專利名稱：電壓門控的金屬增強(qiáng)熒光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及金屬增強(qiáng)熒光(MEF)，更具體來說涉及通過使直流電通 過低電阻金屬互連粒子來“打開和關(guān)閉”發(fā)射，以操縱MEF發(fā)射的能力。相關(guān)技術(shù)多年來，已經(jīng)從發(fā)展對(duì)金屬增強(qiáng)熒光(MEF)1—3現(xiàn)象的基本理解以及其次將熒 光團(tuán)的增強(qiáng)的光物理性質(zhì)應(yīng)用于生物學(xué)應(yīng)用4的觀點(diǎn)上，對(duì)熒光團(tuán)接近等離子體激元 (plasmon)共振粒子的效應(yīng)進(jìn)行了報(bào)道。在所有這些報(bào)道中，通過緊鄰熒光團(tuán)偶極子在近 場(chǎng)誘導(dǎo)了表面等離子體激元，表面等離子體激元又輻射耦合量子，導(dǎo)致熒光放大，正如 圖4上部的圖所示。耦合熒光在很大程度上與不存在金屬情況下觀察到的自由空間熒光 非常類似，例外之處在于輻射壽命明顯較短，這據(jù)認(rèn)為是由等離子體激元衰變?chǔ)呛婉詈?發(fā)射的角度依賴性發(fā)射5造成的。因?yàn)槟壳罢趯?duì)金屬-熒光團(tuán)相互作用及其在生物學(xué)和臨床診斷學(xué)中的應(yīng)用正 在進(jìn)行深入研究，因此發(fā)現(xiàn)MEF的其他可應(yīng)用的用途、例如能夠(根據(jù)需要)打開或關(guān) 閉MEF將是有利的，并可用于諸如芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)和光子檢測(cè)器的技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過將直流電導(dǎo)入并使其通過具有低電阻的“恰好連續(xù)”的金屬薄 膜來“打開和關(guān)閉”發(fā)射，以操縱MEF發(fā)射的能力。一方面，本發(fā)明涉及用于操縱來自金屬增強(qiáng)熒光系統(tǒng)的發(fā)射的方法，所述方法 包括a)在基材上提供導(dǎo)電金屬表面，其中所述導(dǎo)電金屬表面包含在所述基材上恰好 連續(xù)的薄膜，并且其中所述基材包括玻璃、石英、銅或聚合材料；b)將分子定位于所述導(dǎo)電金屬表面附近，其中所述分子能夠發(fā)射可檢測(cè)的電磁 能量，并且其中所述分子在距所述導(dǎo)電金屬表面以增強(qiáng)發(fā)射的可檢測(cè)電磁能量的強(qiáng)度的 距離處定位；c)施加電磁能量，所述電磁能量的波長足以激發(fā)所述分子并引起可檢測(cè)的電磁 能量發(fā)射；以及d)將所述導(dǎo)電金屬表面與電壓源例如蓄電池、太陽能板、氫燃料電池或風(fēng)源以 及可致動(dòng)開關(guān)相連，其中所述開關(guān)打開允許直流電通過所述導(dǎo)電金屬表面輸送，這減小 或停止可檢測(cè)的電磁能量發(fā)射，并且所述開關(guān)關(guān)閉為可檢測(cè)的電磁能量發(fā)射提供可檢測(cè) 的電磁能量發(fā)射。
上面描述的方法可用于多種熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，包括但不限于微波加速的金屬增 強(qiáng)熒光(MAMEF)、微波觸發(fā)的金屬增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(MTMEC)或微波加速的表面增強(qiáng)拉 曼散射(MASERS)。上面描述的方法可用于多種熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，包括但不限于微波加 速的金屬增強(qiáng)熒光(MAMEF)和微波加速的表面增強(qiáng)拉曼散射(MASERS)。此外，所述 系統(tǒng)可以用于許多不同的分析中，包括但不限于免疫分析、雜交分析、共振能量轉(zhuǎn)移分 析、基于偏振/各向異性的分析、基于生物發(fā)光的分析、基于化學(xué)發(fā)光的分析、基于發(fā) 光的分析或酶聯(lián)免疫吸附分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子包含當(dāng)與從UV或IR范圍內(nèi)的輻射接觸時(shí)有能力發(fā)射 熒光的熒光組分。優(yōu)選，熒光組分是不干擾分析系統(tǒng)中任何化學(xué)反應(yīng)的分子。優(yōu)選，導(dǎo)電金屬表面采取“恰好連續(xù)”表面的形式，鑒于下述事實(shí)，它與連續(xù) 導(dǎo)電表面和不連續(xù)表面不同即“恰好連續(xù)”表面存在相連的金屬材料或粒子網(wǎng)，所述 金屬材料或粒子包括但不限于納米結(jié)構(gòu)、島、多孔金屬基質(zhì)、膠體或金屬薄膜，所述薄 膜厚度從約12到17nm并已被退火以提供具有粒子特性的破裂薄膜。金屬材料可以包括 任何形式的導(dǎo)電金屬，包括銀、金、鉬、鋁、銠和銅，并更優(yōu)選金屬材料是銀或銅。能夠發(fā)射可檢測(cè)的電磁能量的分子包括但不限于熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)。能 夠發(fā)射熒光的化合物可以是固有熒光團(tuán)或與外來熒光團(tuán)結(jié)合的化合物。