這兩個(gè)質(zhì)譜雙峰內(nèi)的質(zhì)量增量表示在每個(gè)候選表位中存在M個(gè)氮原子。在m/z 1065. OlDa的[MH2]2+ 離子和在m/z 701. OlDa的[MH3]3+離子的分別MS/MS測(cè)序揭示譜匹配PorA同系物表位 SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1. 7-2，4，圖 C)和 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1. 5-2，10，圖 D)。在實(shí)驗(yàn)方法II方法F所述制備的4個(gè)Iigandome中，總共38個(gè)譜雙峰被鑒定為是來自腦膜
38炎奈瑟氏球菌PorA的8個(gè)表位區(qū)域的長度變體、血清亞型變體和/或HLA-DR等位基因特異性配體(表6)。用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)半量化所述表位。觀個(gè)天然存在的表位是新的PorA HLA-DR 配體，10個(gè)是早先描述的，定位于4個(gè)已知表位區(qū)域(區(qū)域1、3、7和8)。因此，公開了 4個(gè)新的天然存在的PorA表位區(qū)域(區(qū)域2、4、5和6)，其中區(qū)域2已被報(bào)道刺激人⑶4+T細(xì)胞(Wiertz et al. 1992)。在所有4個(gè)研究的Iigandome中，區(qū)域8表位是豐富表達(dá)的。 HLA-DR1/P1. 7-2,41igandome中的質(zhì)譜雙峰的MS測(cè)序揭示這個(gè)表位區(qū)域的2個(gè)變體，代表總區(qū)域81igandome的大約1 %，含有IGNYTQINAASVG核心序列，但是C末端延長+114Da或 +270Da,不與PorA中這個(gè)高度保守區(qū)域中的表位的天然C末端側(cè)翼殘基匹配(圖16)。這些變體的wN-和15N-標(biāo)記的對(duì)應(yīng)物的及為此目的制備的合成標(biāo)準(zhǔn)物的LCMS特征揭示所述延長與應(yīng)該產(chǎn)生自分子內(nèi)剪接事件的分別具有氨基酸GG(或N)或者GGR(或NR)的核心序列的非正常型延長(non-orthodox elongation)匹配。MHC II型配體的剪接未有描述。作為MHC II型配體的PTM的這個(gè)首次證實(shí)的剪接是使用穩(wěn)定同位素結(jié)合專門免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和LCMS的直接結(jié)果。因此，對(duì)于MHC II型配體的PTM現(xiàn)象的未知，與對(duì)于MHC I型配體一樣，對(duì)我們有關(guān)T細(xì)胞表位的知識(shí)是一個(gè)現(xiàn)實(shí)的威脅，并且需要上述方法來解決。作為如實(shí)驗(yàn)方法中的方法F所述獲得的4個(gè)ligandome中的質(zhì)譜雙峰的全面LCMS 分析的另一個(gè)結(jié)果，鑒別了 M個(gè)額外的不是衍生自PorA蛋白的表位?？傮w上，所述表位代表來自與腦膜炎奈瑟氏球菌OMV制備物相關(guān)的13個(gè)不同蛋白質(zhì)的18個(gè)表位(的長度變體)(表7)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)揭示了作為潛在T細(xì)胞靶的表位區(qū)域及它們各自的前體蛋白質(zhì)。用在線2維平臺(tái)LCMS技術(shù)講行MHC ligandome的高通量分析為促進(jìn)MHC ligandome的高通量分析，衍生自方法F中描述的OMV脈沖的MDDC批次的相同MHC II型肽樣品的一半用于在線2維平臺(tái)LCMS技術(shù)。除了早先用平臺(tái)LCMS分析離線制備的方法F樣品的SCX級(jí)分鑒別的表位之外，在線2-D應(yīng)用以快速及節(jié)省樣品方式獲得19個(gè)額外的先前未鑒別的源自腦膜炎奈瑟氏球菌PorA和非PorA蛋白的肽表位(表 8)。MHC ligandome是免疫原性和保護(hù)作用的(共)相關(guān)物((co) correlates)因此，這個(gè)類型的分析不僅揭示了抗原的潛在CD4T細(xì)胞表位區(qū)域的多樣性，而且提供了對(duì)它們的相對(duì)豐度(其調(diào)節(jié)免疫原性和T細(xì)胞應(yīng)答的質(zhì)量和最終的PTM)的深入了解。重要的是，如本實(shí)施例所示，所述實(shí)驗(yàn)設(shè)置與同位素標(biāo)記和專門LCMS技術(shù)一起促進(jìn)了對(duì)病原體抗原變異和人HLA-DR多態(tài)性在T細(xì)胞免疫性中的作用的研究。多種已知腦膜炎奈瑟氏球菌PorA血清亞型的序列對(duì)比揭示微多態(tài)性在表6所述天然存在區(qū)域中的三個(gè)中發(fā)生(區(qū)域1、4和幻。我們用來自健康成年供體的PBMC和來自免疫 Balb/c小鼠和C57black/6小鼠的脾細(xì)胞研究了新的微多態(tài)性區(qū)域4的功能作用。