專利名稱：檢測(cè)鈉/鈣交換體“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈉/鈣交換體(sodium/calcium exchanger)和檢測(cè)其活性的方法。 更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)鈉/鈣交換體“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測(cè)定 法。本發(fā)明還涉及包含表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞的組件試劑盒(kit of parts)及組件試 劑盒的用途。
背景技術(shù)：
生命的一個(gè)基本的必要條件是區(qū)室化——以生物膜作為實(shí)現(xiàn)這一原則的天然工 具。然而，脂雙層——構(gòu)成細(xì)胞膜基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)——對(duì)大多數(shù)離子和化合物是不滲透的，而這 些離子和化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)是維持細(xì)胞和生物體的生命機(jī)能所必需的。這種反論的答案在于細(xì) 胞膜的半滲透性質(zhì)——必須跨過膜的溶質(zhì)通過特定的膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)離子 梯度的產(chǎn)生和維持，營養(yǎng)物的攝取，代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的重?cái)z取以及毒性和廢 棄化合物的清除。因此，在這種情況下，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是允許直接影響疾病相關(guān)性異常狀況的潛 在的藥物靶標(biāo)。人鈉/鈣交換體基因家族(亦稱為NCX或SLC8)包括三種截然不同的蛋白，NCXl、 NCX2 和 NCX3。SLC8 與 SLC24 —起構(gòu)成 Na+/Ca2+ 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(countertransporter)的超 家族。SLC24家族成員還轉(zhuǎn)運(yùn)K+，亦稱為NCKX。NCXl是該家族中表征最充分的成員，在人衰竭性心臟中它的表達(dá)被上調(diào)，并在心 肌梗死后參與缺血-再灌注損傷(ischemia-r印erfusion damage)。抑制NCXl使衰竭性心 臟的心肌收縮性正?；?，并且在缺血再灌注后發(fā)揮心臟保護(hù)作用(Flesch等，Circulation 1996 ；Komuro 禾口 Ohtsuka，Journal of Pharmacological. Sciences. 2004)。 NCX2 主要在大 腦中表達(dá)，NCX3主要在大腦和骨骼肌中表達(dá)，其生理作用不詳。鈉/鈣交換體是從不同細(xì)胞中去除Ca2+的重要機(jī)制。在心臟中，它排除通過Ca2+ 通道進(jìn)入的Ca2+引起收縮，同時(shí)使Na+進(jìn)入心臟細(xì)胞。其在心血管疾病中的關(guān)聯(lián)性參見 例如 Hobai，JA 禾口 0’ Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因此， 制藥業(yè)已開發(fā)出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對(duì)于以相反方向移動(dòng)的每個(gè)Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產(chǎn)生電的方式轉(zhuǎn)運(yùn)3_4個(gè) Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學(xué)方法所示。NCX能夠 維持低于胞外Ca2+濃度([Ca2+]入)3-4個(gè)數(shù)量級(jí)的胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]出)。然而，凈 Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的方向取決于Na+的電化學(xué)梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)模型和 相繼轉(zhuǎn)運(yùn)模型，大量證據(jù)支持后者。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)新興的靶標(biāo)家族，具有巨大的潛力，可提供科學(xué)和經(jīng)濟(jì)機(jī)會(huì)。另一 方面，就藥物開發(fā)技術(shù)而言轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是困難的靶標(biāo)類別。鑒定例如通過阻斷鈣的流動(dòng)和/或抑制鈣通道的活化來調(diào)節(jié)通道活性的化合物 是相當(dāng)有價(jià)值的。這樣做的一種標(biāo)準(zhǔn)方法是通過采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，必須由技術(shù)嫻熟的操作人員，通過測(cè)量在響應(yīng)膜電位變化和/或試驗(yàn)化合物應(yīng)用時(shí)跨越細(xì)胞膜的鈣流，依次個(gè)別地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究了 Sea0400(NCX 的一種新的特異性抑制劑)對(duì)狗心室乳頭肌的動(dòng)作電位的作用，參見K. Acsai在“2004年 ESC 大會(huì)，，期間發(fā)表于 Munich on Poster Nr. 2886 的文獻(xiàn)(標(biāo)題Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker Sea0400on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber (特異j"生 內(nèi) _ f丐 交換體阻斷劑Sea0400對(duì)心室動(dòng)作電位的作用和引發(fā)的狗心室肌和浦肯野纖維的活性)) 以及 C· Lee 等(The journal of pharmacology and experimental therapeutics ；第 311 卷748-757，2004 ；標(biāo)題！