另一方面，本發(fā)明涉及用于分析中的裝置系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含a)基材上的導(dǎo)電金屬表面，其中所述導(dǎo)電金屬表面在所述基材上是幾乎連續(xù)的 并表現(xiàn)出低電阻，并且其中所述基材包括玻璃、石英或聚合材料；b)位于導(dǎo)電金屬表面上或其附近的分子，其中所述分子能夠在激發(fā)時(shí)發(fā)射電磁 能量；c)用于激發(fā)所述分子并引起電磁能量發(fā)射的電磁能量源；d)與所述導(dǎo)電金屬表面相連、具有打開和關(guān)閉能力的直流電源，其中直流電由 蓄電池、太陽能板、氫燃料電池或風(fēng)源產(chǎn)生；以及e)用于測(cè)量發(fā)射電磁能量的檢測(cè)器和/或用于測(cè)量通過所述導(dǎo)電金屬表面的直 流電的檢測(cè)器。另一方面，本發(fā)明涉及為熒光信號(hào)在打開或關(guān)閉模式之間提供切換的、可用于 檢測(cè)裝置中的方法和系統(tǒng)，其中強(qiáng)度的變化是定量的，并與發(fā)射分子的量相關(guān)。從隨后的公開內(nèi)容和權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將更充分地顯示。


圖1顯示了在半連續(xù)的SiF上隨著施加的“開”和“關(guān)”電壓(2.1V，0.3A)， FITC的時(shí)間依賴性熒光發(fā)射(在544nm測(cè)量)(上圖)。上圖的插入圖顯示了半連續(xù)SiF 薄膜的SEM圖像。下圖-SiF上的FITC隨著2.1V，0.3A門控的開和關(guān)的熒光光譜。下 圖的插入圖顯示了實(shí)驗(yàn)設(shè)置的示意圖和通過473nm陷波濾波器獲得的照片。圖2顯示了在幾乎連續(xù)的SiF上隨著施加的電壓/電流門控的“開”和 “關(guān)”(上圖)，以及在不連續(xù)的SiF上隨著施加的電壓/電流門控的“開”和“關(guān)”(下 圖)，F(xiàn)ITC的時(shí)間依賴性熒光發(fā)射(在544nm測(cè)量)。插入圖顯示了相應(yīng)SiF的SEM圖像。圖3顯示了 FITC隨著施加的電壓/電流門控的“開”和“關(guān)”的發(fā)射，其中 當(dāng)電流關(guān)閉時(shí)可檢測(cè)到發(fā)射的強(qiáng)度。圖4顯示了目前對(duì)金屬增強(qiáng)熒光(上圖)、用施加的電壓/電流擾動(dòng)的金屬增強(qiáng) 熒光(下圖)進(jìn)行說明的圖示。F-熒光團(tuán)，MEF-金屬增強(qiáng)熒光，Ag-銀納粒。圖5顯示了平均SiF電阻對(duì)不同SiF制備時(shí)間的圖(上圖)。對(duì)于幾乎連續(xù)的、 -7Q的薄膜來說，隨著電壓/電流門控的“開”和“關(guān)”，來自SiF的時(shí)間依賴性背景 發(fā)射(在544nm測(cè)量)(下圖)。圖6顯示了 SiF隨著施加的電壓/電流而變的吸收光譜(上圖)。加熱到不同溫 度的SiF的吸收光譜(下圖)。圖7顯示了施加電壓/電流門控的“開”時(shí)，在幾乎連續(xù)的SiF(7⑴上FITC 的熒光光譜(上圖)。比色杯中的FITC隨著溫度而變的熒光光譜(下圖)。圖8顯示了隨著施加的電壓/電流門控的“開”和“關(guān)”，摻入到旋涂在半連 續(xù)SiF上的0.25% PVA中的FITC的時(shí)間依賴性熒光發(fā)射(在524nm測(cè)量)(上圖)。隨 著施加的電壓/電流門控的“開”和“關(guān)”，SiF上的FITC的熒光光譜(下圖)。發(fā)明詳述在本發(fā)明中，第一次證明了電流對(duì)表面等離子體激元放大熒光信號(hào)的能力的影 響，即對(duì)金屬增強(qiáng)熒光(MEF)的影響。跨過低電阻的銀島薄膜(SiF)施加的直流電擾亂 了緊鄰熒光團(tuán)的熒光增強(qiáng)。對(duì)于給定的施加電流來說，“恰好連續(xù)”的低電阻薄膜中的 表面等離子體激元可用于熒光團(tuán)偶極子耦合的很少，因此增強(qiáng)的熒光隨著所施加電流的 變化被門控。對(duì)于較厚的低電阻薄膜來說，這時(shí)在MEF被較低程度擾亂的金屬中存在足 夠的載荷子，容易地在表面上形成由緊鄰偶極子誘導(dǎo)的表面等離子體激元。本文中使用的術(shù)語“恰好連續(xù)的薄膜”的意義是指具有從約2到200歐姆、更 優(yōu)選從約5到約60歐姆、最優(yōu)選從約7到25歐姆的電阻的導(dǎo)電金屬薄膜，其中與導(dǎo)電金 屬薄膜交通連接的直流電與沒有接通直流電的薄膜相比，導(dǎo)致由鄰近的熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán) 或發(fā)光團(tuán)發(fā)出的電磁發(fā)射強(qiáng)度的降低。