首先，我們?cè)儐柾ㄟ^分別用Pl. 7-2，4或Pl. 5-2，10重復(fù)體外再刺激來自各種供體的PBMC 是否會(huì)產(chǎn)生分別特異于SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK (P1. 7_2，4變體，以下稱為D/I)或者 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1. 5-2，10變體，以下稱為E/A)的T細(xì)胞系。從一個(gè)供體產(chǎn)生了 一個(gè)特異性T細(xì)胞系(MB-71. 5)，其識(shí)別用代表Pl. 5-2，10表位變體的重疊合成18聚體肽 PEFSGFSGSVQFVPAQNS (代碼 SO11-24)和 SGSVQFVPAQNSKSAYTP (代碼 SOl 1-25)而非代表Pl. 7-2，4對(duì)應(yīng)物的重疊合成18聚體肽PDFSGFSGSVQFVPIQNS (代碼S004-29)和 SGSVQFVPIQNSKSAYTP (代碼S004-30)脈沖的自體抗原呈遞細(xì)胞(圖17A)。當(dāng)用經(jīng)Pl. 5_2，10蛋白脈沖的自體抗原呈遞細(xì)胞刺激時(shí)，MB-71. 5 T細(xì)胞也增殖(圖17B)或者產(chǎn)生細(xì)胞因子(未示出)。從5種其它PorA變體，僅Pl. 5-1，2-2 (E/A)和Pl. 22，14 (D/A)變體再刺激 MB-71. 5 T細(xì)胞，而PL 7-2，4(D/I)，Pl. 7，16(E/I)或PL 19，15(D/I)不能，表明天然加工的 “區(qū)域4”表位的C-末端半部分中的丙氨酸㈧殘基對(duì)于T細(xì)胞識(shí)別是關(guān)鍵的。另外，在任何所測(cè)試個(gè)體(n = 5)中未能檢測(cè)到D/I或A/I特異性T細(xì)胞。在臨床前動(dòng)物研究中，我們有類似觀測(cè)來自用Pl. 5-1，2-2(—種類似于Pl. 5-2，10的E/A ‘區(qū)域4’變體)免疫的 Balb/c小鼠的脾細(xì)胞應(yīng)答Pl. 5-2，10 ‘區(qū)域4，肽SOl 1-24 ^P S011-25，但不應(yīng)答Pl. 7-2,4 特異性區(qū)域4變體S00449和S004-30(數(shù)據(jù)未示出)。用Pl. 7_2，4免疫的小鼠不產(chǎn)生針對(duì)區(qū)域4的(可測(cè)量的)T細(xì)胞應(yīng)答(表9)。另外，衍生自用Pl. 5-2，10免疫的Balb/c小鼠的T細(xì)胞雜交瘤在6種野生型PorA變體存在下具有與人MB-71. 5 T細(xì)胞相同的反應(yīng)模式(數(shù)據(jù)未示出)。另外在C57black/6小鼠中，Pl. 7_2，4未能誘導(dǎo)針對(duì)“區(qū)域4”的(可測(cè)量的)T細(xì)胞應(yīng)答，而P1.5-l，2-2 ‘區(qū)域4’是免疫原性的。兩種PorA同樣能引起抗由專門LCMS技術(shù)鑒別的另一個(gè)表位區(qū)域“區(qū)域6”的T細(xì)胞應(yīng)答，說明Pl. 7-2，4不是完全不能作為T細(xì)胞抗原(表9)。Pl. 7-2，4在人中及在小鼠中誘導(dǎo)殺細(xì)菌抗體的能力差(參考文獻(xiàn)15和16)是疫苗開發(fā)中的一個(gè)問題。在Balb/c小鼠中，抗“區(qū)域4”脾細(xì)胞增殖幅度在個(gè)體小鼠中與抗Pl. 5-1,2-2的殺細(xì)菌效價(jià)水平相關(guān)(R = O, 78)?？傊?，這些免疫原性數(shù)據(jù)表明“區(qū)域4”是PorA的重要功能性T細(xì)胞表位。討論MHCI 型和 II 型 Iigandome第一次，如平臺(tái)LCMS技術(shù)代表的新組合方法導(dǎo)致改良的LCMS裝置，使得可以對(duì)以前用標(biāo)準(zhǔn)LCMS技術(shù)僅產(chǎn)生有限數(shù)目表位的MHC I型和II型肽樣品進(jìn)行表位挖掘。另外， 通過平臺(tái)技術(shù)確定了特異性表位特征如長度和長度變化、豐度和PTM。與使用相關(guān)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和同位素標(biāo)記一起，平臺(tái)LCMS技術(shù)能夠無疑義地以空前高水平的精確度和靈敏性鑒別病原體相關(guān)的MHC I型和II型ligandome。平臺(tái)LCMS技術(shù)與先前使用的(標(biāo)準(zhǔn))LCMS方法在MHC I型和II型ligandome分析方面通過允許更低的流速、更高的柱頭壓以及組合所需的更長和更可靠的液體噴射方法而區(qū)分?？傊?，這增強(qiáng)了在MS/MS循環(huán)時(shí)離子的強(qiáng)度和停留時(shí)間，因此增強(qiáng)了 LCMS/MS的鑒別性能到達(dá)這樣的水平，即優(yōu)勢(shì)和次優(yōu)勢(shì)肽種類可以被可靠地鑒定。表1 :MV感染W(wǎng)H細(xì)胞后用標(biāo)準(zhǔn)LCMS鑒別病毒HLA-A2相關(guān)表位