Inhibitory profile of SEA0400 [2-[4-[ (2, 5-Difluorophenyl) methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed on the cardiac Na+/Ca2+exchanger， NCXl·l(評(píng)價(jià)SEA0400[2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]_5_乙氧基苯胺]對(duì)心臟 NaVCa2+交換體NCX1. 1的抑制特征))。采用離子選擇電極技術(shù)定量測(cè)定巨膜片(giant patch)中離子流的研究表明，心 臟 Na+/Ca2+交換體具有多種轉(zhuǎn)運(yùn)模式(Tong Mook Kang 和 Donald W. Hilgemann ；Nature ； % 427 2004 ^ 2 B 5 H ；豐示H :Multiple transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger (心臟Na+/Ca2+交換體的多種轉(zhuǎn)運(yùn)模式))。這些實(shí)驗(yàn)雖然有效并提供大量信息，但卻非常耗時(shí)而且不適于對(duì)調(diào)節(jié)鈣離子通道 活性的化合物進(jìn)行高通量測(cè)定。多種技術(shù)已發(fā)展成為電生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法的備選方法。例如，已采用放射性流量 測(cè)定法(radioactive flux assay)，其中將細(xì)胞暴露于放射性示蹤物(例如45Ca)中并 監(jiān)測(cè)放射性標(biāo)記的Ca流量。將負(fù)載有示蹤物的細(xì)胞暴露于化合物中，增加或減少示蹤物 流出的那些化合物被鑒定為潛在的細(xì)胞膜離子通道的激活劑或抑制劑。一個(gè)具體實(shí)例 0β Τ. Kuramochi φ ；Bioorganic & Medicinal Chemistry ； 12 (2004) 5039-5056 ； feH Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger (作為 內(nèi) _ f丐交換體新型才IpfU齊[J的 苯氧基吡啶衍生物的合成和結(jié)構(gòu)_活性關(guān)系)。EP1031556公開了其中使用肌膜囊泡測(cè)定 NaVCa2+交換體活性的方法，通過測(cè)量45Ca的放射性來測(cè)定肌膜囊泡中Ca2+攝取的濃度。多種放射性離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白測(cè)定法的靈敏度有限，因此數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳。另外，與放射 性篩選技術(shù)有關(guān)的成本和安全問題是妨礙廣泛應(yīng)用的障礙。在上述藥物開發(fā)技術(shù)中，應(yīng)用放射性流量測(cè)定法來鑒定調(diào)節(jié)離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白活性的化合物是與本發(fā)明最接近的現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞的Ca2+流 量來將試驗(yàn)化合物鑒定為潛在激活劑或抑制劑。放射性測(cè)定法的主要問題出在檢測(cè)每秒約1-1000個(gè)分子的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的周轉(zhuǎn) 受限(小于大多數(shù)離子通道的約104倍)的困難上。因此，由現(xiàn)有技術(shù)水平所產(chǎn)生的問題是確定在高通量篩選鈉/鈣交換體調(diào)節(jié)劑和 分析其特征方面具有極佳靈敏度和實(shí)用性的穩(wěn)健測(cè)定法。本發(fā)明提供了對(duì)此問題的解決方案。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)主題涉及用于測(cè)定鈉/鈣交換體活性的測(cè)定法，其中a)提供表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞；
b)提供用于測(cè)定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細(xì)胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和d)將來自所述有色物質(zhì)的發(fā)光信號(hào)中鈣介導(dǎo)的變化與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的發(fā)光信 號(hào)相比較。本發(fā)明另一個(gè)主題涉及用于測(cè)定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的 測(cè)定法，其中a)提供表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞；b)提供用于測(cè)定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細(xì)胞與化合物接觸，其中所述細(xì)胞在用所述化合物處理前已經(jīng)過鈉/鈣交換 體激活劑處理；和d)將來自所述有色物質(zhì)的發(fā)光信號(hào)中鈣介導(dǎo)的變化與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的發(fā)光信 號(hào)相比較。