專(zhuān)利名稱：一種微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞活性的檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種通過(guò)能荷計(jì)算表征微囊化細(xì)胞 活性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
微囊化細(xì)胞培養(yǎng)作為一種大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，因其特殊微囊環(huán)境能使細(xì)胞呈現(xiàn) 三維立體生長(zhǎng)而在單克隆抗體生產(chǎn)、細(xì)胞移植及細(xì)胞擴(kuò)增等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。培養(yǎng)過(guò)程中微囊化細(xì)胞活性直接影響下游產(chǎn)率和應(yīng)用效果。目前采用噻唑藍(lán) (MTT)法對(duì)微囊化細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。該方法是利用胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶將外源 性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，再用二甲基亞砜 (DMSO)溶解結(jié)晶，測(cè)定溶液光吸收值作為細(xì)胞活性的指標(biāo)。MTT法作為一種基于低細(xì)胞密 度、單層培養(yǎng)體系建立的檢測(cè)方法，雖然在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用，但未考慮微囊特殊環(huán) 境中，細(xì)胞三維生長(zhǎng)模式對(duì)MTT進(jìn)入胞內(nèi)和甲瓚產(chǎn)物充分溶出造成障礙，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確 性產(chǎn)生影響。腺苷酸作為細(xì)胞直接能量物質(zhì)，和細(xì)胞生存代謝狀態(tài)緊密相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)腺 苷酸種類(lèi)及含量的變化，可達(dá)到對(duì)微囊化細(xì)胞活性檢測(cè)的目的。腺苷酸常見(jiàn)提取方法為酸抽提，即在待測(cè)物中加入酸性物質(zhì)沉淀蛋白后，通過(guò)反 復(fù)離心獲取上清中腺苷酸，再用堿中和進(jìn)行下游檢測(cè)。但該抽提方法不適用于特殊的微囊 化細(xì)胞的培養(yǎng)體系，原因如下1、抽提過(guò)程PH變化影響腺苷酸穩(wěn)定性，造成部分產(chǎn)物分解 而使檢測(cè)結(jié)果低于實(shí)際值；2、微囊材料和酸的相互作用，降低提取效率。針對(duì)上述問(wèn)題，本專(zhuān)利設(shè)計(jì)了一套適用于微膠囊培養(yǎng)體系的腺苷酸抽提方案，發(fā) 明了以胞內(nèi)腺苷酸種類(lèi)數(shù)量變化及能荷變化表征微囊內(nèi)細(xì)胞活性的方法，達(dá)到對(duì)微囊化細(xì) 胞活性檢測(cè)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本專(zhuān)利設(shè)計(jì)了一套適用于微膠囊培養(yǎng)體系的腺苷酸抽提方案，發(fā)明了以胞內(nèi)腺苷 酸種類(lèi)數(shù)量變化及能荷變化表征微囊內(nèi)細(xì)胞活性的方法，達(dá)到對(duì)微囊化細(xì)胞活性檢測(cè)的目 的。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為將待分析的微囊化細(xì)胞樣品機(jī)械破囊處理后，加入預(yù)熱的裂解液中孵育裂解蛋白 后，上清液采用高效液相色譜法分離定量腺苷酸，計(jì)算能荷，以腺苷酸種類(lèi)數(shù)量變化以及能 荷變化作為評(píng)價(jià)微囊化細(xì)胞活性的指標(biāo)。具體為1)樣品制備A 裂解液45-55mM HEPES(PH7. 0-7.幻，10_80mAU/ml 蛋白酶 k(提取 DNA 用的商 品化蛋白酶)，50-80°C水浴預(yù)熱。B:收集微囊化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，濾除培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗至洗液無(wú)色后濾干液體。采用機(jī)械破囊法，將樣品轉(zhuǎn)移至注射器中，反復(fù)抽吸研磨破囊。顯微鏡下見(jiàn) 微囊膜全部破損后，加入預(yù)熱裂解液，30-80°C水浴孵育15-45分鐘，5分鐘間隔震蕩，再將 反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至30-80°C水浴繼續(xù)反應(yīng)15-45分鐘，過(guò)濾收集上清液；2)腺苷酸分離定量采用高效液相色譜法對(duì)提取樣品中腺苷酸進(jìn)行分離含量。測(cè)定條件為紫外檢測(cè) 器，波長(zhǎng) ^Onm，C18 反相柱，流動(dòng)相為 PH = 7. 0-7. 5、50_200mM 的 K2P04，3_10mM 的 TBABr， 流速0. 