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以用于眾多的系統(tǒng)和方法中，包括在下列專利申 請(qǐng)中描述的系統(tǒng)和方法題為“使用金屬增強(qiáng)熒光用于病原體檢測(cè)的高靈敏度分 析”(HIGH-SENSITIVITY ASSAYS FORPATHOGEN DETECTION USING METAL ENHANCEDFLUORESCENCE)的美國專利申請(qǐng) No.US 10/536,502 ；題為“基于金 屬增強(qiáng)熒光的傳感方法 ”(METAL-ENHANCEDFLUORESCENCE-BASED SENSING METHODS)的美國專利申請(qǐng)No.ll/917,804;題為“來自塑料基材的金屬增強(qiáng)熒 光”(METAL-ENHANCED FLUORESCENCE FROM PLASTICSUBSTRATES)的美國 專利申請(qǐng)No. 11/718,560 ；題為“微波加速的分析”(MICROWAVE ACCELERATED ASSAYS)的美國專利申請(qǐng)No.ll/719,731 ；題為“微波加速的等離子體光子 學(xué)”(MICROWAVEACCELERATED PLASMONICS)的美國專利申請(qǐng) No. 11/695,397 ； 題為“熒光微波顯微術(shù)”(FLUORESCENCE MICROWAVEMICROSCOPY)的國際專利 申請(qǐng)NO.PCT/US08/65801 ；題為“微波聚焦的化學(xué)發(fā)光”(MICROWAVE FOCUSED CHEMILUMINESCENCE)的美國專利申請(qǐng)No. 12/036,402 ；題為“角度依賴性金屬增強(qiáng)熒光”(ANGULAR DEPENDENT METAL-ENHANCED FLUORESCENCE)的美 國專利申請(qǐng)11/750,119 ；題為“金屬增強(qiáng)的單線態(tài)氧產(chǎn)生”(METAL-ENHANCED SINGLET OXYGEN GENERATION)的美國專禾丨J 申請(qǐng) No. 12/020,571 ；題為“使 用來自貴重金屬納米結(jié)構(gòu)的等離子體散射的生物分析”(BIOASSAYS USING PLASMONIC SCATTERINGFROM NOBLE METAL NANOSTRUCTURES)的美國 專利申請(qǐng)No.11/917,075;和題為“用于極化成像和受體/配體量子化的納米結(jié) 構(gòu)” (NANOSTRUCTURES FOR POLARIZED IMAGING ANDRECEPTOR/LIGAND QUANTIZATION)的美國專利申請(qǐng)No.11/997,778，這些申請(qǐng)的內(nèi)容在此出于所有目的引 為參考。已知導(dǎo)電金屬表面能夠?qū)φ袷幣紭O子的熒光團(tuán)做出響應(yīng)，并改變作為固有輻射 衰變速率的發(fā)射速率和所發(fā)出的輻射的空間分布。理論家將這種效應(yīng)描述為是由于靠近 熒光團(tuán)的光子模式密度的變化所致。在大多數(shù)分光測(cè)定中，溶液或介質(zhì)對(duì)發(fā)射的和取樣 的輻射來說都是透明的。但是，對(duì)于自由空間條件來說存在幾種重要的例外。一個(gè)眾 所周知的例子是表面增強(qiáng)的拉曼散射(SERS)。已知金屬表面的存在能夠?qū)⒗盘?hào)增 加103到108倍，有報(bào)道甚至出現(xiàn)過1014-1016倍的更高增強(qiáng)。鄰近的金屬薄膜、島或粒 子的存在也能改變熒光團(tuán)的發(fā)射性質(zhì)。最熟知的效應(yīng)是熒光被鄰近金屬淬滅。在金屬表 面50 A范圍內(nèi)的熒光團(tuán)的發(fā)射幾乎被完全淬滅。這種效應(yīng)使用在用漸逝波激發(fā)的熒光顯 微術(shù)中。來自石英-水界面附近的細(xì)胞膜區(qū)域的發(fā)射被淬滅，允許選擇性觀察來自距固 體_液體界面更遠(yuǎn)的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的發(fā)射。除了淬滅之外，已知金屬表面或粒子能夠引起 熒光的顯著增加。引人注目的是，取決于距離和幾何形狀，金屬表面或粒子對(duì)于熒光團(tuán) 的熒光發(fā)射來說能夠產(chǎn)生幾千倍的增強(qiáng)倍數(shù)。在本文中可以互換使用的“熒光團(tuán)”和“熒光標(biāo)記物”，是指當(dāng)被某種波長 (激發(fā)波長)的輻射照射時(shí)能夠發(fā)出具有不同波長(發(fā)射波長)的電磁能量例如光的任何 物質(zhì)，并打算包含能夠與樣品中的目標(biāo)被分析物特異性相互作用或反應(yīng)以提供一種或多 種光信號(hào)的化學(xué)或生物化學(xué)分子或其片段。此外，熒光團(tuán)包括外來和固有熒光團(tuán)。外來 熒光團(tuán)是指與另一種物質(zhì)結(jié)合的熒光團(tuán)。固有熒光團(tuán)是指其自身是熒光團(tuán)的物質(zhì)。示例 性熒光團(tuán)包括但不限于在《分子探針目錄》(Molecular Probes Catalogue)中列出的熒光 團(tuán)，該文獻(xiàn)在此引為參考。代表性的熒光團(tuán)包括但不限于Alexa Fluor 350、丹磺酰氯(DNS-C1)、5-(碘 代乙酰胺)熒光素(5-IAF)、熒光素5-異硫氰酸酯(FITC)、四甲基羅丹明5-(和6_)異 硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘(丙烯酰丹)、7-硝基苯并-2-噁-1， 3，-二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙錠、熒光黃、5-羧基羅丹明6G鹽酸鹽、麗絲 胺羅丹明B磺酰氯、德克薩斯紅 、磺酰氯、BODIPY 、萘胺磺酸包括但不限于1-苯 胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(對(duì)甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)、蒽酰脂肪酸、DPH、 