一般而言，所用鈉/鈣交換體來源于哺乳動(dòng)物，特別來源于人。鈉/鈣交換體選自 下列鈉 / 鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6 和 / 或 NCX7，特別是 NCXl、 NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。一般而言，用于本發(fā)明測(cè)定法的細(xì)胞可來源于任何真核生物。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是CH0(CCL-61)、 HEK(CCL-1573)、C0S7(CRL-1651)和 / 或 JURKAT (CRL-1990)細(xì)胞。用于本發(fā)明測(cè)定法的鈉/鈣交換體激活劑特別為洛諾霉素(ionomycin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將作為染料前體的能夠進(jìn)入細(xì)胞并能夠水解成染料 的所述有色物質(zhì)加入細(xì)胞中，從而染料與鈣在所述細(xì)胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號(hào)。此外， 所述染料前體可優(yōu)選為乙酰氧基甲基酯衍生物，并且所述染料可優(yōu)選為鈣敏感熒光染料 fluo-4。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是熒光，所述監(jiān)測(cè)步驟c)采用FLira
直ο本發(fā)明還涉及采用前述測(cè)定法檢驗(yàn)化合物作為鈉/鈣交換體的激動(dòng)劑或拮抗劑 的活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及采用前述測(cè)定法診斷與鈉/鈣交換體表 達(dá)發(fā)生改變有關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及包含以下組件試劑盒a)表達(dá)(expriming)鈉/鈣交換體的凍干細(xì)胞；b)有色物質(zhì)；c)化合物緩沖液；和d)有色物質(zhì)緩沖液。在本發(fā)明組件試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有色物質(zhì)是鈣敏感熒光染料 fluo-4。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的鈉/鈣交換體來源于哺乳動(dòng)物，特別來源于 人。鈉/鈣交換體選自下列鈉/鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/ 或NCX7，特別是NCX1、NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 =NCKXl、 NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。本發(fā)明還涉及采用前述組件試劑盒檢驗(yàn)化合物作為鈉/鈣交換體的激動(dòng)劑或拮抗劑的活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及采用前述組件試劑盒診斷與鈉/鈣 交換體表達(dá)發(fā)生改變有關(guān)的疾病。發(fā)明詳述術(shù)語“測(cè)定法”是指測(cè)定某一系統(tǒng)或?qū)ο蟮男再|(zhì)的方法。測(cè)定法是常用術(shù)語生物測(cè)定法的省略形式，并且是體外實(shí)驗(yàn)的一種類型。通常進(jìn) 行測(cè)定法以測(cè)量某一物質(zhì)對(duì)活生物體的作用。測(cè)定可以是定性或定量的，它們?cè)谛滤庨_發(fā) 中是必不可少的。主題測(cè)定法提供大的動(dòng)態(tài)范圍(dynamic range)，使得可以測(cè)定鈉/鈣交換體的 活性。特別是本發(fā)明可提供快速有效的測(cè)定法，用于篩選與鈉/鈣交換體進(jìn)行特異性相互 作用并調(diào)節(jié)其活性的藥學(xué)上有效的化合物并分析該化合物的特征。在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“鈉/鈣交換體”或“NCX”可以是指下列Na+/Ca2+交換 蛋白中單獨(dú)或彼此組合的任一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6，NCX7 ；或者下列Na+/ Ca2VK+交換蛋白中單獨(dú)或彼此組合的任一種NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。尤其優(yōu)選的是SLC8家族成員NCXl、NCX2和/或NCX3，其氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。這類鈉/鈣交換體可來源于任何脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物物種(例如狗、馬、牛、 小鼠、大鼠、犬科動(dòng)物、兔、雞、類人猿、人等)。鈉/鈣交換體可以從這類有脊椎生物的組織 探查物(probes)中分離，或者可以借助能夠表達(dá)鈉/鈣交換體的重組生物材料制備。