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權(quán)利要求
1.一種分析樣品的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元以及質(zhì)譜儀，其中所述泵裝置被構(gòu)造并設(shè)置成用于為分析柱提供納級(jí)流，其中所述分析柱包含進(jìn)行液相層析的靜止相及其中所述分析柱具有低于70 μ m的內(nèi)徑，其中電噴射離子化單元包含在樣品流路中位于所述分析柱下游的電噴射發(fā)射器，所述發(fā)射器內(nèi)徑低于70 μ m， 其中所述質(zhì)譜儀位于發(fā)射器的下游，其中所述發(fā)射器包含錐形末端以噴射樣品，所述錐形末端具有傳導(dǎo)性第一涂層以及保護(hù)性第二涂層。
2.權(quán)利要求1的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述分析柱和發(fā)射器的內(nèi)徑低于55μ m， 優(yōu)選內(nèi)徑為至多^ym。
3.權(quán)利要求1或2的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述發(fā)射器與所述分析柱整體形成。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述保護(hù)性第二涂層包含碳，優(yōu)選傳導(dǎo)性碳膠合物。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述保護(hù)性第二涂層是硅合金或者導(dǎo)電聚合物。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中發(fā)射器的錐形末端的內(nèi)徑低于 20 μ m，優(yōu)選低于10 μ m。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述第一涂層是貴金屬，如金。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述發(fā)射器包含具有第一和第二涂層的熔融二氧化硅。
9.用于納級(jí)流的發(fā)射器，其包含接受樣品如從液相層析柱接受樣品的上游末端以及電噴射樣品的第二錐形末端，所述發(fā)射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發(fā)射器由熔融二氧化硅形成，內(nèi)徑至多為55 μ m，其中發(fā)射器的錐形末端具有金傳導(dǎo)性第一涂層和第二傳導(dǎo)性碳基涂層。
10.權(quán)利要求9的發(fā)射器，其中所述發(fā)射器接近錐形末端的內(nèi)徑至多為10μ m。
11.分析樣品的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元以及質(zhì)譜儀，其中所述泵裝置被構(gòu)造并設(shè)置成用于為所述分析柱提供納級(jí)流，其中所述分析柱包含進(jìn)行液相層析的靜止相及其中所述分析柱內(nèi)徑低于70 μ m，其中所述電噴射離子化單元包含在樣品流路中位于所述分析柱下游的電噴射發(fā)射器，所述發(fā)射器內(nèi)徑低于70 μ m， 其中所述質(zhì)譜儀位于發(fā)射器的下游，所述液相層析-質(zhì)譜儀裝置包含至少二維層析，其中第一維包含至少強(qiáng)陽離子交換(SCX)，第二維包含反相層析，其中洗脫溶劑通常是無鹽溶液。
12.權(quán)利要求11的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述無鹽溶液包含乙酸。
13.權(quán)利要求11或12的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述無鹽溶液包含甲酸。
14.分析樣品的液相層析-質(zhì)譜儀(LCMQ裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元和質(zhì)譜儀，其中所述泵裝置被構(gòu)造并設(shè)置成用于為分析柱提供納級(jí)流，其中所述分析柱由管狀元件形成，所述管狀元件具有內(nèi)徑低于70 μ m的腔，其中進(jìn)行液相層析的靜止相容納在所述腔內(nèi)，其中電噴射離子化單元包含在樣品流路中位于所述分析柱下游的電噴射發(fā)射器，所述發(fā)射器內(nèi)徑低于70 μ m，其中質(zhì)譜儀位于發(fā)射器下游，其中LCMS裝置包含連接 LCMS裝置的至少兩個(gè)管狀元件的連接元件，所述管狀元件具有外徑和具有內(nèi)徑的腔，其中所述連接元件包含至少兩個(gè)卡套和至少兩個(gè)接納腔以接受卡套，所述卡套具有具有適合接受管材部件的內(nèi)徑的內(nèi)腔，并且在所述接納空間中的兩個(gè)卡套對(duì)準(zhǔn)所述管狀元件，其中所述連接元件包含連接和對(duì)準(zhǔn)所述卡套內(nèi)腔的內(nèi)體積，所述內(nèi)體積具有的內(nèi)徑適于接受所述管材部件的末端并且在連接狀態(tài)下允許管材部件末端與所述內(nèi)體積對(duì)接。