十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、德克薩斯紅-磷 脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、1-(3_磺酸根合丙 基)-4-[- 3 -[2[ ( 二正丁基氨基)-6-萘基]乙烯基]吡啶鐺甜菜堿(Naphtyl Styryl)、3， 3’ _ 二丙基硫雜二羰花青(diS-C3_(5))、4-(對(duì)二戊基氨基苯乙烯基)-1_甲基吡啶鐺 (di-5-ASP)、Cy-3碘代乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy_7_異硫氰酸酯、羅丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍(lán)、A1酞花青、噁嗪1，4'，6-二脒基-2-苯基 吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙錠同二聚體、N(乙氧基羰甲基)_6_甲 氧基喹啉鐺(MQAE)、Fura-2、鈣綠、羧基 SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofluors、
暈苯和金屬-配體復(fù)合物。代表性的固有熒光團(tuán)包括但不限于具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，包括但不限于 NADH、FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂類、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、 氨基酸、蛋白、肽、DNA、RNA、糖類和維生素。其他適合的熒光團(tuán)包括酶-輔因子、 鑭系元素、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或其突變體和衍生物。適合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的實(shí)例包括但不限于過氧化物酶、細(xì)菌螢光素酶、螢火 蟲螢光素酶、官能化的鐵-卟啉衍生物、魯米那、異魯米諾、吖啶酯、磺酰胺等。最 近的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物包括以次黃嘌呤作為底物的黃嘌呤氧化酶。觸發(fā)劑包括過硼酸鹽、 Fe-EDTA復(fù)合物和魯米諾。具體的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的選擇取決于幾種因素，包括制備標(biāo) 記成員的成本、用于與檢測(cè)分子共價(jià)偶聯(lián)的方法以及檢測(cè)分子和/或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的 大小。因此，化學(xué)發(fā)光觸發(fā)劑的選擇將取決于所使用的具體化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。優(yōu)選，生物發(fā)光產(chǎn)生系統(tǒng)的組分是螢光素酶和螢光素。生物發(fā)光產(chǎn)生系統(tǒng)可以 選自從櫛水母、腔腸動(dòng)物、軟體動(dòng)物、魚、介形動(dòng)物、昆蟲、細(xì)菌、甲殼綱、環(huán)節(jié)動(dòng)物 和蚯蚓分離的系統(tǒng)。螢光素酶可以選自發(fā)光水母、海螢(vargula)、海腎、螅蛋白、珍蟾 魚、齒裂蟲、奇巨口魚、厚巨口魚、螢火蟲和細(xì)菌的系統(tǒng)。金屬增強(qiáng)熒光提供了增加的強(qiáng)度，同時(shí)縮短了發(fā)射壽命。發(fā)射增強(qiáng)可以根據(jù)待 檢測(cè)熒光團(tuán)的類型和金屬材料的類型、形狀，在一定距離處觀察到，注意到了薄膜與金 屬島或膠體之間的區(qū)別。例如，當(dāng)熒光團(tuán)位于距金屬表面約7nm到約40nm的距離時(shí)， 可以觀察到發(fā)射增強(qiáng)。優(yōu)選的距離是距金屬表面約7nm到約30nm，更優(yōu)選為lOnm到約 20nm。熒光可以使用裝置進(jìn)行檢測(cè)，裝置包括但不限于帶有光源和檢測(cè)器的熒光分光 光度計(jì)。其他檢測(cè)器可以包括GaAs-陰極PMT。還有的檢測(cè)器可以包括光電倍增管。 此外，對(duì)于裝置來說具有單色器是有利的，以便可以使用特定波長的光來激發(fā)分子或在 特定波長處檢測(cè)發(fā)射。激發(fā)光源可以包括弧燈和激光、激光二極管和發(fā)光二極管光源、以及單個(gè)和多 個(gè)光子激發(fā)源。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Ti-藍(lán)寶石激光、激光二極管(LD)或發(fā)光二極管 光源(LEDs)的使用可以與本發(fā)明的RNA分析一起使用。例如，使用700-1000nm處的 2-光子激發(fā)，并且也使用短脈沖寬度(<50pi)、高重復(fù)頻率(l-SOMHz)的激光二極管和 LED (Ins, 1-lOMHz)光源)?？梢酝ㄟ^使用連續(xù)稀釋的RNA，開始用Ti_藍(lán)寶石系統(tǒng)， 然后使用LED和LD，來顯示使用2-光子激發(fā)與1-光子相比的分析靈敏度的增加。如 果熒光團(tuán)同時(shí)吸收兩個(gè)光子，它將吸收足夠的能量升高到激發(fā)態(tài)。