術(shù)語“鈉/鈣交換蛋白”是指多肽、多態(tài)變體(polymorphic variant)、突變體和種 間同源物，其氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200個(gè)或500個(gè)以上氨基酸的區(qū)域內(nèi)與 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3中所含氨基酸序列相比有超過約80%氨基酸 序列同一性、85%、90%、優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上氨 基酸序列同一性。術(shù)語“生物材料”是指含有遺傳信息和能夠自體復(fù)制或在生物系統(tǒng)中復(fù)制的任何 材料。重組生物材料是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)產(chǎn)生、改變或修飾的任何生物 材料。下列參考文獻(xiàn)是克隆特定NCX蛋白的實(shí)例Nicoll，D Α.等人克隆了犬Na+/Ca2+ 交換體NCXl (Science. 250(4980) :562_5，1990 ；標(biāo)題Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcoIemmalNa (+) -Ca2+exchanger (Na (+) -Ca2+ ^ 換體的分子克隆和功能性表達(dá)))。Komuro, I.等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (10), 4769-4773,1992 ； f 示 IS :Molecular cloning and characterization of the human cardiacNa+/Ca2+ exchanger cDNA (人心臟 Na+/Ca2+ 交換體 cDNA 的分子克隆與表征)) 和 Kofuji，P.等(Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol. 32) :C 1241-C 1249，1992 ；標(biāo)題 Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues -.a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger (不同組織中Na-Ca交換體的表達(dá)使用克隆的人心臟 Na-Ca交換體的研究))克隆了人NaVCa2+交換體NCXl。Li，Z.等人克隆了人Na+/Ca2+交換體 NCX2 (J. Biol. Chem. 269(26) 17434-9，1994 ；標(biāo)題Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+ exchanger (質(zhì)膜Na(+)_Ca2+交換體的NCX2 同種型的克隆))。 Nicoll，DA.等人克隆了大鼠 Na+/Ca2+交換體 NCX3(J. Biol. Chem. 271(40) :24914_21，1996 ；標(biāo)題Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+ exchanger, NCX3 (第三型哺乳動(dòng)物 Na+/ Ca2+交換體 NCX3 的克隆))。Gabellini，N.等人克隆了人 Na+/Ca2+交換體 NCX3 (Gene. 298 1_7，2002 ；標(biāo)題The human SLC8A3gene and the tissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3isoforms (人SLC8A3基因和組織特異性Na+/Ca2+交換體3同種型))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合體。 該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的 氨基酸聚合體，并適用于天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。術(shù)語“鈉/鈣交換體的活性”是指從細(xì)胞去除胞內(nèi)Ca2+的機(jī)制。在心臟中，它排除 通過Ca2+通道進(jìn)入的Ca2+引起收縮，同時(shí)Na+進(jìn)入心臟細(xì)胞。其在心血管疾病中的關(guān)聯(lián)性 參見例如 Hobai，JA 禾口 0’ Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因 此，制藥業(yè)已開發(fā)出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對(duì)于以相反方向移動(dòng)的每個(gè)Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產(chǎn)生電的方式轉(zhuǎn)運(yùn)3_4個(gè) Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學(xué)方法所示。NCX能夠 維持低于胞外Ca2+濃度([Ca2+]出)3-4個(gè)數(shù)量級(jí)的胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]入)。然而，凈 Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)方向取決于Na+的電化學(xué)梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)模型和相 繼轉(zhuǎn)運(yùn)模型，大量證據(jù)支持后者。通過測(cè)量合適的有色物質(zhì)與鈣絡(luò)合所產(chǎn)生的增強(qiáng)的發(fā)光， 來測(cè)定鈉/鈣交換體的活性。術(shù)語“表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞”是指內(nèi)源性表達(dá)目標(biāo)交換體的細(xì)胞或重組細(xì)胞。