5-1. Oml/min。分離定量ATP、ADP、AMP，計(jì)算單位細(xì)胞產(chǎn)物含量。按照能荷= ([ATP] +0. 5 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP])計(jì)算細(xì)胞能荷。其中，能荷< 0. 5表明細(xì)胞已經(jīng)走向凋亡；能荷> 0. 5表明細(xì)胞存活，且數(shù)值越高 細(xì)胞活性越好。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)由于本發(fā)明所檢測(cè)的是全細(xì)胞裂解液中腺 苷酸的含量，且利用高效液相色譜進(jìn)行分離定量，可避免由于微囊材料以及不同細(xì)胞生長(zhǎng) 方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，適用于多種材料制備的微囊，包括海藻酸鈉、殼聚糖、明膠、聚乳酸 等；檢測(cè)過(guò)程不添加任何有機(jī)試劑，具有測(cè)定方法穩(wěn)定、測(cè)定結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明適用 于貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞以及微生物細(xì)胞。測(cè)定結(jié)果能正確反映細(xì)胞 的活性，對(duì)微囊化細(xì)胞的應(yīng)用研究有指導(dǎo)意義。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1不同培養(yǎng)時(shí)間海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊 化細(xì)胞能荷變化曲線，可見(jiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，微囊中細(xì)胞能荷值逐漸降低，能荷低于0.5 時(shí)，預(yù)示細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。圖2為本發(fā)明中抽提方法(NEW)和酸法抽提(PCA)的比較，可見(jiàn)本發(fā)明樣品損失 小，抽提效率更高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種通過(guò)能荷表征微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)方法1)樣品制備A 裂解液50mM HEPES, (PH7. 4)，50mAU/ml 蛋白酶 k，50°C水浴預(yù)熱。B 收集APA微囊化培養(yǎng)!fepg2細(xì)胞，濾除培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗至洗液無(wú)色后濾干 液體。Iml注射器研磨抽打破囊。顯微鏡下見(jiàn)微囊膜全部破損后，加入預(yù)熱裂解液，50°C水 浴孵育30分鐘，5分鐘間隔震蕩。將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至80°C水浴繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，過(guò)濾收集 上清；2)腺苷酸分離定量采用高效液相色譜法對(duì)提取樣品中腺苷酸進(jìn)行分離含量。測(cè)定條件為紫外檢測(cè) 器，波長(zhǎng) 260nm, C18 反相柱，流動(dòng)相為 PH = 7. OUOOmm 的 K2P04, 5mm 的 TBABr,流速 0. 8ml/ min。計(jì)算單位細(xì)胞量各種腺苷酸含量分別是=ATP為13. 88士2. 05nmol/106celU ADP為 5. 91 士 1. 13nmol/106cell、AMP 為 1. 12士0. 36nmol/106cel、能荷為 0. 8士0. 0035。在微囊化細(xì)胞培養(yǎng)早期，由于細(xì)胞增殖旺盛，代謝活躍，產(chǎn)生大量ATP供應(yīng)細(xì)胞合成；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞代謝緩慢，能量供給降低，胞內(nèi)AMP增高，能荷降低，細(xì)胞走向 凋亡。采用本方法能準(zhǔn)確定量不同培養(yǎng)時(shí)期腺苷酸種類(lèi)數(shù)量變化以及能荷變化(見(jiàn)附圖 1)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)。實(shí)施例2一種通過(guò)能荷表征微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)方法1)樣品制備A 裂解液50mM HEPES, (PH7. 4)，50mAU/ml 蛋白酶 k，50°C水浴預(yù)熱。B 收集單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(PELA)微囊化培養(yǎng)微生物細(xì)胞S. cerevisiae, 濾除培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗至洗液無(wú)色后濾干液體加入預(yù)熱裂解液，50°C水浴孵育30分鐘， 5分鐘間隔震蕩。