然后熒光團(tuán)發(fā)出單個(gè) 光子，其波長依賴于所使用的熒光團(tuán)，典型在可見光譜內(nèi)。使用具有紅外光的TI-藍(lán)寶 石激光具有附加的益處，即較長的波長散射較少，這有利于高分辨率成像。重要的是， 通過利用靠近金屬粒子的局部激發(fā)，使用2-光子激發(fā)與1-光子激發(fā)相比獲得的背景信號(hào) 水平降低了。當(dāng)含有熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)的樣品被暴露于一定量激發(fā)輻射或參與發(fā)光化學(xué)反應(yīng)時(shí)，熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)發(fā)出可檢測(cè)的輻射。當(dāng)金屬粒子與熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán) 或發(fā)光團(tuán)之間的距離為約5nm到約200nm時(shí)，發(fā)射強(qiáng)度可以對(duì)激發(fā)輻射的量做出響應(yīng)而 增加。發(fā)射強(qiáng)度的增強(qiáng)部分是由于熒光團(tuán)在與金屬表面緊鄰時(shí)的局部激發(fā)，并導(dǎo)致發(fā)射 分子的光穩(wěn)定性增加。此外，與金屬材料表面上的等離子體激元的相互作用和偶聯(lián)提供 了額外的增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過使用各種還原劑還原金屬離子來制備金屬粒子。 例如，可以將氫氧化鈉添加到快速攪拌的硝酸銀溶液中，形成棕色沉淀。然后加入氫氧 化銨重新溶解沉淀。將溶液冷卻，向燒杯中加入干燥的石英玻片，然后加入葡萄糖。在 攪拌2分鐘后，將混合物加溫到30°C。10-15分鐘后，混合物轉(zhuǎn)為黃綠色并變渾濁。銀 粒子的薄膜形成在玻片上，可以從它們的棕綠色看出。值得注意的是，玻片在混合物中 保留的時(shí)間長度提供了不同的薄膜厚度。例如，如果沉積過程進(jìn)行約5到10分鐘，沉積 的薄膜將被認(rèn)為是“恰好連續(xù)的”。優(yōu)選的金屬是銀和金。同樣地，因?yàn)榻鹪谳^短波長 處的吸收，可以使用金。銀島薄膜也可以通過在石英表面上對(duì)銀鹽進(jìn)行化學(xué)還原來形成，其制作相對(duì)簡通過在玻璃或聚合物基材上放置官能性化學(xué)基團(tuán)例如氰化物(CN)、胺(NH2)或 硫醇(SH)，可以將能夠形成恰好連續(xù)薄膜的量的金屬材料結(jié)合到表面上?？梢酝ㄟ^使用薄膜來實(shí)現(xiàn)將生物分子或金屬粒子定位在所需距離上。薄膜可以 是聚合物薄膜、Langmuir-Blodgett薄膜或氧化物薄膜。此外，金屬薄膜可以通過真空氣相沉積來制備。在沉積金屬薄膜之前，可以 將基材在lXl(T4mbar下用空氣等離子體預(yù)處理3分鐘。銀線可以在燈絲上熔化，在 < lXlcTmbar的壓力下蒸發(fā)，并沉積在玻璃載片上。沉積速度可以通過燈絲電流進(jìn)行 調(diào)整(1埃/秒)，薄膜的厚度可以使用沉積室中位置與玻璃基材接近的石英晶體微天平 來測(cè)量。優(yōu)選，薄膜厚度在約12到17nm之間，然后薄膜可以在約200°C下退火約1小 時(shí)。退火過程在不存在氧氣的情況下進(jìn)行，在退火過程開始之前，可以通過輪流地用超 高純度氮?dú)?Airgas，MD)吹掃系統(tǒng)和泵抽真空來消除氧氣。方法和材料具有不同電阻的銀島薄膜(SiF)的制備SiF按照以前發(fā)表的4進(jìn)行制備。在典型的SiF制備中，在干凈的lOOmL玻璃燒 杯中制備硝酸銀溶液(0.5g在60ml去離子水中)。在室溫下向連續(xù)攪拌的硝酸銀溶液中 加入200 u L新鮮制備的5% (w/v)氫氧化鈉溶液和2ml氫氧化銨。隨后通過將燒杯放置 在冰浴中，將溶液冷卻到5°C，然后將硅烷-prepTM玻璃載片浸泡在溶液中，并加入新鮮 的D-葡萄糖溶液(0.72g在15ml水中)。然后將混合物的溫度加溫到30°C。當(dāng)混合物 的顏色從黃綠色轉(zhuǎn)變成黃棕色時(shí)，將燒杯移除加熱，根據(jù)所需的電阻將玻片在溶液中保 持5-30分鐘。然后將玻片從混合物中取出，用水洗滌，在風(fēng)下干燥，使用GDT-11伏 特計(jì)(GBInstruments )測(cè)量玻片電阻。在表面上制備干樣品將300 ii L FITC(2.5mM)乙醇溶液滴在具有不同電阻的SiF表面上。將溶劑蒸
發(fā)并研究樣品。對(duì)于氧化和偶極子重新定向研究(對(duì)照樣品)來說，將100 u L FITC滴在lmL 0.25% (w/v)PVA水溶液中，并旋涂在SiF上歐姆)。該步驟產(chǎn)生了 &37nm 厚的薄膜(使用AFM測(cè)量)，其阻止了氧氣的擴(kuò)散和電流流動(dòng)過程中熒光團(tuán)偶極子重新 定向。吸收和熒光測(cè)量在VarianCary50UV-Vis分光光度計(jì)上記錄吸收光譜。使用來自O(shè)cean Optics， Inc.的Fiber Optic光譜儀(HD2000)，使用與玻璃/鍍銀表面成45度入射的473nm激發(fā) 光，在與表面成90度的角度上收集熒光測(cè)量值。電壓門控實(shí)驗(yàn)將直流電(Extech Instruments 382213)施加到具有不同電阻的SiF上，如圖1下 圖插入圖，并在熒光測(cè)量期間門控“開”和“關(guān)”。SEM 測(cè)量在日立SU-70儀器上進(jìn)行掃描電子顯微術(shù)(SEM)。切取樣品并固定在鋁支持物 上。