當(dāng)提及例如細(xì)胞、或核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，術(shù)語“重組”是指通過導(dǎo)入異源核酸或 蛋白質(zhì)或者改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者所述細(xì)胞來 源于經(jīng)如此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)天然(非重組)形式的細(xì)胞內(nèi)不存在的 基因，或者表達(dá)異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本不表達(dá)的天然基因。在本發(fā)明中，這通常是指用 編碼鈉/鈣交換體的核酸序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。僅通過使細(xì)胞生長在有合適培養(yǎng)基的適當(dāng)容器中，便可進(jìn)行該測(cè)定法。細(xì)胞可以 是天然存在的細(xì)胞、天然細(xì)胞、建立的細(xì)胞系、市售細(xì)胞、遺傳修飾的細(xì)胞等，只要細(xì)胞在測(cè) 定期間能夠維持，并且適宜在培養(yǎng)基中生長即可。用于進(jìn)行主題測(cè)定法的合適細(xì)胞包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞，尤其是哺 乳動(dòng)物細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物和革蘭氏陽性生物。細(xì)胞一般可為哺乳動(dòng)物 細(xì)胞，例如人細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、中國倉鼠細(xì)胞等。被認(rèn)為是合適的細(xì)胞包括CH0、 C0S7、JURKAT, HeLa, HEKs, MDCK 和 HEK293 細(xì)胞。細(xì)胞可以用眾所周知的方法制備(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)，或者可以購買(Invitrogen Corp.，Sigma-Aldrich Corp.，Stratagene)。術(shù)語“有色物質(zhì)”尤其是指鈣敏感熒光染料。染料前體的特征在于在測(cè)定條件下不發(fā)光，是一種酯，能夠進(jìn)入細(xì)胞并且在胞內(nèi) 水解成發(fā)光的含氧化合物，而且與鈣絡(luò)合時(shí)發(fā)光增強(qiáng)。選擇易被胞內(nèi)水解酶水解的酯。術(shù)語“能夠進(jìn)入細(xì)胞”是指前體能夠跨細(xì)胞膜并且在細(xì)胞中被水解，染料前體在特 定的PH、溫度等條件下進(jìn)入細(xì)胞，以不同的速度進(jìn)入細(xì)胞，或者在特定條件下不進(jìn)入細(xì)胞。采用眾所周知的方案，將有色物質(zhì)加入細(xì)胞中(Current protocols in cellbiology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)。所使用的有色物質(zhì)是常用的市售試劑(Invitrogen Corp.)，并且可以使用在實(shí)驗(yàn) 室合成的試劑。滿足上述要求的多種市售染料是已知的。用于監(jiān)測(cè)Ca2+的熒光染料是眾所周知 的，詳情可參見Molecular Probes目錄第20. 1-20. 4節(jié)，第9版。它們通常具有兩個(gè)與熒 光核(例如熒光素、羅丹明、香豆素、氨基苯基吲哚等)連接的雙-羧甲基氨基。該化合物 大部分是3，6_ 二氧基取代的咕噸，在前體中氧基是取代的，在發(fā)光染料中則是未取代的。 通常存在保護(hù)酚和酸的乙酰氧基甲基。參見例如Fluo3/4、Fura2/3、鈣熒光素綠(calcein green)等。乙?；乃猱a(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物。前體能夠跨過細(xì)胞膜并在細(xì)胞中水解。術(shù)語“發(fā)光，，是指“冷光”，光來自其它能量源，可發(fā)生在常溫和較低溫度下。在發(fā) 光時(shí)，一些能量源將原子的電子拋出其“基”(最低能量)態(tài)進(jìn)入“激發(fā)”(較高能量)態(tài); 然后電子返還光形式的能量，因此可以回到其“基”態(tài)。有若干種發(fā)光類型，各自根據(jù)能量 源是什么或是什么引起發(fā)光而命名。術(shù)語“熒光”是指主要作為冷體(cold body)中的光學(xué)現(xiàn)象而存在的發(fā)光，其中分 子吸收光子引起發(fā)射出另一個(gè)具有較長波長的光子。吸收光子與發(fā)出光子之間的能量差以 分子振動(dòng)或熱結(jié)束。通常吸收光子在紫外線區(qū)，發(fā)射光在可見區(qū)，但是這取決于具體熒光團(tuán) 的吸光度曲線和斯托克司頻移。熒光以礦物熒石的名字命名，礦物熒石由通常具有這種現(xiàn) 象的氟化鈣組成?？捎冒l(fā)光計(jì)或熒光成像儀測(cè)量來自指示劑染料的熒光。一種優(yōu)選的檢測(cè)儀是 焚光成像讀板儀(Fluorometric Imaging Plate Reader, FLI PR) (Molecular Devices, Sunnyvale,Calif.)0 FLII3R非常適于應(yīng)用本發(fā)明方法的高通量篩選，因?yàn)樗鼘⒛軌驅(qū)⑼瑫r(shí) 移液至微量滴定板的96孔或384孔的集成液體處理與采用與電荷耦合器件攝影機(jī)連接的 氬激光器進(jìn)行快速動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)合在一起。使用鈣指示劑染料的一種備選方法是使用水母發(fā)光蛋白系統(tǒng)。水母發(fā)光蛋 白系統(tǒng)利用蛋白質(zhì)脫輔基水母發(fā)光蛋白(apoaequorin)，它與親脂性發(fā)色團(tuán)腔腸素 (coelenterazine)結(jié)合，形成脫輔基水母發(fā)光蛋白與腔腸素的組合(稱為水母發(fā)光蛋白)。 