將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至80°C水浴繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，過(guò)濾收集上清；2)腺苷酸分離定量采用高效液相色譜法對(duì)提取樣品中腺苷酸進(jìn)行分離含量。測(cè)定條件為紫外檢測(cè) 器，波長(zhǎng) 260nm, C18 反相柱，流動(dòng)相為 PH = 7. OUOOmm 的 K2P04, 5mm 的 TBABr,流速 0. 8ml/ min0計(jì)算單位細(xì)胞量各種腺苷酸含量。比較例1MTT法檢測(cè)微囊化細(xì)胞活性與實(shí)施例相同的微囊化!fepg2細(xì)胞樣品，接種于M孔板，每孔anl，每孔加入5mg/ ml的MTT溶液100μ1，241ι取樣，用aiil DMSO溶解結(jié)晶，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。以570nm為 檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參比波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。三組平行樣測(cè)定結(jié)果分別為1. 61,1. 58,1. 83，其標(biāo)準(zhǔn)偏差0. 111與實(shí)施例1的 比較結(jié)果見(jiàn)表1。表 權(quán)利要求
1.一種微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)方法，其特征在于將待分析的微囊化細(xì)胞樣品機(jī)械破 囊處理后，加入預(yù)熱的裂解液中孵育裂解蛋白后，上清液采用高效液相色譜法分離定量腺 苷酸，計(jì)算能荷，以腺苷酸種類(lèi)數(shù)量變化以及能荷變化作為評(píng)價(jià)微囊化細(xì)胞活性的指標(biāo)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于微囊化樣品采用的機(jī)械破囊方法是將樣 品轉(zhuǎn)移至注射器中，反復(fù)抽吸研磨破囊。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入的裂解液組成是PH7.0-7.5，45-55mM HEPES，10-80mAU/ml 蛋白酶 k。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于孵育裂解蛋白的條件是30-80°C水浴孵育 15-45分鐘，5分鐘間隔震蕩，再將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至30-80°C水浴繼續(xù)反應(yīng)15-45分鐘，過(guò)濾 收集上清液。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用高效液相色譜法對(duì)提取樣品中腺苷 酸進(jìn)行分離，并對(duì)其中ATP、ADP、AMP含量定量，測(cè)定條件為紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)260nm，C18反 相柱，流動(dòng)相為 PH = 7. 0-7. 5、50-200mM 的 K2P04，3_10mM 的 TBABr，流速 0. 5-1. Oml/min。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于能荷的計(jì)算方法為 能荷=([ATP] +0. 5 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP])能荷<0.5表明細(xì)胞已經(jīng)走向凋亡；能荷>0.5表明細(xì)胞存活，且數(shù)值越高細(xì)胞活性越好。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包埋在微囊內(nèi)的細(xì)胞可以是貼壁培養(yǎng)或 懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞以及微生物細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備微膠囊的材料包括海藻酸鈉、聚乳 酸、明膠或殼聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微囊化細(xì)胞活性的檢測(cè)方法。檢測(cè)步驟包括樣品提取、腺苷酸分離定量，通過(guò)能荷計(jì)算表征微囊內(nèi)細(xì)胞活性。本發(fā)明針對(duì)微膠囊這樣的特殊體系設(shè)計(jì)了一套用于微囊內(nèi)細(xì)胞腺苷酸定量的操作方案，能準(zhǔn)確定量微囊化細(xì)胞腺苷酸含量，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的提取過(guò)程樣品損失大，測(cè)試不穩(wěn)定，重復(fù)性差等缺陷。測(cè)定結(jié)果可作為微囊化細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102053123SQ200910219620
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者于煒婷, 王為, 肖靜, 馬小軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所