使用20kV的高電壓，以14994x放大倍數(shù)研究樣品。結(jié)果和討論有趣的是，具有高電阻的不連續(xù)薄膜使用直流電時(shí)沒有顯示出效應(yīng)，具有低電 阻的厚連續(xù)薄膜如以前所述6根本不適合于等離子體激元耦合。隨后，本文提出的發(fā)現(xiàn) 表明，具有低電阻的恰好連續(xù)的薄膜能夠用于門控MEF “開和關(guān)”，并事實(shí)上具有“居 間的”發(fā)射強(qiáng)度。由于最近對(duì)MEF用途的興趣，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于基于芯片實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)以 及開發(fā)新的直接測(cè)量耦合量子/熒光的熒光檢測(cè)器7，將是非常重要的。以前被用于MEF的SiF4’8，沉積在胺涂層的玻璃載片上(Sigma)，該步驟被修 改以允許SiF沉積更長的時(shí)間，以改變表面的電阻，如圖5上圖中所示。具體來說，沉 積> 15分鐘的薄膜被發(fā)現(xiàn)是完全導(dǎo)電的(電阻< 1 Q)，而沉積< 5分鐘的薄膜是不導(dǎo)電 的(電阻>106Q)。在約5-13分鐘之間沉積的薄膜是“恰好”導(dǎo)電的，薄膜具有最高 幾百歐姆的電阻。表面的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像顯示了薄膜的顆粒(高電阻)到連 續(xù)(低電阻)性質(zhì)，參見圖1和2的插入圖。圖1顯示了施加的電壓對(duì)涂層在半連續(xù)(恰好連續(xù))薄膜(7Q)上的熒光素 (FITC)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置顯示在圖1下圖的插入圖中。顯然，當(dāng)電壓被門控時(shí)，可以看 到FITC熒光分別上升和下降。除了強(qiáng)度波動(dòng)的幅度之外，門控過程中熒光發(fā)射光譜在光 譜上原本是一致的。圖1下圖插入圖中的照片顯示了門控過程中真實(shí)的熒光。在一系列詳細(xì)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，作為效應(yīng)的可能原因，消除了銀背景發(fā)射(圖5下 圖)和如圖6中所示的等離子體激元吸收隨著所施加的電流/電壓的變化。有趣的是， 隨著電壓和電流被逐漸改變，F(xiàn)ITC發(fā)射隨后被相應(yīng)地門控(圖7上圖)，強(qiáng)烈地表明觀 察到的現(xiàn)象是所施加的直流電的結(jié)果。如圖8中所示，表面氧化和偶極子重新定向也被考慮作為效應(yīng)的可能原因。但 是，在氮?dú)獯祾叩暮竦?.25% w/vPVA薄膜k37nm)中，仍然容易觀察到熒光門控效 應(yīng)。有趣的是考慮觀察到的熒光信號(hào)變化的幅度。從圖1上圖中看到了電流門控過程 中信號(hào)的的變化，但是據(jù)認(rèn)為幾種因素造成了熒光信號(hào)沒有以甚至更大的程度變 化(l)FITC分子涂層在銀島之上和之間，因此一大部分可能沒有受到所施加電流的影響；(2)在門控過程中存在輕微的升溫，這增加了 FITC發(fā)射，抵消了觀察到的效應(yīng) 的幅度。圖7下圖顯示了 FITC發(fā)射隨著溫度而增加，因此不能造成門控現(xiàn)象。就此而 言，SiF的等離子體激元吸收也顯示出不被溫度升高所擾亂，如圖6下圖中所示；以及(3)門控和未門控情況下熒光信號(hào)隨時(shí)間的總體降低，被認(rèn)為是由于用恒定的 CW 473nm激光激發(fā)的FITC的光穩(wěn)定性。因此，取決于可激發(fā)分子，電流門控過程中信號(hào)的變化可以高于在FITC中發(fā)現(xiàn) 的 50%。圖2研究了直流電對(duì)非常厚和薄的、即分別為低和高電阻的薄膜的效應(yīng)。有趣 的是，對(duì)于較厚的薄膜來說，MEF效應(yīng)的幅度與圖1中顯示的低電阻薄膜、即190a.u相 比明顯較低(在t = 0時(shí)55a.u)。該觀察結(jié)果與目前對(duì)MEF的理解和解釋8完全相 符，其中在本文使用的條件下，連續(xù)薄膜不能支持表面等離子體激元的產(chǎn)生，因此不能 支持MEF的產(chǎn)生。具有非常高電阻(即低電流)的不連續(xù)薄膜，顯示出較高的起始MEF 效應(yīng)，即= 260a.u.，如圖2下圖所示，與來自SiF的MEF的其他報(bào)道H’ 8相符。有趣 的是，作為圖1中顯示的銀薄膜，兩種表面都顯示出不太顯著的熒光門控效應(yīng)，表明對(duì) 于“恰好連續(xù)的”薄膜來說效應(yīng)更加顯著。 理論上認(rèn)為，導(dǎo)致如圖1和2所示的觀察到的結(jié)果的可能機(jī)制，包括當(dāng)施加電流 時(shí)，圖1中顯示的具有低電阻的恰好連續(xù)薄膜中的等離子體激元不可用于偶極子耦合和 MEF,因此MEF效應(yīng)被門控。對(duì)于圖2上圖中的厚薄膜來說，薄膜厚度足以允許電流流 動(dòng)，等離子體激元可自由用于MEF，觀察到的熒光的凈變化小得多。對(duì)于不連續(xù)薄膜來 說，它是MEF的理想基材，對(duì)電流流動(dòng)的電阻非常高，因此不能觀察到門控效應(yīng)，圖2 下圖。圖4下圖繪出了對(duì)電壓/電流門控的MEF效應(yīng)提出的機(jī)制。