脫輔基水母發(fā)光蛋白具有3個(gè)鈣結(jié)合部位，在鈣結(jié)合時(shí)，水母發(fā)光蛋白的脫輔基水母發(fā)光 蛋白部分的構(gòu)象發(fā)生改變。構(gòu)象的這種改變使腔腸素被氧化成coelenteramide、CO2和藍(lán) 光(466nm)的光子?？梢允褂煤线m的儀器檢測(cè)這種光子。有關(guān)使用水母發(fā)光蛋白的綜述可參見Cr6ton等，1999，Microscopy Research and Technique 46 :390_397 ；Brini 等，1995，J. Biol. Chem. 270 9896-9903 ；Knight 和 Knight, 1995，Meth. Cell. Biol. 49 :201_216。同樣有價(jià)值的可為美國專利第5，714，666號(hào)，它描述 了通過將腔腸素輔因子加入表達(dá)脫輔基水母發(fā)光蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中來測(cè)量哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的胞內(nèi)鈣的方法?！耙种苿笔抢缃Y(jié)合鈉/鈣交換蛋白、部分或完全阻斷其活性、降低、阻止鈉/鈣 交換蛋白的活性或表達(dá)、延遲鈉/鈣交換蛋白活化、使鈉/鈣交換蛋白失活、脫敏或者下調(diào) 鈉/鈣交換蛋白的活性或表達(dá)的化合物，例如拮抗劑。“激活劑”是增加、開啟、激活、促進(jìn)鈉/鈣交換體活性、促進(jìn)其活化、敏化、刺激或上 調(diào)鈉/鈣交換體活性的化合物。一種優(yōu)選的鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素，一種源自密團(tuán)鏈霉菌(Streptomyces conglobatus)的離子載體。抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑還包括鈉/鈣交換蛋白的遺傳修飾形式，例如活性發(fā)生 改變的形式，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、肽、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、 核酶、有機(jī)小分子等。術(shù)語“化合物”或“試驗(yàn)化合物”或“試驗(yàn)候選物(test candidate)”或其語法等 同術(shù)語是指將要被測(cè)定調(diào)節(jié)鈉/鈣交換體活性的能力的任何天然存在或合成的分子，例如 蛋白質(zhì)、寡肽、有機(jī)小分子、多糖、脂質(zhì)、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471250961)。試驗(yàn)化合物可 以是試驗(yàn)化合物文庫的形式，例如提供足夠多樣性范圍的組合文庫或隨機(jī)文庫(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471250937)。試驗(yàn)化合 物任選與融合配偶體連接，融合配偶體例如靶向化合物、拯救化合物(rescue compound)、 二聚化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物(addressable compound)和其它功能性部分。按 慣例，通過鑒定具有某些所需性質(zhì)或活性(例如活性升高)的試驗(yàn)化合物(稱為“先導(dǎo)化合 物”)、產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的變體以及評(píng)價(jià)這些變體化合物的性質(zhì)和活性，來產(chǎn)生具有有益性 質(zhì)的新的化學(xué)實(shí)體。優(yōu)選將高通量篩選(HTS)方法應(yīng)用于這類分析。在細(xì)胞生長后，所述抑制劑、激活劑和試驗(yàn)化合物可通過注入培養(yǎng)基中而加入細(xì) 胞內(nèi)，或者它們可在細(xì)胞生長前就存在于培養(yǎng)基中(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471241059)。細(xì)胞可以在抑制劑、激活劑和/或試驗(yàn)化合物中生長到適當(dāng)數(shù)目，或者將抑制劑、 激活劑和/或試驗(yàn)化合物加入其中使用而細(xì)胞沒有進(jìn)一步生長。細(xì)胞可與抑制劑、激活劑 和/或試驗(yàn)化合物結(jié)合，或者在將細(xì)胞置于孔中或使其在孔中生長的實(shí)施方案中，細(xì)胞可 以是懸浮在孔內(nèi)液體中的懸液細(xì)胞。術(shù)語“對(duì)照實(shí)驗(yàn)”是指可以同時(shí)進(jìn)行的不同類型的實(shí)驗(yàn)。技術(shù)人員應(yīng)了解的是，與 本文所述方法一起進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)一般是有益的。例如，對(duì)于測(cè)定鈉/鈣交換體活性的測(cè)定法，具有對(duì)照通常是有益的，其中細(xì)胞優(yōu) 選與用于該測(cè)定法的細(xì)胞基本相同，不同之處在于這些細(xì)胞不會(huì)表達(dá)目標(biāo)鈉/鈣交換體。此外，對(duì)于測(cè)定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測(cè)定法，具有對(duì)照 通常是有益的，其中在本發(fā)明的測(cè)定法中檢驗(yàn)化合物，所述化合物針對(duì)的是優(yōu)選與該測(cè)定 法中所用的細(xì)胞基本相同的細(xì)胞，不同之處在于這些細(xì)胞不表達(dá)目標(biāo)鈉/鈣交換體。這樣 可以確定通過所述測(cè)定法鑒定的化合物確實(shí)是通過目標(biāo)鈉/鈣交換體而不是通過某些意 料之外的非特異性機(jī)制起作用。