15.權(quán)利要求14或者權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)組合權(quán)利要求7的液相層析-質(zhì)譜儀裝置， 其中所述連接元件包含鎖閉系統(tǒng)以鎖閉接納腔中的卡套。
16.權(quán)利要求14或15或者權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)組合權(quán)利要求14的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中內(nèi)體積和卡套內(nèi)腔的內(nèi)徑通常等于管材部件的外徑。
17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)或者權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)組合權(quán)利要求14的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中所述連接元件是三向連接元件。
18.權(quán)利要求17的液相層析-質(zhì)譜儀裝置，其中三向連接元件的第三個(gè)連接形成內(nèi)體積的出口。
19.生產(chǎn)液相層析柱的方法，包括提供具有內(nèi)徑至多為55μ m的內(nèi)腔、長度為至少45cm 的柱，在該柱的一端熔成玻璃料并將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中在填充期間振動(dòng)所述柱。
20.生產(chǎn)液相層析柱的方法，包括提供具有內(nèi)徑至多為55μ m的內(nèi)腔、長度為至少45cm 的柱，在該柱的一端熔成玻璃料并將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中所述液相層析固相材料是在低粘度溶劑中的漿液。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述低粘度溶劑是丙酮。
22.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述低粘度溶劑的粘度至多為0.35cP。
23.權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)徑至多為35μ m。
24.權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)的方法，其中所述柱是熔融二氧化硅柱。
25.權(quán)利要求1-8或者11-18任一項(xiàng)的裝置在鑒別表位的方法中的應(yīng)用。
26.鑒別表位的方法，其中所述方法包括如下步驟a)制備包含MHCI型和MHC II型表位至少之一的樣品，其中所述表位已經(jīng)被加工并由抗原呈遞細(xì)胞呈遞；及b)在權(quán)利要求1-8或者11-18任一項(xiàng)的裝置中分析在步驟a)中獲得的樣品以鑒定表位。
27.產(chǎn)生包含權(quán)利要求25或沈中鑒別的表位的組合物的方法，其中所述方法包括化學(xué)合成及重組表達(dá)包含所述表位的分子中的至少一種。
28.通過權(quán)利要求25的應(yīng)用或者權(quán)利要求沈的方法可獲得的表位。
29.權(quán)利要求25或沈中所述的表位或者包含所述表位的組合物在生產(chǎn)預(yù)防和/或治療由攜帶這個(gè)表位的病原體所致疾病的疫苗中的應(yīng)用。
30.權(quán)利要求25或沈中所述的表位或者包含所述表位的組合物在評(píng)估哺乳動(dòng)物免疫狀況中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及改良的LCMS技術(shù)及其在選擇性鑒別和鑒定免疫原性病原體相關(guān)表位的方法中的應(yīng)用以及在疫苗開發(fā)中的應(yīng)用。一種橋連T細(xì)胞表位知識(shí)缺口的方式是應(yīng)用新的平臺(tái)技術(shù)“免疫蛋白質(zhì)組學(xué)”，以通過提取的肽樣品的納級(jí)質(zhì)譜分析直接評(píng)估在抗原呈遞細(xì)胞表面的表位展示。這是唯一的方法學(xué)，其可提供對(duì)于表位特征的無偏倚的見解，如源自病原體衍生的蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位的精確的分子性質(zhì)、多樣性、豐度、動(dòng)力學(xué)及PTM。因此，這個(gè)平臺(tái)技術(shù)和免疫蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)成為疫苗學(xué)的固有一部分。
文檔編號(hào)G01N30/56GK102216768SQ200980144627
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者A·P·J·M·德容, C·A·C·M·范埃爾斯, E·C·瑟圖特, H·D·邁林 申請(qǐng)人:由衛(wèi)生福利和體育大臣代表的荷蘭王國