最后，將在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果放在最近出版物的環(huán)境中，在所述最近出版物 中，使用了掃描隧道顯微鏡在金屬納粒中激發(fā)了由于尖端的局部場(chǎng)引起的局部等離子體 激元共振9’1(1。隨后，Iwasaki等顯示了與納粒緊鄰的發(fā)光團(tuán)被隨后激發(fā)，產(chǎn)生了分子發(fā) 光1(1。本發(fā)明的系統(tǒng)在本質(zhì)上是宏觀的，事實(shí)上幾乎是相反的機(jī)制。在光激發(fā)和誘導(dǎo) 表面等離子體激元后，另外施加跨過納粒薄膜的電流降低了熒光團(tuán)偶極子耦合的程度， 減小了總體MEF效應(yīng)(圖4下圖)。有趣的是，盡管這些其他的報(bào)告是基于單個(gè)納粒和 無納粒的薄膜1(1，但我們還未能在不需要附加的光激發(fā)的情況下同樣地觀察到熒光。與 Iwasaki等的相似，本文提出的發(fā)現(xiàn)不依賴于極性，通過簡單地在電導(dǎo)線各處進(jìn)行切換獲 得了同樣的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。從圖1中，可以看到當(dāng)電壓被門控時(shí)熒光發(fā)射幾乎以雙指數(shù)喪失，最終在幾百 秒、即<3分鐘內(nèi)達(dá)到平臺(tái)。有趣的是，在開始施加電流時(shí)，熒光強(qiáng)度事實(shí)上在幾秒內(nèi) 非?？焖俚叵陆?。后來，發(fā)射的喪失速度就慢得多。熒光的這種快速然后慢速的衰減據(jù) 認(rèn)為由兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的過程造成。開始時(shí)，由于如同前面討論的，表面等離子體激元不能 偶極子耦合因而不能增強(qiáng)熒光，因此熒光由電流通過而被關(guān)門控。在后來的時(shí)間中，觀 察到了銀島薄膜已輕微升溫，如圖7下圖中所示，這導(dǎo)致了熒光素(FITC)熒光的增加。 隨后，快速的關(guān)門控效應(yīng)、然后是由于薄膜對(duì)電流的電阻導(dǎo)致的緩慢表面加熱，被認(rèn)為 造成了圖1上圖中觀察到的熒光的雙指數(shù)喪失。
盡管最初認(rèn)為表面加熱似乎使熒光門控觀察結(jié)果復(fù)雜化，但據(jù)認(rèn)為表面樣品的 輕微加熱能夠很好地促進(jìn)快速分析的開發(fā)，正如最近通過使用聚焦低功率微波和金屬納 粒所報(bào)道的"_13?？傊?，在本發(fā)明中顯示了通過跨過恰好連續(xù)的銀薄膜添加施加的電流，第一次 觀察到了門控MEF。結(jié)果表明，對(duì)于具有施加的電流的恰好連續(xù)的薄膜來說，表面等離 子體激元不是那樣容易地可用于近場(chǎng)偶極子耦合，當(dāng)使用較厚金屬時(shí)效應(yīng)消失，從根本 上增加了可用于電流的載荷子的數(shù)量，并釋放出表面等離子體激元用于偶極子耦合。參考文獻(xiàn) 本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此出于所有目的引為參考。(l)Geddes, C.D. ； Lakowicz, J.R.，Journal of Fluorescence, 2002，121-129.(2) Asian, K. ； Gryczynski, I. ； Malicka, J. ； Matveeva, Ε. ； Lakowicz, J.R.； Geddes, C.D., Current Opinion in Biotechnology 2005, 16，55-62.(3)Zhang, Y. ； Asian, K. ； Previte, M.J. ; Geddes，C.O., J Fluoresc2007, 17， 627-631.(4) Asian, K. ； Geddes, C.D., Analytical Chemistry 2005，77，8057-8067.(5) Asian, K. ； Malyn, S.N. ; Geddes，C.D., Analyst 2007，132，1112-1121.(6) Chowdhury, M.H. ； Asian, K. ； Malyn, S.N ； Lakowicz, J.R. ； Geddes, C.D., Applied Physics Letters, 2006，88，173104.(7) Boehm, D.A. ； Gottlieb, P.A. ； Hua, S.Z., Sensors and ActuatorsB-Chemical 2007， 126， 508-514.(8) Asian, K. ； Zhang, Y. ； Hibbs, S. ； Baillie, L. ； Previte, M.J. ； Geddes, CD., Analyst 2007，132，1130-8.(9)Makinen, A.J. ; Foos，Ε.Ε. ； Wilkinson, J. ； Long, J.R, JoumalofPhysical Chemistry C, 2007，111，8188—8194.(lO)Liu.H.W. ； Ie, Y. ; Nishitani R. ; Aso，Y. ； Iwasaki, H., PhysicalReview B, 2007， 75.(11) Asian，K.; Geddes, C.D., Analytical Chemistry, 2005，77，8057-8067.(12) Asian, K. ； Geddes, C.D., Plasmonic, s 2006, 1，53-59.(13) Asian, K. ； Geddes, C.D., Anal Chem，2007，79，2131—6.