這類對(duì)照細(xì)胞的一種可能性可以是非重組親本細(xì)胞，其中 實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的該細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)鈉/鈣交換體。對(duì)于測(cè)定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性，用于該測(cè)定法的其它對(duì)照 可以是在不加入試驗(yàn)化合物(低水平對(duì)照(low control))時(shí)進(jìn)行所述測(cè)定法以及用高濃 度的試驗(yàn)化合物(高水平對(duì)照(high control))進(jìn)行所述測(cè)定法。其它類型的對(duì)照可包括將通過本發(fā)明的測(cè)定法鑒定的化合物作為目標(biāo)鈉/鈣交 換體的激動(dòng)劑或拮抗劑，和用現(xiàn)有技術(shù)的方法測(cè)試這些化合物以證實(shí)這些化合物在所述現(xiàn) 有技術(shù)方法測(cè)試中同樣也是激動(dòng)劑或拮抗劑。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，還需要通過比較測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。術(shù)語“激動(dòng)劑”和“拮抗劑”是指通過受體調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體效應(yīng)分子。受體效 應(yīng)分子能夠與受體結(jié)合，但不一定在天然配體的結(jié)合部位。受體效應(yīng)子當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)可調(diào) 節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，即可以替代配體，或者可以在天然配體存在下，通過天然配體提高或抑制信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)來改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如“拮抗劑”是阻斷或降低受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的分子，例如，它們 可以競爭性、非競爭性和/或變構(gòu)性地抑制來自受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而“激動(dòng)劑”則增強(qiáng)、誘導(dǎo) 或提高受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。術(shù)語“與鈉/鈣交換體表達(dá)發(fā)生改變有關(guān)的疾病”是指擴(kuò)張型心肌病、冠心病、心
律失常、心力衰竭等。為方便起見，有色物質(zhì)和測(cè)定法的其它組分可以試劑盒提供，其中有色物質(zhì)可作 為可復(fù)溶粉末存在，或者可作為冰浴中緩沖溶液的冷卻溶液存在。試劑盒還可包括緩沖液、 激活劑、抑制劑、試驗(yàn)化合物、表達(dá)(expriming)鈉/鈣交換體的細(xì)胞等。細(xì)胞可作為凍干 細(xì)胞存在。所述組件試劑盒可以用作診斷試劑盒，用于診斷擴(kuò)張型心肌病、冠心病、心律失
常、心力衰竭等。下列附圖
和實(shí)施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明，并披露了基于熒光的細(xì)胞鈉/鈣交換 體測(cè)定法的典型結(jié)果，但不限制保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1.測(cè)定步驟試驗(yàn)試劑下列化學(xué)試劑組成用作測(cè)定法的試劑
權(quán)利要求
一種用于測(cè)定鈉/鈣交換體活性的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括e)提供表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞；f)提供用于測(cè)定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；g)使細(xì)胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和h)將鈣介導(dǎo)的來自所述有色物質(zhì)發(fā)光信號(hào)的變化與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行比較。
2.權(quán)利要求1的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3；或 下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
3.權(quán)利要求1的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
4.權(quán)利要求1-3的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來源于大鼠、 小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
5.權(quán)利要求1-4的測(cè)定法，其中所述細(xì)胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1-5的測(cè)定法，其中將作為能夠進(jìn)入細(xì)胞并能夠水解成染料的染料前體的 所述有色物質(zhì)加入細(xì)胞中，藉此所述染料與鈣在所述細(xì)胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號(hào)。
7.權(quán)利要求1-6的測(cè)定法，其中所述發(fā)光信號(hào)是熒光，所述監(jiān)測(cè)步驟c)采用FLira裝置。
8.權(quán)利要求6的測(cè)定法，其中所述染料前體是乙酰氧基甲基酯衍生物。
9.權(quán)利要求6的測(cè)定法，其中所述染料是鈣敏感熒光染料fluo-4。
10.權(quán)利要求1-9的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素。
11.權(quán)利要求1-10的測(cè)定法在檢驗(yàn)化合物作為鈉/鈣交換體的激動(dòng)劑或拮抗劑的活性 中的用途。
12.權(quán)利要求1-10的測(cè)定法在診斷與鈉/鈣交換體表達(dá)發(fā)生改變有關(guān)的疾病中的用途。
13.一種用于測(cè)定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測(cè)定法，所述測(cè)定法 包括a)提供表達(dá)鈉/鈣交換體的細(xì)胞；b)提供用于測(cè)定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細(xì)胞與化合物接觸，其中所述細(xì)胞在用所述化合物處理前已經(jīng)過鈉/鈣交換體激 活劑處理；和d)將鈣介導(dǎo)的來自所述有色物質(zhì)發(fā)光信號(hào)的變化與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行 比較。
14.權(quán)利要求13的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3； 或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
15.權(quán)利要求13的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
16.權(quán)利要求13和15的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來源于 大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
17.權(quán)利要求13-16的測(cè)定法，其中所述細(xì)胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細(xì)胞。
18.權(quán)利要求13-17的測(cè)定法，其中將作為能夠進(jìn)入細(xì)胞并能夠水解成染料的染料前 體的所述有色物質(zhì)加入細(xì)胞中，藉此染料與鈣在所述細(xì)胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號(hào)。
19.權(quán)利要求13-18的測(cè)定法，其中所述發(fā)光信號(hào)是熒光，所述監(jiān)測(cè)步驟c)采用FLira裝置。
20.權(quán)利要求18的測(cè)定法，其中所述染料前體是乙酰氧基甲基酯衍生物。
21.權(quán)利要求18的測(cè)定法，其中所述染料是鈣敏感熒光染料fluo-4。
22.權(quán)利要求13-21的測(cè)定法，其中所述化合物是鈉/鈣交換體拮抗劑。
23.權(quán)利要求13-22的測(cè)定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素。
24.一種組件試劑盒，所述組件試劑盒包括a)表達(dá)(expriming)鈉/鈣交換體的凍干細(xì)胞；b)有色物質(zhì)；c)化合物緩沖液；和d)有色物質(zhì)緩沖液。
25.權(quán)利要求24的組件試劑盒，其中所述有色物質(zhì)是鈣敏感熒光染料fluo-4。
26.權(quán)利要求24和25的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、 NCX2、NCX3 ；或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
27.權(quán)利要求24-26的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來源 于大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
28.權(quán)利要求24-27的組件試劑盒在檢驗(yàn)化合物作為鈉/鈣交換體的激動(dòng)劑或拮抗劑 的活性中的用途。
29.權(quán)利要求24-27的組件試劑盒在診斷與鈉/鈣交換體表達(dá)發(fā)生改變有關(guān)的疾病中 的用途。
全文摘要
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)新興的靶標(biāo)家族，具有巨大的潛力，可提供科學(xué)和經(jīng)濟(jì)機(jī)會(huì)。鈉/鈣交換體是從不同細(xì)胞中去除Ca2+的重要機(jī)制。在心臟中，它排除通過Ca2+通道進(jìn)入的Ca2+引起收縮，同時(shí)Na+進(jìn)入心臟細(xì)胞。鑒定出調(diào)節(jié)鈉/鈣交換體活性的化合物是相當(dāng)有價(jià)值的。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)NCX和NCKX“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測(cè)定法。本發(fā)明還涉及包含表達(dá)(expriming)鈉/鈣交換體的細(xì)胞的組件試劑盒，以及組件試劑盒在檢驗(yàn)化合物作為鈉/鈣交換體的激動(dòng)劑或拮抗劑的活性中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101978271SQ200980110622
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者H·福勒特, M·胡格, S·蓋貝爾, T·利歇爾 申請(qǐng)人:賽諾菲-安萬特