權(quán)利要求
1.一種用于分析中的裝置系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含a)基材上的導(dǎo)電金屬表面，其中所述導(dǎo)電金屬表面是沉積在所述基材上的恰好連續(xù) 的薄膜并表現(xiàn)出低電阻，并且其中所述基材包括玻璃、石英或聚合材料；b)位于導(dǎo)電金屬表面上或其附近的分子，其中所述分子能夠在激發(fā)時(shí)發(fā)射電磁能量；c)用于激發(fā)所述分子并引起電磁能量發(fā)射的電磁能量源；d)與所述導(dǎo)電金屬表面相連、具有打開和關(guān)閉能力的直流電源；以及e)用于測(cè)量發(fā)射電磁能量的檢測(cè)器和/或用于測(cè)量通過所述導(dǎo)電金屬表面的直流電 的檢測(cè)器。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述分子是熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)。
3.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述導(dǎo)電金屬表面由選自金、銀、鋁和銅的金屬制成。
4.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述恰好連續(xù)的薄膜是電阻在約2到200歐姆范圍內(nèi)的導(dǎo)電金屬薄膜。
5.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述恰好連續(xù)的薄膜是電阻在約5到25歐姆范圍內(nèi)的導(dǎo)電金屬薄膜。
6.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中與所述導(dǎo)電金屬薄膜交通連接的直流電的通過，導(dǎo)致與其 中沒有連接直流電的薄膜相比，由鄰近的熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)發(fā)射的電磁發(fā)射強(qiáng)度 降低。
7.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中電壓源是蓄電池、太陽能電池或氫燃料電池。
8.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)位于距所述金屬表面約10到 20nm 處。
9.
10.權(quán)利要求8的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)用于免疫分析、雜交分析、共振能量轉(zhuǎn)移分 析、和基于偏振/各向異性的分析、基于生物發(fā)光的分析、基于化學(xué)發(fā)光的分析、基于 發(fā)光的分析或酶聯(lián)免疫吸附分析。
11.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述激發(fā)電磁能量在從UV或IRE的范圍內(nèi)。
12.一種用于操縱來自金屬增強(qiáng)熒光系統(tǒng)的發(fā)射的方法，所述方法包括a)在基材上提供導(dǎo)電金屬表面，其中所述導(dǎo)電金屬表面包含在所述基材上恰好連續(xù) 的薄膜，并且其中所述基材包括玻璃、石英、銅或聚合材料；b)將分子定位于所述導(dǎo)電金屬表面附近，其中所述分子能夠發(fā)射可檢測(cè)的電磁能 量，并且其中所述分子在距所述導(dǎo)電金屬表面以增強(qiáng)發(fā)射的可檢測(cè)電磁能量的強(qiáng)度的距 離處定位；c)施加電磁能量，所述電磁能量的波長足以激發(fā)所述分子并引起可檢測(cè)的電磁能量 發(fā)射；以及d)將所述導(dǎo)電金屬表面與電壓源和可致動(dòng)開關(guān)相連，其中所述開關(guān)打開允許直流電 通過所述導(dǎo)電金屬表面輸送，這減小或停止可檢測(cè)的電磁能量發(fā)射，且所述開關(guān)關(guān)閉為 可檢測(cè)的電磁能量發(fā)射提供可檢測(cè)的電磁能量發(fā)射。
13.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述分子是熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)。
14.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述導(dǎo)電金屬表面由選自金、銀、鋁和銅的金屬制成。
15.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述恰好連續(xù)的薄膜是電阻在約2到200歐姆范圍內(nèi)的導(dǎo)電金屬薄膜。
16.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述恰好連續(xù)的薄膜是電阻在約5到25歐姆范圍內(nèi)的導(dǎo)電金屬薄膜。
17.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中與所述導(dǎo)電金屬薄膜交通連接的直流電的通過，導(dǎo)致與 其中沒有連接直流電的薄膜相比，由鄰近的熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)發(fā)射的電磁發(fā)射強(qiáng) 度降低。
18.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中電壓源是蓄電池、太陽能電池或氫燃料電池。
19.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或發(fā)光團(tuán)位于距所述金屬表面約 10 到 20nm 處。
20.權(quán)利要求19的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)用于免疫分析、雜交分析、共振能量轉(zhuǎn)移分 析、和基于偏振/各向異性的分析、基于生物發(fā)光的分析、基于化學(xué)發(fā)光的分析、基于 發(fā)光的分析或酶聯(lián)免疫吸附分析。
21.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述激發(fā)電磁能量在從UV或IR的范圍內(nèi)。
全文摘要
在本發(fā)明中，第一次證明了電流對(duì)表面等離子體激元放大熒光信號(hào)的能力的影響?？邕^低電阻銀島薄膜(SiF)施加的直流電擾亂了緊鄰熒光團(tuán)的熒光增強(qiáng)。對(duì)于給定的施加電流來說，“恰好連續(xù)”的低電阻薄膜中的表面等離子體激元很少可用于熒光團(tuán)偶極子耦合，因此隨著所施加電流的變化對(duì)增強(qiáng)的熒光進(jìn)行了門控。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102016553SQ200980113902
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者克里斯·D·格迪斯 申請(qǐng)人:馬里蘭大學(xué),巴爾的摩縣